CN1756764A - 新型蛋白质及其用途 - Google Patents
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Abstract
一种化合物、反义多核苷酸、抗体等作为癌症等的预防·治疗剂、细胞凋亡促进剂是有用的。其中，所述化合物抑制含有与序列号：1、序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列的蛋白质的表达或该蛋白质的基因表达等；所述反义多核苷酸含有与编码上述蛋白质或其部分肽的DNA的碱基序列互补或基本上互补的碱基序列或其一部分；所述抗体是上述蛋白质或其部分肽的抗体。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型蛋白质、编码该蛋白质的多核苷酸、其制备方法、癌症预防·治疗剂或诊断药物、细胞凋亡促进剂、癌症预防·治疗剂或细胞凋亡促进剂的筛选等。
背景技术
近年来由于微阵列(microarray)·寡核苷酸阵列(oligonucleotide array)技术的进步，可以对基因表达进行详尽的分析，预计即使是癌症也可以通过微阵列图谱数据(microarray profiling data)评价其病理学状况，实际中已经报告在白血病中可以通过基因表达图谱对白血病进行分类。另外，认为通过弄清各种癌症组织的基因表达图谱并累积其分类，可能可以预测对于特定癌症治疗方法的反应性，或为特定癌症发现新型药物开发的目标蛋白质。具体地，当发现某种癌症是某种蛋白质表达亢进时，可以对新诊断为抗原阳性的患者通过下述方法转染抗肿瘤活性，即，(i)降低其表达量；(ii)抑制功能；(iii)使宿主对该蛋白质的免疫反应显性化。与此同时，对诊断为抗原阴性的患者可以迅速改成其它疗法，从而消除给患者带来不必要的负担的担心。以上的基因图谱解析有望给癌症的分子诊断和分子靶向治疗药物的开发作出巨大的贡献。
Semaphorin家族是由分泌型分子和膜结合型分子两种构成的一大蛋白质家族，已经报告脊椎动物中至少有19种基因、无脊椎动物中有3种基因(Cell，
97，551-552，1999)。
已知Semaphorin家族参与神经轴突诱导或突触形成等为代表的广范围的神经发生过程。近年来逐渐明确了Semaphorin家族参与免疫系统(Trends inImmunol.，
22，670-676，2001)和器官发生·血管新生。属于Semaphorin家族且来源于人的Semaphorin 3B和Semaphorin 3F已经作为癌症抑制基因被报道(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，
98，13954-13959，2001，Cancer Res.，
62，542-546，2002，Cancer Res.，
62，2637-2643，2002)。有报告指出Semaphorin 3C在人肺癌组织中表达亢进(J.Surg.Oncol.，
72，18-23，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，14713-14718，1997)。有报告指出Semaphorin 3E在转移性细胞中表达(Cancer Res.，
58，1238-1244，1998)。
与Semaphorin 4D在氨基酸水平上具有41％同源性的Semaphorin 4B(以下简称为“SEMA4B”)已经作为由基因组序列推定的基因登记在基因文库中(GenBankAccession No.XM_044533)。SEMA4B作为在低氧条件下表达增加的基因之一被报道(WO 02/46465)。也有报告指出基于基因芯片分析，包括SEMA4B等的数百种碱基序列可以用于探索诊断或治疗肺癌的化合物等(WO 02/86443)。有报告指出与SEMA4B在氨基酸水平上具有93％同源性的NOV7在癌症中表达亢进(WO 02/06329)。
亟待开发以在癌细胞中特异性表达的分子为靶，诱导抑制癌细胞增殖的安全药物。
发明内容
为了解决上述课题，本发明人进行了悉心研究，结果发现了一种在肺癌组织中表达显著增加的新基因，并发现该基因的反义寡核苷酸促进癌细胞的细胞凋亡。在上述发现的基础上进一步进行反复研究，从而完成本发明。
即，本发明提供：
(1)蛋白质或其盐，其含有与序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，
(2)蛋白质或其盐，其包含序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列，
(3)上述(1)中所述蛋白质的部分肽或其盐，
(4)多核苷酸，其含有编码上述(1)中所述蛋白质或其部分肽的多核苷酸，
(5)上述(4)中所述的多核苷酸，其为DNA，
(6)上述(5)所述多核苷酸，其含有序列号：5、序列号：8或序列号：11所示的碱基序列，
(7)多核苷酸，其包含序列号：5、序列号：8或序列号：11所示的碱基序列，
(8)重组载体，其含有上述(4)中所述多核苷酸，
(9)被上述(8)中所述重组载体转化了的转化体，
(10)上述(1)中所述蛋白质或其部分肽或其盐的制备方法，其特征在于，培养上述(9)中所述转化体，从而生成并蓄积上述(1)中所述蛋白质或其部分肽，
(11)含有上述(1)中所述蛋白质或其部分肽或其盐的药物，
(12)含有上述(4)中所述多核苷酸的药物，
(13)含有上述(4)中所述多核苷酸的诊断药物，
(14)上述(1)中所述蛋白质或其部分肽或其盐的抗体，
(15)含有上述(14)中所述抗体的药物，
(16)含有上述(14)中所述抗体的诊断药物，
(17)多核苷酸，其含有与上述(4)中所述多核苷酸互补或者基本上互补的碱基序列或其一部分，
(18)含有上述(17)中所述多核苷酸的药物，
(19)上述(1)中所述蛋白质的定量方法，其特征在于，使用上述(14)中所述的抗体，
(20)与上述(1)中所述蛋白质或其功能相关的疾病的诊断方法，其特征在于，使用上述(19)中所述的定量方法，
(21)抑制上述(1)中所述蛋白质表达的化合物或其盐的筛选方法，其特征在于，使用上述(1)中所述蛋白质或其部分肽或其盐，
(22)用于筛选抑制上述(1)中所述蛋白质表达的化合物或其盐的试剂盒，其含有上述(1)中所述的蛋白质或其部分肽或其盐，
(22a)抑制上述(1)中所述蛋白质表达的化合物或其盐，其通过使用上述
(21)所述的筛选方法或上述(22)所述的筛选用试剂盒而得到，
(22b)含有上述(22a)所述的化合物或其盐而成的药物，
(23)抑制上述(1)中所述蛋白质基因表达的化合物或其盐的筛选方法，其特征在于，使用上述(4)中所述的多核苷酸，
(24)用于筛选抑制上述(1)中所述蛋白质基因表达的化合物或其盐的试剂盒，其含有上述(4)中所述的多核苷酸，
(24a)抑制上述(1)中所述蛋白质基因表达的化合物或其盐，其通过使用上述(23)中所述的筛选方法或上述(24)中所述的筛选用试剂盒得到，
(24b)含有上述(24a)所述化合物或其盐的药物，
(25)上述(11)、(12)、(15)或(18)中所述的药物，其为癌症预防·治疗剂，
(25a)上述(25)中所述的药物，其中癌症为肺癌、卵巢癌或胰腺癌，
(25b)上述(22b)或(24b)所述的药物，其为癌症预防·治疗剂，
(26)上述(11)、(12)、(15)或(18)中所述药物，其为(癌细胞的)细胞凋亡促进剂，
(26a)上述(22b)或(24b)所述的药物，其为(癌细胞的)细胞凋亡促进剂，
(26b)上述(11)、(12)、(15)、(18)、(22b)或(24b)中所述药物，其为癌细胞的增殖抑制促进剂，
(27)上述(13)或(16)中所述诊断药物，其为癌症的诊断药物，
(28)细胞凋亡促进剂，其含有抑制上述(1)中所述的蛋白质或其部分肽表达或该蛋白质的基因表达的物质，
(29)细胞凋亡促进剂，其含有下述蛋白质或其部分肽或其盐的抗体，所述蛋白质包含与序列号：1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，
(30)癌症预防·治疗剂，其含有下述蛋白质或其部分肽或其盐的抗体，所述蛋白质包含与序列号：1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，
(30a)上述(30)中所述的癌症预防·治疗剂，其中癌症是肺癌、卵巢癌或胰腺癌，
(30b)癌细胞的增殖抑制促进剂，其含有下述蛋白质或其部分肽或其盐的抗体，所述蛋白质包含与序列号：1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，
(31)多核苷酸，其含有与编码下述蛋白质或其部分肽的多核苷酸的碱基序列互补或基本上互补的碱基序列或其一部分，所述蛋白质包含与序列号：1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，
(32)含有上述(31)中所述多核苷酸的药物，
(33)上述(32)中所述药物，其为细胞凋亡促进剂，
(33a)上述(32)中所述药物，其为癌细胞的增殖抑制促进剂，
(34)细胞凋亡促进剂的筛选方法，其特征在于，使用编码下述蛋白质或其部分肽的多核苷酸，所述蛋白质包含与序列号：1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，
(35)用于筛选细胞凋亡促进剂的试剂盒，其特征在于，含有编码下述蛋白质或其部分肽的多核苷酸，所述蛋白质包含与序列号：1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，
(35a)用上述(34)中所述的筛选方法或上述(35)中所述的筛选用试剂盒得到的细胞凋亡促进剂，
(36)细胞凋亡促进剂，其含有抑制下述蛋白质或其部分肽表达或该蛋白质的基因表达的物质，所述蛋白质包含与序列号：1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，
(36a)癌细胞的增殖抑制促进剂，其含有抑制下述蛋白质或其部分肽的基因表达的物质，所述蛋白质包含与序列号：1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，
(37)癌症预防·治疗方法，其特征在于，对哺乳动物施用有效量的(i)抑制下述蛋白质或其部分肽或其盐表达的物质，所述蛋白质包含与序列号：1、序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；(ii)抑制上述蛋白质或其部分肽的基因表达的物质；或(iii)上述蛋白质或其部分肽或其盐的抗体，
(38)癌细胞的细胞凋亡促进方法，其特征在于，对哺乳动物施用有效量的(i)抑制下述蛋白质或其部分肽或其盐表达的物质，所述蛋白质包含与序列号：1、序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；(ii)抑制上述蛋白质或其部分肽的基因表达的物质；或(iii)上述蛋白质或其部分肽或其盐的抗体，
(39)癌症预防·治疗方法，其特征在于，抑制下述蛋白质或其部分肽或其盐表达，所述蛋白质包含与序列号：1、序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；或抑制上述蛋白质或其部分肽的基因表达，
(40)癌细胞的细胞凋亡促进方法，其特征在于，抑制下述蛋白质或其部分肽或其盐表达，所述蛋白质包含与序列号：1、序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；或抑制上述蛋白质或其部分肽的基因表达，
(41)下述物质在制备癌症预防·治疗剂中的用途，所述物质为(i)抑制下述蛋白质或其部分肽或其盐表达的物质，所述蛋白质包含与序列号：1、序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；(ii)抑制上述蛋白质或其部分肽的基因表达的物质；或(iii)上述蛋白质或其部分肽或其盐的抗体，
(42)下述物质在制备癌细胞细胞凋亡促进剂中的用途，所述物质为(i)抑制下述蛋白质或其部分肽或其盐表达的物质，所述蛋白质包含与序列号：1、序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；(ii)抑制上述蛋白质或其部分肽的基因表达的物质；或(iii)上述蛋白质或其部分肽或其盐的抗体。
具体实施方式
包含与序列号：1、序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列的蛋白质(以下有时也称为“本发明的蛋白质”或“本发明使用的蛋白质”)可以是来源于人或温血动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、鸡、兔、猪、羊、牛和猴等)的细胞(例如肝细胞、脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞、骨髓细胞、肾小球膜细胞、郎格罕氏细胞(Langerhans’cell)、表皮细胞、上皮细胞、杯状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性白细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性细胞、单核细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞或间质细胞，或这些细胞的前体细胞、干细胞或癌细胞等)，或这些细胞存在的所有组织，例如脑、脑的各部位(例如嗅球、扁桃核、大脑基底核、海马、丘脑、下丘脑、大脑皮质、延髓、小脑)、脊髓、垂体、胃、胰腺、肾脏、肝脏、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、消化道(例如大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾脏、颌下腺、外周血液、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、骨骼肌等的蛋白质，也可以是合成蛋白质。
作为与序列号：1所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，可以列举与序列号：1所示的氨基酸序列具有95％或更高、优选约98％或更高、更优选约99％或更高同源性的氨基酸序列等。
作为含有与序列号：1所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，例如优选含有与上述序列号：1所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列、并且具有与含有序列号：1所示的氨基酸序列的蛋白质基本上相同性质的活性的蛋白质。
作为与序列号：4所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，可以列举与序列号：4所示的氨基酸序列具有99.9％或更高同源性的氨基酸序列等。
作为含有与序列号：4所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，例如优选含有与上述序列号：4所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列、并且具有与含有序列号：4所示的氨基酸序列的蛋白质基本上相同性质的活性的蛋白质。
作为与序列号：7所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，可以列举与序列号：7所示的氨基酸序列具有99.9％或更高同源性的氨基酸序列等。
作为含有与序列号：7所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，例如优选含有与上述序列号：7所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列、并且具有与含有序列号：7所示的氨基酸序列的蛋白质基本上相同性质的活性的蛋白质。
作为与序列号：10所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，可以列举与序列号：10所示的氨基酸序列具有99.9％或更高同源性的氨基酸序列等。
作为含有与序列号：10所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，例如优选含有与上述序列号：10所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列、并且具有与含有序列号：10所示的氨基酸序列的蛋白质基本上相同性质的活性的蛋白质。
氨基酸序列的同源性可以用同源性计算NCBI BLAST(National Centerfor Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)算法计算，在以下条件(期待值＝10；允许缺口；矩阵＝BLOSUM 62；滤波(filtering)＝OFF)下进行计算。
“基本上相同性质”是指这些性质在性质上(例如生理学上或药理学上)是相同的。因此，优选本发明蛋白质的活性相等(例如约0.01～100倍，优选约0.1～10倍，更优选约0.5～2倍)。上述活性的程度，例如蛋白质的分子量等量的要素，可以不同。
另外，本发明使用的蛋白质还包括所谓的突变蛋白质，诸如以下蛋白质(1)包含：(i)在序列号：1所示的氨基酸序列中缺失1个或2个或2个以上(例如1～50个左右，优选1～30个左右，更优选1～10个左右，进一步优选数个(1～5个))氨基酸的氨基酸序列；(ii)在序列号：1所示的氨基酸序列中添加1个或2个或2个以上(例如1～50个左右，优选1～30个左右，更优选1～10个左右，进一步优选数个(1～5个))氨基酸的氨基酸序列；(iii)在序列号：1所示的氨基酸序列中插入1个或2个或2个以上(例如1～50个左右，优选1～30个左右，更优选1～10个左右，进一步优选数个(1～5个))氨基酸的氨基酸序列；(iv)序列号：1所示的氨基酸序列中1个或2个或2个以上(例如1～50个左右，优选1～30个左右，更优选1～10个左右，进一步优选数个(1～5个)、)氨基酸被其它氨基酸取代的氨基酸序列；或(v)将这些组合得到的氨基酸序列的蛋白质等所谓的突变蛋白质；(2)所谓的突变蛋白质，诸如以下蛋白质：(i)在序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列中缺失1个或2个氨基酸的氨基酸序列；(ii)在序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列中添加1个或2个或2个以上(例如1～50个左右，优选1～30个左右，更优选1～10个左右，进一步优选数个(1～5个))氨基酸的氨基酸序列；(iii)在序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列中插入1个或2个氨基酸的氨基酸序列；(iv)序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列中1个或2个氨基酸被其它氨基酸取代的氨基酸序列；或(v)这些氨基酸序列的组合等。
如上所述，氨基酸序列被插入、缺失或取代时，对插入、缺失或取代的位置没有特别限定。
本说明书中的蛋白质按照肽标记的惯例左端为N末端(氨基末端)，右端为C末端(羧基末端)。以包含序列号：1所示氨基酸序列的蛋白质为首的本发明所用蛋白质的C末端可以是羧基(-COOH)、羧酸根基(-COO-)、酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)中的任意一种。
此处所述酯中的R可以使用例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基等C1～6烷基，例如环戊基、环己基等C3-8环烷基，例如苯基、α-萘基等C6-12芳基，例如苄基、苯乙基等苯基-C1～2烷基或α-萘甲基等α-萘基-C1～2烷基等C7-14芳烷基，三甲基乙酰氧基甲基等。
本发明所用的蛋白质除了C末端以外还具有羧基(或羧酸根基)时，羧基被酰胺化或酯化得到的物质也包括在本发明所用的蛋白质中。此时，酯可以使用例如上述C末端的酯等。
进一步地，本发明所用的蛋白质还包括N末端氨基酸残基(例如蛋氨酸残基)中的氨基被保护基团(例如甲酰基、乙酰基等C1～6烷酰基等的C1-6酰基等)保护得到的物质、在机体内被切断生成的N末端的谷氨酸残基被焦谷氨酸化了的物质、分子内的氨基酸侧链上的取代基(例如-OH、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)被适当的保护基团(例如甲酰基、乙酰基等等C1-6烷酰基等的C1-6酰基等)保护了的物质、或结合了糖链的所谓糖蛋白等复合蛋白质等。
本发明所用蛋白质的具体例子可以列举例如含有序列号：1所示的氨基酸序列的蛋白质，含有序列号：4所示的氨基酸序列的蛋白质，含有序列号：7所示的氨基酸序列的蛋白质，含有序列号：10所示的氨基酸序列的蛋白质等。
本发明所用蛋白质的部分肽是上述本发明所用蛋白质的部分肽，优选只要是具有与上述本发明所用蛋白质相同的性质的任何物质均可。
例如，可以使用包含构成本发明所用蛋白质的氨基酸序列中的至少20个或更多、优选50个或更多、更优选70个或更多、进一步优选100个或更多、最优选200个或更多的氨基酸序列的肽。
另外，本发明所用的部分肽也可以在其氨基酸序列中缺失1个或2个或2个以上(优选1～20个左右，更优选1～10个左右，进一步优选数个(1～5个))氨基酸，或在其氨基酸序列中添加1个或2个或2个以上(优选1～20个左右，更优选1～10个左右，进一步优选数个(1～5个))氨基酸，或在其氨基酸序列中插入1个或2个或2个以上(优选1～20个左右，更优选1～10个左右，进一步优选数个(1～5个))氨基酸，或用其它氨基酸取代其氨基酸序列中的1个或2个或2个以上(优选1～20个左右，更优选1～1O个左右，进一步优选数个(1～5个))氨基酸。
本发明所用部分肽的C末端可以是羧基(-COOH)、羧酸根基(-COO-)、酰胺(CONH2)或酯(-COOR)中的任意一种。
并且，与上述本发明所用的蛋白质同样，本发明所用的部分肽还包括除了C末端以外还具有羧基(或羧酸根基)的物质、N末端氨基酸残基(例如蛋氨酸残基)中的氨基被保护基团保护了的物质、N末端在机体内被切断生成的谷氨酸残基被焦谷氨酸化了的物质、分子内的氨基酸侧链上的取代基被适当的保护基团保护了的物质、或结合了糖链的所谓糖肽等复合肽。
本发明所用的部分肽可以用作用于制备抗体的抗原。
本发明所用蛋白质或部分肽的盐，可以使用与生理学上可接受的酸(例如无机酸、有机酸)或碱(例如碱金属盐)等形成的盐，特别优选生理学上可接受的酸加成盐。这些盐可以使用例如与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，或与有机酸(例如醋酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、枸橼酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。
本发明所用的蛋白质或其部分肽或其盐可以由上述人或温血动物的细胞或组织通过公知的蛋白质纯化方法制备，也可以通过培养包含编码蛋白质的DNA的转化体来制备，还可以按照后述肽合成法制备。
从人或哺乳动物的组织或细胞制备时，可以将人或哺乳动物的组织或细胞匀浆化后，用酸等进行提取，然后通过将反相色谱、离子交换色谱等色谱法组合对提取液进行纯化分离。
合成本发明所用的蛋白质或其部分肽或其盐、或其酰胺物时，可以使用通常市售的蛋白质合成用树脂。作为这种树脂，包括例如氯代甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲胺树脂、氨基甲基树脂、4-苄氧基苄醇树脂、4-甲基二苯甲胺树脂、PAM树脂、4-羟甲基甲基苯基乙酰氨基甲基树脂、聚丙烯酰胺树脂、4-(2’，4’-二甲氧基苯基-羟甲基)苯氧基树脂、4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc氨基乙基)苯氧基树脂等。使用这些树脂，根据目的蛋白质的序列，氨基酸在树脂上按照公知的各种缩合方法进行缩合，其中，所述氨基酸是α-氨基与侧链官能基团被适当保护了的氨基酸。在反应的最后从树脂中切取蛋白质或部分肽，同时除去各种保护基团，进一步在高度稀释的溶液中进行分子内的二硫键形成反应，从而得到目的蛋白质或其部分肽或它们的酰胺物。
对于上述被保护的氨基酸的缩合，可以使用蛋白质合成时使用的各种活化试剂，特别是可以为碳化二亚胺。作为碳化二亚胺，可以使用DCC、N，N’-二异丙基碳化二亚胺、N-乙基-N’-(3-二甲氨基脯氨酰基)碳化二亚胺等。这些试剂导致的活化中，可以将被保护的氨基酸与消旋化抑制添加剂(例如HOBt、HOOBt)一起直接加到树脂中，或者将被保护的氨基酸预先以对称酸酐或HOBt酯或HOOBt酯的形式活化，然后加入到树脂中。
被保护的氨基酸的活化或与树脂的缩合中所用的溶剂可以从已知可以用于蛋白质缩合反应的溶剂中适当选择。例如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺类，二氯甲烷、氯仿等卤代烃类，三氟乙醇等醇类，二甲亚砜等亚砜类，吡啶、二噁烷、四氢呋喃等醚类，乙腈、丙腈等腈类，乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯类或上述溶剂的合适混合物等。反应温度可以在已知可以用于蛋白键形成反应的范围内适当选择，通常在约-20℃～50℃的范围内适当选择。被活化的氨基酸衍生物通常以1.5～4倍过量使用。通过使用水合茚三酮反应进行测定的结果表明，缩合不充分时，不进行保护基团的脱离而反复进行缩合反应，由此可以充分进行缩合。即使反复进行反应也不能充分缩合时，通过使用乙酸酐或乙酰咪唑使未反应的氨基酸乙酰化，由此可以避免对后续反应的影响。
作为原料中的氨基的保护基团，可以使用例如Z、Boc、叔戊氧基羰基、异冰片基氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、Cl-Z、Br-Z、金刚烷氧基羰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚磺酰基(nitrophenylsulphenyl)、二苯基硫膦基(diphenylphosphinothioyl)、Fmoc等。
羧基可以通过烷基酯化(例如甲基、氧基、丙基、丁基、叔丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、2-金刚烷基等直链、支链或环烷基酯化)、芳烷基酯化(例如苄基酯、4-硝基苄基酯、4-甲氧基苄基酯、4-氯苄基酯、二苯甲基酯化等)、苯甲酰甲基酯化、苄氧基羰基酰肼化、叔丁氧羰基酰肼化和三苯甲基酰肼化等进行保护。
丝氨酸的羟基可以通过例如酯化或醚化进行保护。适合用于该酯化的基团可以使用例如乙酰基等低级(C1-6)烷酰基、苄基等芳酰基、苄氧基羰基、乙氧基羰基等由碳酸衍生的基团等。适合用于醚化的基团包括例如苄基、四氢呋喃基和叔丁基等。
酪氨酸酚性羟基的保护基团可以使用例如Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z和叔丁基等。
组氨酸的咪唑部分的保护基团可以使用例如Tos、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基、DNP、苄氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc等。
原料中羰基活化了的氨基酸可以使用例如对应的酸酐、叠氮化物、活化酯[与醇(例如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基苯酚、氰基甲基醇、对硝基苯酚、HONB、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、HOBt)的酯]。原料中活化了氨基的氨基酸可以使用例如对应的磷酸酰胺。
作为除去(脱离)保护基团的方法，可以使用例如在Pd-黑或Pd-碳等催化剂的存在下在氢气流中进行的催化还原，或使用无水氟化氢、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟醋酸或其混合物等进行的酸处理，或用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶和哌嗪等进行的碱处理，或在液氨中用钠进行还原等。上述通过酸处理进行的脱离反应一般可以在约-20℃～40℃的温度进行。在酸处理中，加入茴香醚、苯酚、茴香硫醚、间甲酚、对甲酚、二甲硫醚、1，4-丁二硫醇、1，2-乙二硫醇等阳离子捕捉剂是有效的。另外，用作组氨酸咪唑部分的保护基团的2，4-二硝基苯基通过苯硫酚处理除去，用作色氨酸的吲哚保护基团的甲酰基通过上述在1，2-乙二硫醇、1，4-丁二硫醇等存在下的酸处理进行脱保护，除此之外还可以通过使用稀氢氧化钠溶液、稀氨水等的碱处理除去。
不应参与原料反应的官能团的保护以及保护基团、和该保护基团的消除，参与反应的官能团的活化等可以从公知的基团或公知的方法中适当选择。
作为获得蛋白质或部分肽的酰胺物的其它方法，例如，首先使羧基末端氨基酸的α-羧基酰胺化而进行保护后，在氨基侧将肽(蛋白质)链延长到所需的链长，然后制备仅仅除去所述肽链N末端的α-氨基保护基团的蛋白质或部分肽和仅仅除去C末端羧基保护基团的蛋白质或部分肽，使这些蛋白质或肽在如上述的混合溶剂中进行缩合。缩合反应的详述与上述相同。将缩合得到的保护蛋白质或肽纯化后，通过上述方法除去所有的保护基团，得到所需的粗制蛋白质或肽。使用已知的各种纯化方法纯化该粗制蛋白质或肽，然后将主要级分冻干，由此可以获得所需的蛋白质或肽的酰胺物。
为了获得蛋白质或肽的酯，可以例如使羧基末端氨基酸的α-羧基与所需的醇类缩合制成氨基酸酯，然后与蛋白质或肽的酰胺物同样处理，从而得到所需的蛋白质或肽的酯。
本发明所用的部分肽或其盐可以按照公知的肽合成方法制备，或通过用适当的肽酶切断本发明所用的蛋白质来制备。肽的合成方法可以使用固相合成法和液相合成法中的任何一种。即，使部分肽或氨基酸与残余部分缩合，当产物带有保护基团时除去保护基团，由此可以制备目的肽，其中所述的部分肽或氨基酸可以构成本发明所用部分肽。公知的缩合方法或脱保护基团的方法可以列举以下(i)～(v)中记载的方法：
(i)M.Bodanszky & M.A.Ondetti：Peptide Synthesis，IntersciencePublishers，New York(1966)
(ii)Schroeder & Luebke：The Peptide，Academic Press，New York(1965)
(iii)Nobuo Izumiya，et al.：Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken(Basics andexperiments of peptide synthesis)，published by Maruzen Co.(1975)
(iv)Haruaki Yajima & Shunpei Sakakibara：Seikagaku Jikken Koza(Biochemicai Experiment)1，Tanpakushitsu no Kagaku(Chemistry of Proteins)IV，205(1977)
(v)Haruaki Yajima ed.：Zoku Iyakuhin no Kaihatsu(A sequel toDevelopment of Pharmaceuticals)，Vol.14，Peptide Synthesis，published byHirokawa Shoten
另外，反应后可以通过常规纯化方法，例如溶剂提取、蒸馏、柱色谱、液相色谱和重结晶等的组合纯化分离本发明所用的部分肽。通过上述方法得到的部分肽为游离形式时，可以通过公知方法或其改进方法转化成适当的盐。相反，如果得到的部分肽为盐，则可以通过公知方法或其改进方法转化成游离形式或其它盐。
作为编码本发明所用蛋白质的多核苷酸，可以是任何多核苷酸，只要其包含上述编码本发明所用蛋白质的碱基序列即可。优选多核苷酸是DNA。该DNA可以是基因组DNA、基因组DNA文库、来源于上述细胞或组织的cDNA、来源于上述细胞或组织的cDNA文库、合成DNA中的任意一种。
文库所用的载体可以是噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒等中的任何一种。另外，还可以用由上述细胞或组织制备的总RNA或mRNA级分，直接通过逆转录酶聚合酶链反应(以下简称为“RT-PCR”)扩增DNA。
编码本发明所用蛋白质的DNA可以是例如下述中的任何一个：
(i)含有序列号：2所示的碱基序列的DNA，或含有与序列号：2所示的碱基序列在高度严格条件下杂交的碱基序列、且编码与含有序列号：1所示氨基酸序列的蛋白质具有基本上相同性质的蛋白质的DNA；
(ii)含有序列号：5所示的碱基序列的DNA，或含有与序列号：5所示的碱基序列在高度严格条件下杂交的碱基序列、且编码与含有序列号：4所示氨基酸序列的蛋白质具有基本上相同性质的蛋白质的DNA；
(iii)含有序列号：8所示的碱基序列的DNA，或含有与序列号：8所示的碱基序列在高度严格条件下杂交的碱基序列、且编码与含有序列号：7所示氨基酸序列的蛋白质具有基本上相同性质的蛋白质的DNA；
(iv)含有序列号：11所示的碱基序列的DNA，或含有与序列号：11所示的碱基序列在高度严格条件下杂交的碱基序列、且编码与含有序列号：10所示氨基酸序列的蛋白质具有基本上相同性质的蛋白质的DNA。
作为可以与序列号：2所示的碱基序列在高度严格条件下杂交的DNA，使用例如包含与序列号：2所示的碱基序列具有95％或更高、优选约98％或更高、更优选约99％或更高同源性的碱基序列的DNA等。
作为可以与序列号：5所示的碱基序列在高度严格条件下杂交的DNA，使用例如包含与序列号：5所示的碱基序列具有99.9％或更高同源性的碱基序列的DNA等。
作为可以与序列号：8所示的碱基序列在高度严格条件下杂交的DNA，使用例如包含与序列号：8所示的碱基序列具有99.9％或更高同源性的碱基序列的DNA等。
作为可以与序列号：11所示的碱基序列在高度严格条件下杂交的DNA，使用例如包含与序列号：11所示的碱基序列具有99.9％或更高同源性的碱基序列的DNA等。
杂交可以通过公知的方法或其改进方法进行，例如Molecular Cloning，第2版(J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989)中公开的方法等。另外，使用市售的基因文库时，可以按照随附的使用说明书中记载的方法进行。更优选按照高度严格的条件进行。
高度严格的条件是指例如钠浓度为约19～40mM、更优选约19～20mM，温度为约50～70℃、优选约60～65℃的条件。特别是最优选钠浓度为约19mM、温度为约65℃的条件。
更具体地，使用(i)含有序列号：2所示碱基序列的DNA或含有序列号：3所示碱基序列的DNA等作为编码含有序列号：1所示氨基酸序列的蛋白质的DNA；(ii)含有序列号：5所示碱基序列的DNA或含有序列号：6所示碱基序列的DNA等作为编码含有序列号：4所示氨基酸序列的蛋白质的DNA；(iii)含有序列号：8所示碱基序列的DNA或含有序列号：9所示碱基序列的DNA等作为编码含有序列号：7所示氨基酸序列的蛋白质的DNA；(iv)含有序列号：11所示碱基序列的DNA或含有序列号：12所示碱基序列的DNA等作为编码含有序列号：10所示氨基酸序列的蛋白质的DNA。
编码本发明所用部分肽的多核苷酸(例如DNA)，只要是包含上述编码本发明所用部分肽的碱基序列的多核苷酸即可。另外，还可以是基因组DNA、基因组DNA文库、来源于上述细胞或组织的cDNA、来源于上述细胞或组织的cDNA文库、合成DNA中的任意一种。
作为编码本发明所用部分肽的DNA，使用例如包含含有序列号：2、序列号：5、序列号：8或序列号：11所示碱基序列的DNA的一部分的DNA，或含有与序列号：2、序列号：5、序列号：8或序列号：11所示碱基序列在高度严格条件下杂交的碱基序列、且包含编码与本发明蛋白质具有基本上相同性质活性的蛋白质的DNA的一部分的DNA等。
可以与序列号：2、序列号：5、序列号：8或序列号：11所示碱基序列杂交的DNA定义与上述相同。
杂交方法和高度严格的条件与上述相同。
作为完全编码本发明所用蛋白质、部分肽(以下在说明编码这些的DNA的克隆和表达时，有时将这些简称为本发明的蛋白质)的DNA的克隆方法，可以通过PCR法用包含编码本发明蛋白质的碱基序列的一部分的合成DNA引物进行扩增；或者将插入到适当载体中的DNA通过与标记的DNA片段或合成DNA的杂交来筛选，其中所述标记的DNA片段或合成DNA是编码本发明蛋白质的一部分或整个区域的DNA片段或合成DNA。杂交可以按照例如Molecular Cloning，2nd(J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989)中公开的方法进行。另外，使用市售的基因文库时，可以按照随附的使用说明书记载的方法进行。
DNA碱基序列的变换可以使用PCR、公知试剂盒例如MutanTM-superExpress Km(Takara Shuzo Co.，Ltd.)或MutanTM-K(Takara Shuzo Co.，Ltd.)等按照ODA-LA PCR法、Gapped duplex法和Kunkel法等公知的方法或其改进方法进行。
被克隆了的编码蛋白质的DNA可以根据目的直接使用，或根据需要用限制酶消化或添加连接体(linker)后再使用。该DNA可以在其5′末端侧包含ATG作为翻译起始密码子，也可以在3′末端侧具有TAA、TGA或TAG作为翻译终止密码子。这些翻译起始密码子也可以用适当的合成DNA连接片段添加。
本发明蛋白质的表达载体可以通过例如如下制备：(a)从编码本发明蛋白质的DNA上切取目的DNA片段，然后(b)将该DNA片段连接到适当表达载体中的启动子下游。
载体可以使用来源于大肠杆菌的质粒(例如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的质粒(例如pUB110、pTP5、pC194)、来源于酵母的质粒(例如pSH19、pSH15)、λ噬菌体等噬菌体、逆转录病毒、痘苗病毒(vaccinia virus)、杆状病毒等动物病毒，以及pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNA I/Neo等。
本发明所用的启动子只要适合于基因表达所用的宿主，可以是任何启动子。例如当用动物细胞作为宿主时，可以列举SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子和HSV-TK启动子等。
其中优选使用CMV(巨细胞病毒)启动子和SRα启动子等。当宿主为大肠杆菌属细菌时，优选trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、T7启动子等；当宿主为芽孢杆菌属细菌时，优选SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等；当宿主为酵母时，优选PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等；当宿主为昆虫细胞时，优选多角体蛋白启动子、P10启动子等。
除了上述例子之外，表达载体还可以使用根据需要含有增强子、剪接信号、聚合A添加信号、选择性标记子、SV40复制起点(以下有时简称为SV40ori)等的载体。选择性标记子包括例如二羟基叶酸还原酶(以下有时简称为“dhfr”)基因[甲氨蝶呤(MTX)抗药性]、氨苄西林抗药性基因(以下有时简称为“Ampr”)、新霉素抗药性基因(以下有时简称为“Neor”，G418抗药性)等。特别是使用dhfr基因缺失的中国仓鼠细胞，以dhfr基因作为选择性标记子时，目的基因也可以用不含胸苷的培养基进行选择。
另外，根据需要，可在本发明蛋白质的N末端添加与宿主匹配的信号序列。当宿主为大肠杆菌属细菌时，可以使用PhoA·信号序列、OmpA·信号序列等；宿主为芽孢杆菌属细菌时，可以使用α-淀粉酶·信号序列、枯草芽孢杆菌蛋白酶·信号序列等；当宿主为酵母时，可以使用MFα·信号序列、SUC2·信号序列等；当宿主为动物细胞时，可以使用胰岛素信号序列、α-干扰素·信号序列、抗体分子·信号序列等。
可以使用如上构建的包含编码本发明蛋白质的DNA的载体制备转化体。
宿主可以使用例如大肠杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌、酵母、昆虫细胞、昆虫和动物细胞等。
作为大肠杆菌属细菌的具体例子，使用例如大肠杆菌(Escherichia coli)K12 DH1[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，
60，160(1968)]、JM103[Nucleic AcidsResearch，
9，309(1981)]、JA221[Journal of Molecular Biology，120，517(1978)]、HB101[Journal of Molecular Biology，
41，459(1969)]、C600[Genetics，39，440(1954)]等。
芽孢杆菌属细菌使用例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MI114[Gene，24，255(1983)]、207-21[Journal of Biochemistry，
95，87(1984)]等
酵母使用例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cereviseae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12，栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913、NCYC2036，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71等。
作为昆虫细胞，例如当病毒为AcNPV时，使用来源于草地贪夜蛾幼虫的细胞株(Spodoptera frugiperda cell，Sf田胞)、来源于粉纹夜蛾(Trichoplusiani)中肠的MG1细胞、来源于粉纹夜蛾卵的High FiveTM细胞、来源于Mamestra brassicae的细胞、来源于棉黑纹灯蛾(Estigmena acrea)的细胞等。当病毒为BmNPV时，使用来源于家蚕(Bombyx mori N，BmN细胞)的细胞株等。作为所述Sf田胞，使用例如Sf9细胞(ATCC CRL1711)、Sf21细胞(两种细胞都公开在Vaughn，J.L.等，In Vivo，
13，213-217(1977))等。
昆虫使用例如蚕的幼虫等[Maeda等，Nature，
315，592(1985)]。
动物细胞使用例如猴细胞COS-7、Vero，中国仓鼠细胞CHO(以下简称为“CHO细胞”)，dhfr基因缺失型中国仓鼠细胞CHO(以下简称为“CHO(dhfr-)细胞”)，小鼠L细胞、小鼠AtT-20、小鼠骨髓瘤细胞、小鼠ATDC5细胞、大鼠GH3和人FL细胞等。
大肠杆菌属细菌可以按照例如Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，
69，2110(1972)，Gene，
17，107(1982)等中公开的方法进行转化。
芽孢杆菌属细菌可以按照例如Molecular & General Genetics，
168，111(1979)等中公开的方法进行转化。
酵母可以按照例如Methods in Enzymology，
194，182-187(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，
75，1929(1978)等中公开的方法进行转化。
昆虫细胞或昆虫可以按照例如Bio/Technology，
6，47-55(1988)等中公开的方法进行转化。
动物细胞可以按照例如Saibo Kogaku(Cell Engineering)，extra issue 8，Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol(New Cell Engineering ExperimentalProtocol)，263-267(1995)(published by Shujunsha)或Virology，
52，456(1973)中公开的方法进行转化。
这样就可以得到用包含编码蛋白质的DNA的表达载体转化过的转化体。
在培养大肠杆菌属或芽孢杆菌属的细菌时，转化体可适宜地培养在液体培养基中，其中含有该转化体生长发育所必需的碳源、氮源和无机物等。碳源包括例如葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等，氮源包括例如铵盐类、硝酸盐类、玉米浸渍液、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、豆饼、马铃薯提取物等无机或有机物质，无机物包括例如氯化钙、磷酸二氢钠和氯化镁等。另外，还可以添加酵母提取物、维生素类和生长促进因子等。培养基的pH值优选约为5～8。
培养大肠杆菌属细菌的培养基优选例如包含葡萄糖和酪蛋白氨基酸(Casamino acids)的M9培养基[Miller，Journal of Experiments in MolecularGenetics，431-433，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1972]。根据需要，可以向该培养基中加入例如3β-吲哚基丙烯酸等试剂以高效地激活启动子。
当宿主为大肠杆菌属细菌时，所述转化体通常培养在约15～43℃、约3～24小时。根据需要还可以通气或搅拌。
当宿主为芽孢杆菌属细菌时，所述转化体通常培养在约30～40℃、约6～24小时。根据需要还可以通气或搅拌。
当宿主为酵母时，可以使用例如Burkholder′s基本培养基[Bostian，K.L等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，
77，4505(1980)]或含有0.5％酪蛋白氨基酸的SD培养基[Bitter，G.A.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，
81，5330(1984)]作为转化体的培养基。优选培养基的pH值调至约5～8。培养通常在约20～35℃进行约24～72小时。根据需要还可以通气或搅拌。
当宿主为昆虫细胞或昆虫时，所述转化体的培养可以使用例如适当添加了固定了的10％牛血清等物质的Grace′s Insect培养基(Grace，T.C.C.，Nature)，
195，788(1962))等作为培养基。优选培养基的pH值调至约6.2～6.4。培养通常在约27℃进行约3～5天。根据需要还可以通气或搅拌。
当培养的是宿主为动物细胞的转化体时，使用例如包含约5～20％胎牛血清的MEM培养基[Science，
122.，501(1952)]、DMEM培养基[Virology，
8，396(1959)]、RPMI 1640培养基[The Journal of the American Medical Association，199，519(1967)]、199培养基[Proceeding of the Society for the BiologicalMedicine，
73，1(1950)]等作为培养基。优选培养基的pH约为6～8。优选培养基的pH值调至5～8。培养通常在约30～40℃进行约15～60小时。根据需要还可以通气或搅拌。
如上所述，可以在转化体的细胞内、细胞膜上或转化体外产生本发明的蛋白质。
例如可以按照以下方法从上述培养物中分离纯化本发明的蛋白质。
当从培养菌体或细胞中提取本发明的蛋白质时，可以适当使用下述方法等。即，在培养后通过公知的方法收集菌体或细胞，并将其悬浮在适当的缓冲液中，通过超声波、溶菌酶和/或冷冻融化等将菌体或细胞破坏，然后通过离心分离或过滤得到蛋白质的粗制提取液。缓冲液中也可以含有尿素或盐酸胍等蛋白改性剂或Triton X-100TM等表面活性剂。当蛋白质分泌到培养液中时，在培养终止后，通过公知的方法将菌体或细胞与上清分离并收集上清。
通过上述方法得到的培养上清或提取液中所含的蛋白质，可以适当组合使用公知的分离、纯化方法进行纯化。所述公知的分离、纯化方法包括盐析、或溶剂沉淀法等利用溶解度的方法，透析法、超滤法、凝胶滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等主要利用分子量差的方法，离子交换色谱等利用电荷差的方法，亲和层析等利用特异性亲和性的方法，反相高效液相色谱等利用疏水性差的方法，和等电点电泳法等利用等电点差的方法等。
当所得的蛋白质为游离形式时，可以通过公知的方法或其改进方法变成盐。反过来，所得的蛋白质为盐时，可以通过公知的方法或其该方法变成游离形式或其它的盐。
另外，还可以将重组体产生的蛋白质在纯化前或纯化后用适当的蛋白修饰酶进行处理，由此任意地施加修饰或部分地除去多肽。蛋白修饰酶可以使用例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、精氨酰内肽酶、蛋白激酶和糖苷酶等。
由此生成的本发明蛋白质的存在可以通过使用特异性抗体的酶免疫测定或蛋白印迹法进行测定。
本发明所用蛋白质或部分肽或其盐的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体中的任意一种，只要其可以识别本发明所用蛋白质或部分肽或其盐。
本发明所用蛋白质或部分肽或其盐(以下在抗体的说明中有时将这些简称为“本发明的蛋白质”)的抗体，可以通过用本发明的蛋白质作为抗原并按照公知的抗体或抗血清制备方法制备。
[单克隆抗体的制备]
(a)单克隆抗体产生细胞的制备
可以将本发明的蛋白质单独或与载体、稀释剂一起向温血动物给药至可以通过给药产生抗体的部位。给药时，为了提高抗体产生能力，还可以给药完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。通常是每2～6周给药1次，一共给药2～10次左右。所用的温血动物包括例如猴、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊和鸡等，优选使用小鼠和大鼠。
制备单克隆抗体产生细胞时，从用抗原免疫了的温血动物例如小鼠中选择抗体滴度确认了的个体，从最终免疫开始2～5天后采集脾脏或淋巴结，并使其中所含的抗体产生细胞与同种或异种动物的骨髓瘤细胞融合，由此可以制备单克隆抗体产生杂交瘤。抗血清中的抗体滴度可以通过例如使后述的标记蛋白质与抗血清反应，然后测定与抗体结合的标记物的活性来测定。融合操作可以按照已知的方法例如Koehler和Milstein的方法[ature，256，495(1975)]进行。融合促进剂包括例如聚乙二醇(PEG)和仙台病毒等，优选使用PEG。
骨髓瘤细胞的例子包括例如NS-1、P3U1、SP2/0和AP-1等温血动物的骨髓瘤细胞等，优选使用P3U1。所用的抗体产生细胞(脾脏细胞)数与骨髓瘤细胞数之比优选为1∶1～20∶1。以10～80％左右的浓度添加PEG(优选PEG1000～PEG 6000)，然后在20～40℃、优选30～37℃温育1～10分钟，由此可以高效地进行细胞融合。
可以使用各种方法筛选产生的单克隆抗体杂交瘤，可以列举例如以下方法：向直接吸附或与载体一起吸附了蛋白质抗原的固体相(例如微量培养板)中加入杂交瘤培养上清，然后加入用放射性物质或酶等标记了的抗免疫球蛋白抗体(细胞融合所用的细胞为小鼠细胞时，使用抗小鼠免疫球蛋白抗体)或蛋白质A，并检测与固体相结合的单克隆抗体的方法；向吸附了抗免疫球蛋白抗体或蛋白质A的固体相中添加杂交瘤培养上清，然后加入用放射性物质或酶标记了的蛋白质，并检测与固体相结合的单克隆抗体的方法等。
单克隆抗体的筛选可以按照公知的方法或其改进方法进行。通常用添加了HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)的动物细胞用培养基进行。筛选和育种用培养基可以使用只要使杂交瘤可以生长发育的任何培养基。例如可以使用含有1～20％、优选10～20％胎牛血清的RPMI 1640培养基、包含1～10％胎牛血清的GIT培养基(和光纯药工业(株))或用于培养杂交瘤的无血清培养基(SFM-101，日水制药(株))等。培养温度通常为20～40℃，优选37℃。培养时间通常为5天～3周，优选1周～2周。培养通常在5％CO2中进行。杂交瘤培养上清的抗体滴度可以与上述抗血清中的抗体滴度同法测定。
(b)单克隆抗体的纯化
单克隆抗体的分离纯化可以按照公知的方法进行，例如免疫球蛋白的分离纯化方法[例如盐析法、醇沉淀法、等电点沉淀法、电泳法、利用离子交换体(例如DEAE)的吸附和解吸法、超速离心法、凝胶过滤法、用抗原结合固体相或蛋白质A或蛋白质G等活性吸附剂仅仅采集抗体，然后使结合分离得到抗体的特异性纯化法]。
[多克隆抗体的制备]
本发明的多克隆抗体可以按照公知的方法或其改进方法制备。例如可以如下制备：制备免疫原(蛋白质抗原)本身或其与载体蛋白的复合物，然后以与上述单克隆抗体制备方法同样地免疫温血动物，从该经免疫的动物采集含有本发明蛋白质抗体的物质，并进行抗体的分离纯化。
在用于免疫温血动物的免疫原与载体蛋白质的复合物中，载体蛋白质的种类以及载体蛋白质与半抗原的混合比例可以是任何类型和以任意比例，只要抗体可以高效地针对通过交联到载体蛋白而用于免疫的半抗原产生。例如，按照重量比计，以半抗原为1，可以采用使牛血清白蛋白或牛甲状腺球蛋白、血蓝蛋白为约0.1～20、优选为约1～5的比例进行偶联的方法。
另外，半抗原与载体蛋白偶联时可以使用各种缩合剂。使用戊二醛、碳化二亚胺、马来酰亚胺活化酯和含有巯基、二硫代吡啶基的活化酯等试剂进行偶联。
可以将缩合产物本身或与载体、稀释剂一起向温血动物给药至可以产生抗体的部位。给药时，为了提高抗体产生能力，还可以给药完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。通常是每2～6周给药1次，一共给药3～10次左右。
多克隆抗体可以从通过上述方法免疫了的温血动物的血液和腹水等中采集，优选从血液中采集。
抗血清中的多克隆抗体滴度测定可以利用与上述抗血清中的抗体滴度测定同法进行。多克隆抗体的分离纯化可以按照与上述单克隆抗体的分离纯化相同的免疫球蛋白分离纯化方法进行。
含有与编码本发明所用蛋白质或部分肽的多核苷酸(例如DNA(以下在反义多核苷酸的说明中有时将这些DNA统称为“本发明的DNA”)的碱基序列互补或基本上互补的碱基序列或其一部分的反义多核苷酸可以是任何反义多核苷酸，只要其含有与本发明的多核苷酸(例如DNA)的碱基序列互补或基本上互补的碱基序列或其一部分，并具有能抑制该DNA表达的作用，其中优选反义DNA。
与本发明的DNA基本上互补的碱基序列包括，例如，与本发明DNA的互补碱基序列(即本发明DNA的互补链)的整个碱基序列或其一部分具有约70％或更高、优选约80％或更高、更优选约90％或更高、最优选约95％或更高同源性的碱基序列等。特别是在本发明DNA的互补链的整个碱基序列中，(a)在导致翻译抑制的反义多核苷酸的情况下，与编码本发明蛋白质N末端部位的部分碱基序列(例如起始密码子附近的碱基序列等)的互补链具有约70％或更高、优选约80％或更高、更优选约90％或更高、最优选约95％或更高同源性的反义多核苷酸；(b)在导致RnaseH对RNA的降解的反义多核苷酸的情况下，与含有内含子的本发明DNA的整个碱基序列的互补链具有约70％或更高、优选约80％或更高、更优选约90％或更高、最优选约95％或更高同源性的反义多核苷酸。
具体例子包括含有下述碱基序列或其一部分的反义多核苷酸，所述碱基序列与包含序列号：2、序列号：3、序列号：5、序列号：6、序列号：8、序列号：9、序列号：11或序列号：12所示碱基序列的DNA碱基序列互补或基本上互补。优选含有下述碱基序列或其一部分的反义多核苷酸等，所述碱基序列与包含序列号：2、序列号：3、序列号：5、序列号：6、序列号：8、序列号：9、序列号：11或序列号：12所示碱基序列的DNA碱基序列互补。
反义多核苷酸通常包含10～40个左右、优选15～30个左右的碱基。
为了防止核酸酶等水解酶导致的分解，构成反义DNA的各核苷酸的磷酸残基(磷酸酯)可以被例如硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯等化学修饰的磷酸残基所取代。另外，各核苷酸的糖(脱氧核糖)可以被2′-O-甲基化等化学修饰糖结构取代，碱基部分(嘧啶、嘌呤)也可以进行化学修饰，只要可以与包含序列号：2所示碱基序列的DNA杂交即可。这些反义多核苷酸可以使用公知的DNA合成装置等制备。
根据本发明，能够抑制本发明蛋白质基因复制或表达的该基因对应的反义多核苷酸(核酸)，可以以编码已克隆或鉴定的蛋白质的DNA的碱基序列信息为基础进行设计、合成。所述反义多核苷酸可以与本发明蛋白质基因的RNA杂交，或抑制该RNA的合成或功能，或通过与本发明蛋白质相关联的RNA之间的相互作用而调解、控制本发明蛋白质基因的表达。与和本发明蛋白质相关的RNA的选定序列互补的多核苷酸、以及可以与本发明蛋白质相关的RNA特异性杂交的多核苷酸，对于在机体内和机体外调解、控制本发明蛋白质基因的表达是有用的，还对疾病等的治疗或诊断是有用的。术语“对应”是指与包含基因的核苷酸、碱基序列或核酸的特定序列具有同源性或互补。核苷酸、碱基序列或核酸与蛋白质之间的“对应”通常是指由核苷酸(核酸)的序列或其互补序列衍生(在于指令)的蛋白质的氨基酸。蛋白质基因的5′末端发夹环、5′末端6-碱基对重复单元、5′末端非翻译区域、多肽翻译起始密码子、蛋白质编码区域、ORF翻译终止密码子、3′末端非翻译区域、3′末端回文结构区域、或3味端发夹环等可以优选选择作为对象区域，蛋白质基因内的所有区域也可以选择作为对象。
目的核酸和与对象区域的至少一部分互补的多核苷酸之间的关系，具体是目的核酸与可以同对象区域杂交的多核苷酸之间的关系是“反义”的。反义多核苷酸包括例如含有2-脱氧-D-核糖的多核苷酸、含有D-核糖的多核苷酸、作为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的其它类型的多核苷酸、具有非核苷酸骨架的其它聚合物(例如市售的蛋白质核酸和合成序列特异性核酸聚合物)或包含特殊的键的聚合物(该聚合物包含具有下述结构的核苷酸，该结构允许如在DNA或RNA中所见的碱基配对或碱基附着)等。这些多核苷酸可以是双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA或DNA:RNA杂交体，还可以是非修饰的多核苷酸(或非修饰的寡核苷酸)被进行了公知的修饰所得的物质，例如带有本领域已知标记的物质、带帽的物质、甲基化的物质、用类似物取代1个或1个以上天然核苷酸所得的物质、进行了分子内核苷酸修饰的物质，例如带有非电荷键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯和氨基甲酸酯等)和带有电荷的键或含硫键(例如硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯等)的物质，例如带有蛋白质(例如核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)或糖(例如单糖等)侧链基团的物质、带有嵌入剂(例如丫啶、补骨脂素等)的物质、含有螯合化合物(例如金属、具有放射活性的金属、硼、氧化性金属等)的物质、含有烷化剂的物质、带有被修饰的键的物质(例如α-端异构核酸等、)。术语“核苷”、“核苷酸”和“核酸”不仅仅含有嘌呤和嘧啶碱基，也可以含有被修饰的其它杂环型碱基。这样的修饰物包括甲基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤和嘧啶或其它杂环。被修饰了的核苷酸和被修饰了的核苷酸还可以在糖部分被修饰。例如1个或1个以上的羟基被卤素或脂肪族基团等取代，或变成醚、胺等官能团。
本发明的反义多核苷酸是RNA、DNA或被修饰的核酸(RNA、DNA)。被修饰的核酸的具体例子包括核酸的硫衍生物、硫代磷酸盐衍生物、多核苷酰胺或寡核苷酰胺的分解抵抗性物质等。本发明的反义多核苷酸可例如按照如下设计。即，提高细胞内的反义多核苷酸的稳定性，提高反义多核苷酸的细胞渗透性，增大对目标有义链的亲和性，或当有毒性时减小反义多核苷酸的毒性。这样的修饰大多报告在例如Pharm.Tech.Japan，Vol.8，pp.247，或pp.395，1992；Antisense Research and Applications，CRC Press，1993等中。
本发明的反义多核苷酸可以包含变化或修饰了的糖、碱基、键，能以脂质体、微球体等特殊形式而被提供，或用于基因治疗，或连同添加的部分一起被提供。所述添加的部分，包括起中和磷酸基骨架(phosphate backbone)电荷作用的聚赖氨酸等聚阳离子物，提高与细胞膜的相互作用或增加核酸摄取的脂质(例如磷脂、胆固醇等)等的疏水性物质。优选被添加的脂质包括胆固醇或其衍生物(例如胆甾醇氯甲酸酯、胆酸等)等。这些物质可以添加到核酸的3′末端或5′末端，也可以通过碱基、糖或分子内核苷键被添加。其它基团包括特异性放置在核酸3′末端或5′末端以阻止核酸外切酶、Rnase等核酸酶导致的分解的加帽基团(capping group)等。这样的帽用基团包括以聚乙二醇、四甘醇等二醇为代表的本领域已知的羟基保护基团等，但不限于这些。
反义多核苷酸的抑制活性可以利用本发明的转化体、本发明的体内或体外基因表达系统、或本发明蛋白质的体内或体外翻译系统进行检测。
以下说明以下物质的用途：本发明蛋白质或其部分肽或其盐(以下有时简称为“本发明的蛋白质”)、编码本发明蛋白质或其部分肽的多核苷酸(例如DNA)(以下有时简称为“本发明的DNA”)、本发明蛋白质或其部分肽或其盐的抗体(以下有时简称为“本发明的抗体”)和本发明DNA的反义多核苷酸(以下有时简称为“本发明的反义多核苷酸”)。
本发明的蛋白质在癌组织中表达增加，因此可以用作疾病标记物。即，可以用作癌组织的早期诊断、症状严重程度的判断、疾病发展预测的标记物。因此，含有编码本发明蛋白质的多核苷酸的反义多核苷酸、抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐、抑制本发明蛋白质基因表达的化合物或其盐、或含有本发明蛋白质的抗体的药物可以用作癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)的预防·治疗剂、细胞凋亡促进剂。
(1)疾病的药物候补化合物筛选
本发明的蛋白质在癌组织中的表达亢进，并且当抑制本发明蛋白质的活性时，引起癌细胞的凋亡。因此，抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐可以用作癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)的预防·治疗剂、细胞凋亡促进剂。
因此，本发明的蛋白质可以用作用于筛选抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐的试剂。
即，本发明提供筛选抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐的方法，其特征在于使用本发明的蛋白质。
具体地例如，采用筛选抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐的方法，该方法的特征在于，比较(i)能产生本发明蛋白质的细胞的活性与(ii)能产生本发明蛋白质的细胞与受试化合物的混合物的活性。
作为能产生本发明蛋白质的细胞，可以使用例如用包含编码本发明蛋白质的DNA的载体转化了的上述宿主(转化体)。宿主优选使用例如COS7细胞、CHO细胞和HEK293细胞等动物细胞。筛选时优选使用这样的转化体，其中例如通过按照上述方法进行培养而使本发明蛋白质在细胞中表达。能表达本发明蛋白质的细胞的培养方法与上述本发明转化体的培养方法相同。
受试化合物的例子包括肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液和动物组织提取液等。
例如，可以选择与上述(i)相比，抑制上述(ii)中本发明蛋白质的活性约20％或以上、优选30％或以上、更优选约50％或以上的受试化合物作为抑制本发明蛋白质活性的化合物。
具有抑制本发明蛋白质活性的活性的化合物可以用作用于抑制本发明蛋白质生理活性的低毒性安全药物。
进一步地，本发明蛋白质的基因也在癌组织中表达增加，因此，抑制本发明蛋白质基因表达的化合物或其盐也可以用作癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)的预防·治疗剂、细胞凋亡促进剂。
因此，本发明的多核苷酸(例如DNA)可以用作用于筛选抑制本发明蛋白质基因表达的化合物或其盐的试剂。
作为筛选方法，可以列举下述方法，该方法的特征在于，将(iii)培养能产生本发明蛋白质的细胞的情况与(iv)在受试化合物的存在下培养能产生本发明蛋白质的细胞的情况进行比较。
在上述方法中，测定并比较(iii)和(iv)情况中上述基因的表达量(具体是本发明蛋白质的量或编码本发明蛋白质的mRNA量)。
作为受试化合物和能生产本发明蛋白质的细胞，可以列举与上述相同的物质。
蛋白质的量可以根据公知的方法进行测定，例如，按照以下方法测定：用识别本发明蛋白质的抗体，通过蛋白印迹分析法和ELISA法等方法或其改进方法测定细胞提取液等中存在的上述蛋白质。
mRNA的量可以根据公知的方法进行测定，例如，用包含序列号：2、序列号：5、序列号：8或序列号：11所示的碱基序列或其一部分的核酸作为探针的Northern杂交法；或用包含序列号：2、序列号：5、序列号：8或序列号：11所示的碱基序列或其一部分的核酸作为探针的PCR法，或它们的改进方法。
例如，可以选择与上述(iii)相比，抑制上述(iv)中基因表达约20％或以上、优选30％或以上、更优选约50％或以上的受试化合物作为抑制本发明蛋白质基因表达的化合物。
本发明的筛选用试剂盒含有本发明所用的蛋白质或部分肽或其盐，或能产生本发明所用蛋白质或部分肽的细胞。
利用本发明筛选方法或筛选试剂盒获得的化合物或其盐是上述受试化合物，例如选自肽、蛋白质、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液和血浆等中的化合物或其盐，它们是抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐、抑制本发明蛋白质基因表达的化合物或其盐。
作为这些化合物的盐，使用与上述本发明蛋白质的盐相同的盐。
抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐和抑制本发明蛋白质基因表达的化合物或其盐分别可以用作例如癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)的预防·治疗剂、细胞凋亡促进剂等低毒性的安全药物。
将利用本发明的筛选方法或筛选试剂盒得到的化合物或其盐用作上述预防·治疗剂时，可以根据常规方法制成制剂。
例如，口服给药的组合物包括固体或液体剂型，具体包括片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊(包括软胶囊)、糖浆剂、乳剂和混悬剂等。所述组合物可以通过公知的方法制备，包含制剂领域中通常使用的载体、稀释剂或赋形剂。例如作为片剂用的载体、赋形剂，使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。
非口服给药的组合物包括例如注射剂和栓剂等。注射剂包括静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、滴注注射剂、关节内注射剂等剂型。所述注射剂可以根据公知的方法制备，例如通过将上述化合物或其盐溶解、悬浮或乳化在通常用于注射剂的无菌水性或油性液体中来制备。注射用水性液体使用例如生理盐水、包含葡萄糖或其它助剂的等渗液等，还可以与适当的助溶剂例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如聚山梨酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧化乙烯(50mol)加成物))等一起使用。油性液体使用例如芝麻油、大豆油等，也可以与作为助溶剂的苯甲酸苄酯、苄醇等并用。制备的注射液通常装入适当的安瓿中。用于直肠给药的栓剂通过将上述化合物或其盐与常用的栓剂基质混合而制备。
将上述口服或非口服药物组合物制成适合于活性成分给药量的给药单位剂型是有利的。所述给药单位的剂型可以列举片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)和栓剂等。每个给药单位剂型通常包含5～500mg上述化合物，注射剂优选包含5～100mg、其它剂型优选包含10～250mg上述化合物。
另外，上述各组合物还可以包含其它活性成分，只要该成分在与上述化合物混合时不会产生不良的相互作用。
按照上述方法获得的制剂安全，并且毒性低，可以对例如人或温血动物(例如小鼠、大鼠、兔、羊、猪、牛、马、鸟类、猫、狗、猴和黑猩猩等)进行口服或非口服给药。
上述化合物或其盐的给药量因其作用、对象疾病、给药对象和给药途径等而异。例如，为了治疗乳腺癌而口服给予抑制本发明蛋白质基因表达的化合物或其盐时，一般对成人(以体重为60kg计)每天给予上述化合物或其盐约0.1～100mg、优选约1.0～50mg、更优选约1.0～20mg。非口服给药时，上述化合物或其盐的一次给药量也因给药对象、对象疾病等而异。例如，普通成人(以体重为60kg计)为了治疗乳腺癌而以注射剂的形式给药抑制本发明蛋白质基因表达的化合物或其盐时，每天通过注射在癌变部位给药约0.01～30mg、优选约0.1～20mg、更优选约0.1～10mg上述化合物或其盐是有利的。对于其它动物的情况，可以按照换算成体重60kg的量进行给药。
(2)本发明蛋白质的定量
本发明的抗体可以特异性地识别本发明的蛋白质，因此可以用于被测液中本发明蛋白质的定量，特别是用于通过夹心(sandwich)免疫测定法的定量。
即，本发明提供：
(i)被测液中本发明蛋白质的定量方法，其特征在于，使本发明的抗体、被测液和被标记的本发明蛋白质竞争性地反应，然后测定与所述抗体结合的被标记的本发明蛋白质的比例，和
(ii)被测液中本发明蛋白质的定量方法，其特征在于，使被测液与固定在载体上的本发明抗体以及被标记的本发明的其它抗体同时或连续地进行反应后，然后测定固定的载体上的标记物的活性。
在上述(ii)的定量方法中，优选一种抗体为识别本发明蛋白质N末端部的抗体，而另一种抗体是与本发明蛋白质的C末端部反应的抗体。
另外，除了用本发明蛋白质的单克隆抗体(以下有时称为本发明的单克隆抗体)对本发明蛋白质进行定量外，也可以通过组织染色等进行检测。为了这些目的，可以使用抗体分子本身，也可以使用抗体分子的F(ab′)2、Fab′或Fab级分。
对利用本发明抗体的本发明蛋白质的定量方法没有特别限定，只要是通过化学或物理方法测定出对应于被测液中抗原量(例如蛋白质量)的抗体、抗原或抗体-抗原复合物的量，然后通过使用包含已知量抗原的标准液制作的标准曲线算出抗原的量的方法即可，可以采用任何测定方法。合适使用例如浊度法、竞争法、免疫测定法和夹心法等。从灵敏度和特异性方面考虑，特别优选使用后述的夹心法。
在使用标记物质的测定法中所用的标记试剂为例如放射性同位素、酶、荧光物质和发光物质等。放射性同位素使用例如[125I]、[1311I]、[3H]和[14C]等。上述酶优选稳定并且比活性高的酶，包括例如β-半乳糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、碱性磷酸酯酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶等。作为荧光物质，使用例如花青荧光染料(cyanine fluorescent dyes)(例如Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Biosciences公司生产)等)、荧光胺、荧光素异硫氰酸盐等。作为发光物质，使用例如鲁米诺(luminol)、鲁米诺衍生物、萤光素(luciferin)和光泽精(lucigenin)等。另外，还可以在抗体或抗原与标记试剂结合时使用生物素-抗生物素蛋白系统。
在使抗原或抗体不溶化(insolubilization)时，可以采用物理吸附，也可以使用通常在蛋白质或酶不溶化、固定时所用的化学结合的方法。作为载体，可以列举琼脂糖、葡聚糖和纤维素等不溶性多糖类，聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅酮等合成树脂，或玻璃等。
在夹心法中，使固定的本发明单克隆抗体与被测液反应(一次反应)，然后与标记了的其它本发明单克隆抗体反应(二次反应)，接着测定固定抗体上的标记物活性，由此可以对被测液中的本发明蛋白质进行定量。一次反应和二次反应也可按照相反的顺序进行，还可以同时进行或错开时间进行。标记试剂和固定的方法可以如上所述地进行。另外，在采用夹心法的免疫测定方法中，用于固定的抗体或用于标记的抗体不必须是一种抗体，为了提高测定灵敏度等目的，可以使用两种或两种以上的抗体的混合物。
在采用本发明夹心法的本发明蛋白质测定方法中，一次反应和二次反应所用的本发明单克隆抗体，优选使用与本发明蛋白质的结合部位不同的抗体。例如，二次反应所用的抗体识别本发明蛋白质的C末端部时，一次反应所用的抗体优选为识别C末端部以外的抗体，例如识别N末端部。
可以将本发明的单克隆抗体用于夹心法以外的测定系统，例如竞争法、免疫测量法或浊度法等。
在竞争法中，使被测液中的抗原和标记抗原与抗体竞争性地反应后，将未反应的标记抗原(F)和与抗体结合的标记抗原(B)分离(B/F分离)，测定B或F中任意一个的标记量，由此对被测液中的抗原量进行定量。本反应方法中，可以使用液相法和固定化法，所述液相法为使用可溶性抗体作为抗体，并使用用于B/F分离的聚乙二醇、上述抗体的第2抗体等的液相法，所述固定化法是用固相化抗体作为第1抗体，或用可溶性抗体作为第1抗体、用固相化抗体作为第2抗体的固定化方法。
在免疫测量法中，使被测液中的抗原和固定化抗原与一定量的标记抗体竞争性地反应后，分离固相和液相，或者使被测液中的抗原与过量的标记抗体反应，然后加入固定化抗原，使未反应的标记抗体被结合到固相中后，分离固相与液相。然后测定任意一个相中的标记量，从而对被测液中的抗原量进行定量。
在浊度法中，测定凝胶内或溶液中抗原抗体反应所生成的不溶性沉淀的量。当被测液中的抗原量很少、仅得到少量沉淀时，也适合采用利用激光散射的激光浊度法。
将上述各个免疫学测定方法用于本发明的定量方法时，不需要设定特别的条件、操作等。在各方法常规的条件、操作方法的基础上，加上本领域技术人员在技术上的常规考虑来构建本发明蛋白质的测定体系即可。有关这些普通技术方法，可以参照总论或者出版物等。
可以参照例如，Hiroshi Irie编，″Radioimmunoassay″(Kodansha，1974出版)；Hiroshi Irie编，″Sequel to the Radioimmunoassay″(Kodansha，1979出版)；Eiji Ishikawa等编，″Enzyme immunoassay″(Igakushoin，1978出版)；Eiji Ishikawa等编，″Immunoenzyme assay″(第二版)(Igakushoin，1982出版)；Eiji Ishikawa等编，″Immunoenzyme assay″(第三版)(Igakushoin，1987出版)；Methods in ENZYMOLOGY，Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A))；Methods in ENZYMOLOGY，Vol.73(Immunochemical Techniques(Part B))；Methods in ENZYMOLOGY，Vol.74(Immunochemical Techniques(Part C))；Methods in ENZYMOLOGY，Vol.84(Immunochemical Techniques(Part D：Selected Immunoassays))；Methods in ENZYMOLOGY，Vol.92(Immunochemical Techniques(Part E：Monoclonal Antibodies and GeneralImmunoassay Methods))；Methods in ENZYMOLOGY，Vol.121(Immunochemical Techniques(Part I：Hybridoma Technology and MonoclonalAntibodies))(以上均由Academic Press Publishing出版)等。
如上所述，通过使用本发明的抗体，可以以高灵敏度测定本发明蛋白质的含量。
并且，通过使用本发明的抗体对本发明蛋白质的浓度进行定量，检测出本发明蛋白质浓度的增加时，可以例如诊断癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)或将来罹患癌症的可能性高。
另外，本发明的抗体可以用于检测体液或组织等被测物中存在的本发明的蛋白质，还可以用于制备用于纯化本发明蛋白质的抗体柱、检测纯化时各级分中本发明的蛋白质、分析被测细胞中本发明蛋白质的行为等。
(3)基因诊断药物
本发明的DNA通过作为例如探针使用，可以检测出人或温血动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、鸟类、羊、猪、牛、马、猫、狗、猴和黑猩猩等)中编码本发明蛋白质或其部分肽的DNA或mRNA异常(基因异常)，因此可以用作例如该DNA或mRNA损伤、突变或表达降低、或者该DNA或mRNA增加或过度表达等的基因诊断药物。
采用本发明DNA的上述基因诊断，可以根据例如公知的Northern杂交或PCR-SSCP法(Genomics，
5，874-879(1989)；Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，
86，2766-2770(1989))等进行。
例如，通过Northern杂交检测出表达过度或通过PCR-SSCP检测出DNA突变时，可以诊断为例如癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)的可能性高。
(4)含有反义多核苷酸的药物
与本发明的DNA互补结合并抑制该DNA表达的本发明反义多核苷酸是低毒性的，可以抑制机体中本发明蛋白质或本发明DNA的功能或作用，诱导癌细胞的细胞凋亡，因此可以用作例如癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)的预防·治疗剂、细胞凋亡促进剂等。
当将上述反义多核苷酸作为上述预防·治疗剂、促进剂使用时，可以根据本发明公知的方法制成制剂、给药。
例如，可以将上述反义多核苷酸单独或将其插入逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体等适当载体后，按照常规方法向人或哺乳动物(例如大鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗和猴等)进行口服或非口服给药。该反义多核苷酸可以直接或为了促进吸收而与助剂等生理学上允许的载体一起制成制剂后，通过基因枪或水凝胶导管等导管给药，或者，也可以气雾化制成吸入剂局部给药到气管中。
并且，为了改善体内药动学、延长半衰期、改善细胞内吸收效率，上述反义多核苷酸也可以单独或与脂质体等载体一起制成制剂(注射剂)后通过静脉或皮下等途径给药。
该反义多核苷酸的给药量因对象疾病、给药对象和给药途径等而异。例如，为了治疗乳腺癌而给予本发明的反义多核苷酸时，一般成人(以体重60kg计)每天给予该反义多核苷酸约0.1～100mg。
另外，上述反义多核苷酸还可以作为用于检查组织或细胞中本发明DNA的存在或表达状况的诊断用寡核苷酸探针使用。
与上述反义多核苷酸一样，包含编码本发明蛋白质的RNA的一部分的双链RNA、包含编码本发明蛋白质的RNA的一部分核酶等，也可以抑制本发明基因的表达，并可以抑制机体中本发明所用蛋白质或本发明所用DNA的功能，因此可以用作例如癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)的预防·治疗剂、细胞凋亡促进剂等。
双链RNA可以根据公知的方法(例如Nature，
411，494，2001)以本发明多核苷酸的序列为基础进行设计并制备。
核酶可以根据公知的方法(例如TRENDS in Molecular Medicine，
7，221，2001)以本发明多核苷酸的序列为基础进行设计并制备。例如，可以通过将公知的核酶连接到编码本发明蛋白质的RNA的一部分来制备。作为编码本发明蛋白质的RNA的一部分，可以列举与本发明RNA上的切断部位接近的部分(RNA片段)，所述本发明RNA是由公知核酶切断所得到的。
将上述双链RNA或核酶用作上述预防·治疗剂时，可以与反义多核苷酸同样制成制剂并给药。
(5)含本发明抗体的药物
本发明的抗体由于具有诱导癌细胞凋亡的活性，因此可以用作例如癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)的预防·治疗剂(例如疫苗等)、细胞凋亡促进剂等。
含有本发明抗体的上述疾病的预防·治疗剂、促进剂是低毒性的，可以直接以液体制剂或适当剂型的药物组合物形式对人或哺乳动物(例如大鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗和猴等)进行口服或非口服给药(例如血管内给药和皮下给药等)。优选以疫苗的形式按照常规方法给药。
本发明的抗体可以单独给药，也可以以合适的药物组合物形式给药。用于给药的药物组合物也可以包含本发明的抗体和其盐，以及可药用载体、稀释剂或赋形剂。这样的药物组合物以适合口服或非口服的剂型提供。
用于非口服给药的组合物包括例如注射剂、栓剂、疫苗等，注射剂还可以包括静脉注射剂、皮下注射剂、肌肉注射剂、滴注注射剂等剂型。这样的注射剂可以通过公知的方法制备。作为注射剂的制备方法，例如，可以通过将上述本发明的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在注射剂常用的无菌水性介质或油性介质中而制备。注射用的水性介质使用例如生理盐水、含有葡萄糖或其它助剂的等渗液等，还可以与合适的助溶剂例如醇类(例如乙醇)、多元醇类(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如聚山梨酯80、HCO-50(聚氧化乙烯(50摩尔)与氢化蓖麻油的加成物)等并用。油性介质使用例如芝麻油、大豆油等，还可以与苯甲酸苄酯、苄醇等助溶剂并用。所制备的注射剂优选装入适当的安瓿中。用于直肠给药的栓剂可以通过将上述抗体或其盐与常用的栓剂基质混合而制备。
用于口服的组合物包括固体或液体剂型，具体可以列举片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包括软胶囊)、糖浆剂、乳剂和混悬剂等。这些组合物可以通过公知的方法制备，也可以含有制剂领域中通常使用的载体、稀释剂或赋形剂。作为片剂的载体、赋形剂，使用例如乳糖、淀粉、蔗糖和硬脂酸镁。
将上述非口服或口服药物组合物制成适合于活性成分给药量的给药单位剂型是有利的。这种给药单位的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)和栓剂等。抗体的含量通常是5～500mg/每给药单位剂型，特别是当为注射剂时，优选包含5～100mg上述抗体；为其它剂型时，优选包含10～250mg上述抗体。
含有本发明抗体的上述预防·治疗剂、调节剂的给药量因给药对象、对象疾病、症状和给药途径等而异，例如用于治疗、预防成人乳腺癌时，本发明抗体的一次剂量通常为0.01～20mg/kg体重左右，优选0.1～10mg/kg体重左右，更优选0.1～5mg/kg体重左右，一天大约1～5次，优选一天1～3次左右。通过静脉注射给药是有利的。其它非口服给药和口服可药时也可以按照对应于上述量的量给药。症状特别严重时，也可以根据该症状增加给药量。
本发明的抗体可以单独给药，也可以以合适的药物组合物形式给药。用于上述给药的药物组合物包含本发明的抗体或其盐，以及可药用载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物以适合口服或非口服给药(例如血管内注射和皮下注射等)的剂型提供。
另外，上述各组合物还可以含有其它活性成分，只要该活性成分不会因与上述抗体混合而产生不良相互作用。
并且，本发明的抗体还可以与其它药物并用，例如烷化剂(例如环磷酰胺、异环磷酰胺等)、代谢拮抗剂(例如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶等)、抗癌性抗生素(例如丝裂霉素、阿霉素等)、来源于植物的抗癌剂(例如长春新碱、长春碱、长春地辛、紫杉醇等)、顺铂、卡铂、etopoxide等。本发明抗体可以与上述药物同时或不同时给药至患者。
(6)含有本发明蛋白质的药物
由于本发明的蛋白质在癌症中过度表达，因此可以用本发明的蛋白质作为癌症疫苗以激活癌症患者的免疫系统。
例如，可以优选适用于下述的所谓过继免疫疗法等。即，在本发明蛋白质的存在下，培养强的抗原呈递细胞(例如树突细胞)，使其吞噬该蛋白质后，再次回到患者体内。回到体内的树突细胞可以诱导、活化癌抗原特异性的细胞毒性T细胞，由此杀死癌细胞。
另外，本发明的蛋白质也作为预防或治疗例如癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)的疫苗制剂安全地对哺乳动物(例如人、猴、小鼠、大鼠、兔和猴)进行给药。
该疫苗制剂通常含有本发明的蛋白质和生理学上允许的载体。载体包括例如水、盐水(包括生理盐水)、缓冲液(例如磷酸缓冲液)、醇(例如乙醇)等液体载体。
疫苗制剂可以按照常规疫苗制剂的制备方法制备。
通常将本发明的蛋白质溶解或悬浮在生理学上允许的载体中。另外，也可以分别制备本发明的蛋白质和生理学上允许的载体，在使用时将它们混合。
疫苗制剂中，除了本发明的蛋白质和生理学上允许的载体之外，还可以加入佐剂(例如氢氧化铝凝胶、血清白蛋白等)、防腐剂(例如硫柳汞(thimerosal)等)、无痛化剂(例如葡萄糖、苄醇等)等。另外，为了促进本发明蛋白质抗体的产生，还可以加入例如细胞因子(例如白细胞介素-2等白细胞介素类、干扰素-γ等干扰素类等)。
当用作疫苗制剂时，本发明的蛋白质可以以活性形式使用。为了提高抗原性，也可以使本发明的蛋白质变性。本发明蛋白质的变性可以通过采用常规的加热处理、蛋白质变性剂(例如福尔马林、盐酸胍、尿素)的处理进行。
所得的疫苗制剂是低毒性的，通常可以作为注射剂通过例如皮下、皮内、肌内注射途径给药，也可以局部给药至癌细胞块或其附近。
本发明蛋白质的给药量因例如对象疾病、给药对象和给药途径等而异。例如，当本发明的蛋白质以注射剂的形式给癌症成人患者(以体重60kg计)皮下注射时，一次通常为0.1～300mg左右，优选100～300mg左右。疫苗制剂的给药次数可以是一次，但为了提高抗体产生量，也可以以约2周～约6个月的间隔给予该疫苗制剂2～4次。
(7)DNA转基因动物
本发明提供携带有编码本发明蛋白质的外源性DNA(以下简称为“本发明的外源性DNA”)或其变异DNA(有时简称为“本发明的外源性变异DNA”)的非人哺乳动物。
即，本发明提供：
(1)携带本发明外源性DNA或其变异DNA的非人哺乳动物；
(2)上述(1)所述的动物，其为啮齿动物；
(3)上述(2)所述的动物，该啮齿动物为小鼠或大鼠；以及
(4)一种重组载体，其含有本发明的外源性DNA或其变异DNA，并且可以在哺乳动物中表达。
携带有本发明外源性DNA或其变异DNA的非人哺乳动物(以下简称为本发明的DNA转基因动物)可以通过下述方法制备：对于未受精卵、受精卵、精子和包含其原生殖细胞的生发细胞(germinal cells)，优选在非人哺乳动物发育过程中的胚胎发生阶段(更优选在单细胞或受精卵细胞阶段，并且一般在8细胞期之前)，通过磷酸钙法、电脉冲法、脂质转染法、凝集法、微量注射法、粒子枪法、DEAE-葡聚糖法等转染目的DNA。通过该DNA转染方法，也可以向体细胞、机体器官和组织细胞等中转染本发明的目的外源性DNA，并用于细胞培养和组织培养等。并且，通过使上述细胞与上述生发细胞通过公知的细胞融合法融合，也可以制备本发明的DNA转基因动物。
非人哺乳动物使用例如牛、猪、绵羊、山羊、兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、小鼠和大鼠等。其中，从制作病体动物模型体系方面考虑，优选个体发育和生物周期比较短、并且繁殖容易的啮齿动物，特别是小鼠(例如C57BL/6系统、DBA2系统等纯种类，B6C3F1系统、BDF1系统、B6D2F1系统、BALB/c系统、ICR系统等杂种类)、或大鼠(例如Wistar、SD等)等。
可以在哺乳动物中表达的重组载体中的“哺乳动物”，除了上述非人哺乳动物之外，还包括人等。
本发明的外源性DNA不是指非人哺乳动物本身固有的本发明的DNA，而是指从哺乳动物分离、提取出了的本发明的DNA。
作为本发明的变异DNA，使用本发明原始DNA的碱基序列发生变异(例如突变等)生成的变异体，具体地，使用通过碱基的添加、缺失、用其它碱基取得等生成的DNA等。另外，也包括异常DNA。
所述异常DNA是指使异常表达本发明蛋白质的DNA，例如，使用使抑制本发明正常蛋白质功能的蛋白质表达的DNA等。
本发明的外源性DNA可以是来源于与对象动物同种或异种的哺乳动物的DNA。将本发明的DNA转染到对象动物时，一般将该DNA作为连接到可以在动物细胞中表达的启动子下游的DNA构建体(DNA construct)进行使用是有利的。例如，转染本发明的人DNA时，将本发明的人DNA连接到可以使来源于下述动物的DNA表达的各种启动子下游，其中该动物携带有与上述DNA同源性高的本发明DNA(例如兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠和小鼠等)，然后将所得的DNA构建体(例如载体等)微量注射到对象哺乳动物的受精卵，例如小鼠的受精卵，由此可以制备高水平地表达本发明DNA的DNA转基因哺乳动物。
作为本发明蛋白质的表达载体，使用来源于大肠杆菌的质粒、来源于枯草芽孢杆菌的质粒、来源于酵母的质粒、λ噬菌体等噬菌体、莫洛尼(Moloney)白血病病毒等逆转录病毒、痘苗病毒和杆状病毒等动物病毒。其中，优选使用来源于大肠杆菌的质粒、来源于枯草芽孢杆菌的质粒或来源于酵母的质粒等。
作为调节上述DNA表达的启动子，使用例如(i)来源于病毒(例如猴病毒、巨细胞病毒、莫洛尼白血病病毒、JC病毒、乳腺癌病毒和脊髓灰质炎病毒等)的DNA的启动子；(ii)来源于各种哺乳动物的启动子(人、兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等)的启动子，例如，白蛋白、胰岛素II、uroplakinII、弹性蛋白酶、红细胞生成素、内皮肽、肌肉肌酸激酶、胶质细胞原纤维酸性蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、来源于血小板的生长因子β、角蛋白K1、K10和K14、I型胶原和II型胶原、环AMP-依赖性蛋白激酶βI亚单位、肌营养不良蛋白、耐酒石酸碱性磷酸酯酶、心钠素、内皮受体酪氨酸激酶(一般简称为“Tie2”)、钠-钾腺苷三磷酸酶(adenosine triphosphorylase)(Na，K-ATPase)、神经丝轻链、金属硫蛋白I和IIA、金属蛋白酶(Metalloproteinase)I组织抑制剂、MHC类I抗原(H-2L)、H-ras、肾素、多巴胺β-羟化酶、甲状腺过氧化物酶(TPO)、肽链延长因子1α(EF-1α)、β-肌动蛋白、α和β-肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链1和2、髓鞘基础蛋白(myelin baseprotein)、甲状腺球蛋白、Thy-1、免疫球蛋白、H-链可变区(VNP)、血清淀粉组分P、肌红蛋白、肌钙蛋白C、平滑肌α-肌动蛋白、前脑啡肽原A、加压素等。其中优选可以在全身高水平表达的巨细胞病毒启动子、人肽链延长因子1α(EF-1α)启动子、人和鸡β-肌动蛋白启动子等。
优选上述载体具有在DNA转基因哺乳动物中终止目的信使RNA转录的序列(一般称为终止子)，例如，可以使用来源于病毒和来源于各种哺乳动物的各DNA的序列，优选使用猴病毒的SV40终止子。
另外，为了进一步提高目的外源性DNA的表达，还可以根据目的将各DNA的剪接信号、增强子区域、真核DNA内含子的一部分等连接到启动子区域的5′上游、启动子区域和翻译区域之间或翻译区域的3′下游。
正常的本发明蛋白质的翻译区域可以用下述物质作为原料获得，即，来源于人或各种哺乳动物(例如兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠和小鼠等)肝脏、肾脏、甲状腺细胞、成纤维细胞的DNA和市售的各种基因组DNA文库的基因组DNA的全部或一部分，或用来源于肝脏、肾脏、甲状腺细胞、成纤维细胞的RNA通过公知方法制备的互补DNA。另外外源性的异常DNA可以通过使正常蛋白质的翻译区域进行点突变制备变异了的翻译区域，所述正常蛋白质是由上述细胞或组织获得的。
该翻译区域可以通过常规的DNA工程方法制备，在所述的DNA工程方法中，DNA以能在转基因动物中表达的DNA构建体的形式连接到上述启动子的下游，并且如果需要，连接到转录终止部位的上游。
在受精卵细胞阶段中转染本发明的外源性DNA，可以确保对象哺乳动物生发细胞和体细胞全部存在。在通过DNA转染制备的动物的生发细胞中，存在本发明的外源性DNA是指制备动物的后代全都在其生发细胞和体细胞中保持有本发明的外源性DNA。继承了本发明外源性DNA的此种动物的子代在其生发细胞和体细胞中全都携带有本发明的外源性DNA。
转染了本发明外源性正常DNA的非人哺乳动物，在确认通过交配而稳定保持外源性DNA后，可以作为该DNA携带动物在常规饲养环境中传代饲养。
在受精卵细胞阶段中转染本发明的外源性DNA，可以确保该DNA在对象哺乳动物的全部生发细胞和体细胞中过量存在。在通过DNA转染制备的动物的生发细胞中过量存在本发明的外源性DNA是指，所制备动物的子代都在其全部生发细胞和体细胞中过量带有本发明的外源性DNA。继承了本发明外源性DNA的此种动物的子代在其全部生发细胞和体细胞中过量带有本发明的外源性DNA。
获得了同源染色体双方都携带转染DNA的纯合动物，通过该雌雄动物的交配可以使所有的子代都过量携带该DNA而繁殖传代。
在携带有本发明正常DNA的非人哺乳动物中，本发明的正常DNA高水平地表达，通过促进内源性正常DNA的功能而最终导致本发明的蛋白质功能亢进，从而可以用作该疾病的模型动物。例如，可以使用本发明正常DNA转染的动物，进行本发明蛋白质的功能亢进病症或与本发明蛋白质相关的疾病的病理机制的分析和这些疾病的治疗方法方面的研究。
另外，用本发明外源性正常DNA转染了的哺乳动物，由于有游离的本发明蛋白质增加的症状，因此也可以用于与本发明蛋白质相关的疾病的预防·治疗剂，例如癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)预防·治疗剂的筛选试验。
另一方面，携带有本发明外源性异常DNA的非人哺乳动物在通过交配确认稳定地保持了外源性DNA后，可以作为该DNA携带动物在常规的饲养环境中传代饲养。并且，可以将目的外源DNA重组到上述质粒中作为原料使用。具有启动子的DNA构建体可以通过常规的DNA工程技术制备。在受精卵细胞阶段转染本发明的异常DNA，可以确保其存在于对象哺乳动物的全部生发细胞和体细胞中。在通过DNA转染制备的动物的生发细胞中存在本发明的异常DNA是指，所制备动物的子代都在其全部生发细胞和体细胞中携带有本发明的异常DNA。继承了本发明外源性DNA的此种动物的子代在其所有生发细胞和体细胞中携带有本发明的异常DNA。获得了同源染色体双方都携带转染DNA的纯合动物，通过该雌雄动物的交配可以使所有的子代都携带该DNA而繁殖传代。
在携带有本发明异常DNA的非人哺乳动物中，本发明的异常DNA高水平地表达，通过抑制内源性正常DNA的功能而最终导致本发明蛋白质的功能失活型不应症(function inactive type inadaptability)，从而可以用作该疾病的模型动物。例如，可以使用本发明异常DNA转染的动物，进行本发明蛋白质功能失活型不应症的病理机制分析和该疾病的治疗方法方面的研究。
作为具体的利用可能性，本发明表达异常DNA高水平的动物，有望作为分析在本发明蛋白质功能失活型不应症中，本发明异常蛋白质导致的正常蛋白质功能抑制(显性阴性作用)的模型。
用本发明外源性正常DNA转染了的哺乳动物由于有游离的本发明蛋白质增加的症状，因此也可以用于本发明蛋白质或功能失活型不应症的预防台疗剂，例如癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)预防·治疗剂的筛选试验。
另外，作为上述两种本发明DNA转基因动物的其它利用可能性，考虑了例如：
(i)用作组织培养的细胞源；
(ii)通过直接分析本发明DNA转基因动物组织中的DNA或RNA，或分析DNA表达的肽组织，对与通过本发明蛋白质特异性表达或活化的肽之间的关联性进行阐明；
(iii)通过标准组织培养技术培养携带有DNA的组织细胞，应用这些，研究来源于通常难于培养的组织的细胞的功能；
(iv)使用上述(iii)所述的细胞，筛选提高细胞功能的药物；
(v)分离纯化本发明的变异蛋白质和制备其抗体。
并且，可以使用本发明的DNA转基因动物，研究包括本发明蛋白质功能失活型不应症在内的与本发明蛋白质相关的疾病的临床症状。还可以获得与本发明蛋白质相关的疾病模型的各器官中更加详细的病理学结果，从而开发新的治疗方法。另外，还可以对该疾病导致的继发疾病的研究和治疗作出贡献。
另外，从本发明DNA转基因动物切取各器官并切碎后，通过胰蛋白酶等蛋白质分解酶获得游离的DNA转染细胞，从而可以进行该细胞的培养或该培养细胞的系统化。并且，可以用于确定产生本发明蛋白质的细胞，研究与细胞凋亡、分化或增殖的关系或其中的信号转导机制，以研究它们的异常等，从而可以作为用于研究本发明蛋白质及其作用机制的有效研究材料。
进一步地，为了利用本发明的DNA转基因动物开发包括本发明蛋白质功能失活型不应症在内的与本发明蛋白质相关的治疗药物，用上述检测法和定量法可以有效并快速筛选该疾病治疗药物的方法。另外，还可以利用本发明的DNA转基因动物或本发明的外源性DNA表达载体研究、开发与本发明蛋白质相关的疾病的DNA疗法。
(8)敲除动物
本发明提供，携带失活了的本发明DNA非人哺乳动物胚胎干细胞和本发明DNA表达有缺陷的非人哺乳动物。
即，本发明提供：
(1)携带失活了的本发明DNA非人哺乳动物胚胎干细胞；
(2)上述(1)所述的胚胎干细胞，其中所述DNA通过转染报道基因(例如来源于大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因)而失活；
(3)上述(1)所述的胚胎干细胞，其具有新霉素耐药性；
(4)上述(1)所述的胚胎干细胞，其中非人哺乳动物为啮齿动物；
(5)上述(4)所述的胚胎干细胞，其中啮齿动物是小鼠；
(6)本发明DNA表达缺陷的非人哺乳动物，其中该DNA已经失活；
(7)上述(6)所述的非人哺乳动物，其中所述DNA通过转染报道基因(例如来源于大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因)而失活，该报道基因可以在本发明DNA的启动子的控制下表达；
(8)上述(6)所述的非人哺乳动物，其中非人哺乳动物为啮齿动物；
(9)上述(8)所述的非人哺乳动物，其中啮齿动物是小鼠；和
(10)一种筛选促进或抑制本发明DNA的启动子活性的化合物或其盐的方法，其特征在于，向述(7)所述的动物给予受试化合物，然后检测报道基因的表达。
本发明DNA失活了的非人哺乳动物胚胎干细胞是指下述非人哺乳动物的胚胎干细胞(以下简称为“ES”细胞)，即，向该哺乳动物携带的本发明DNA人为地施加变异，由此抑制DNA的表达能力；或通过实质性地使该DNA编码的本发明蛋白质丧失活性，使DNA基本上不具有表达本发明蛋白质的能力(以下有时称为“本发明的敲除DNA”)。
作为非人哺乳动物，使用与上述相同的动物。
向本发明DNA人为地施加变异的方法，包括例如通过基因工程方法删除该DNA序列中的一部分或全部，然后插入其它DNA或用其它DNA取代。通过这些变异，可以通过例如使密码子的读码框移位或破坏启动子或外显子的功能来制备本发明的敲除DNA。
携带失活的本发明DNA的非人哺乳动物胚胎干细胞(以下简称为“本发明DNA失活的ES细胞”或“本发明的敲除ES细胞”)可以通过例如下述方法获得：分离目的非人哺乳动物携带的本发明的DNA，向该动物的染色体中通过例如同源重组法转染具有如下所述构建的DNA序列的DNA链(以下简称为“目标载体”)，其中所述的构建的DNA序列是，通过向其外显子部分插入以新霉素耐药性基因、潮霉素(hygromycin)耐药性基因为代表的耐药性基因，或以lacZ(β-半乳糖苷酶基因)、cat(氯霉素乙酰转移酶基因)为代表的报道基因等，破坏外显子的功能，或在外显子之间的内含子部分插入终止基因转录的DNA序列(例如多聚腺苷酸添加信号(poly A additional signal)等)，从而不能合成完全信使RNA，结果导致基因破坏，而构建的DNA序列。所得的ES细胞用本发明DNA上或其附近的DNA序列作为探针通过Southern杂交进行分析，或用目标载体上的DNA序列与用于制备目标载体的本发明DNA以外的附近区域的DNA序列作为引物通过PCR法进行分析，以筛选本发明的敲除ES细胞。
通过同源重组法等使本发明DNA失活的亲代ES细胞，可以使用例如如上所述已经建立的细胞，也可以使用按照公知的Evans和Kaufman的方法新建立的细胞。例如，当为小鼠的ES细胞时，目前一般使用129系的ES细胞，但由于它们免疫学背景不明确，可以优选使用利用C57BL/6小鼠或BDFl小鼠(C57BL/6和DBA/2的F1)，其中后者通过与DBA/2杂交改善了C57BL/6小鼠采卵数较少，而不是获得具有清楚的免疫学基因背景等的纯系ES细胞。BDF1小鼠除了采卵数多并且卵健康的优点外，还具有下述优点，因此可以有利地利用，所述优点为：由于BDFl小鼠具有C57BL/6小鼠的背景，利用由其获得的ES细胞制作病理模型小鼠时，通过与C57BL/6小鼠回交可以将其遗传背景变成C57BL/6的遗传背景。
建立ES细胞时，一般使用受精后第3.5天的胚泡(胚盤胞)，但除此之外，可以在8细胞期采集胚，并培养到胚泡后再使用，由此可以高效地获得大量早期胚。
可以使用雌雄中任意一种的ES细胞，但通常雄性ES细胞在制备生殖细胞系嵌合体(germ cell line chimera)时是方便的。另外，为了减少烦杂的培养工序，优选尽早进行雌雄判别。
ES细胞雌雄的判定方法，作为其中的一例可以列举例出，通过PCR法扩增Y染色体上性别决定区域的基因并检测的方法。以往进行核型分析需要约106个细胞，但如果采用上述方法，则1个集落左右的ES细胞数(约50个)就足够了。因此可以通过雌雄判别在培养初期进行ES细胞的第一次筛选，从而可以通过在早期选定雄性细胞，由此能够大幅削减培养初期的工作。
另外，第二次筛选可以通过例如采用G-显带法确认染色体数量而进行。所得的ES细胞的染色体数优选为正常数量的100％，但由于建立时物理操作等方面的关系而难于得到染色体数正常的ES细胞时，优选在敲除ES细胞的基因后再次克隆到正常细胞(例如小鼠中染色体数为2n＝40的细胞)中。
如上获得的胚胎干细胞虽然通常增殖性很好，但由于容易丧失个体发育能力，因此必须严加注意地进行传代培养。例如，在STO成纤维细胞等适当的饲养细胞上，在LIF(1～10000U/ml)的存在下，在二氧化碳培养箱内(优选5％二氧化碳、95％空气；或5％氧气、5％二氧化碳和90％空气)在大约37℃进行培养；传代培养时，用胰蛋白酶/EDTA溶液(通常为0.001～0.5％胰蛋白酶/0.1～5mM EDTA，优选约0.1％胰蛋白酶/1mM EDTA)处理以获得单细胞，然后接种到新准备的饲养细胞上的方法。这样的传代通常每隔1～3天进行，此时观察细胞，发现形态异常的细胞时优选放弃该培养细胞。
通过ES细胞在适当条件下单层培养到达到高密度，或悬浮培养到形成细胞聚集块，其可以分化成体壁(pariental)肌、内脏肌和心肌等各种类型的细胞[M.J.Evans and M.H.Kaufman，Nature，
292，154，1981；G R.Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，
78，7634，1981；T.C.Doetschman等Journal ofEmbryology Experimental Morphology，
87，27，1985]。使本发明ES细胞分化获得的本发明DNA表达缺陷细胞，在本发明蛋白质的体外细胞生物学研究中是有用的。
本发明的DNA表达缺陷非人哺乳动物可以通过采用公知方法测定该动物的mRNA水平，并间接地比较其表达量，由此与正常动物区别开来。
该非人哺乳动物使用与上述相同的动物。
本发明DNA表达缺陷非人哺乳动物可以通过例如下述方法敲除本发明的DNA，即，将上述制备的目标载体转染到小鼠胚胎干细胞或小鼠卵细胞中，并进行同源重组，其中携带失活的本发明DNA的目标载体的DNA序列，通过基因同源重组与小鼠胚胎干细胞或小鼠卵细胞染色体上的本发明DNA交换，通过该同源基因重组可以敲除本发明的DNA。
敲除了本发明DNA的细胞可以通过以本发明DNA上或其附近的DNA序列为探针的Southern杂交分析进行确定，或可以通过PCR法分析进行确定，该PCR法中使用目标载体上的DNA序列和用于目标载体的小鼠来源的本发明DNA以外的附近区域的DNA序列作为引物。使用非人哺乳动物胚胎干细胞时，通过基因同源重组使携带失活的本发明DNA的细胞株被克隆，将所得克隆注入在适当的时期，例如8细胞期的非人哺乳动物胚或胚泡中，将所制成的嵌合胚移植到假孕的该非人哺乳动物的子宫内。所得的动物是由具有正常的本发明DNA基因座的细胞和具有人为变异了的本发明DNA基因座的细胞两者所构成的嵌合动物。
当该嵌合动物的一部分生发细胞具有变异了的本发明DNA基因座时，从这种嵌合个体与正常个体交配得到的个体群中，通过例如判断外被颜色(coat color)等选择所有组织是由人为施加了变异的本发明DNA基因座的细胞构成的个体。这样获得的个体通常是本发明蛋白质杂合表达缺陷个体，本发明蛋白质杂合表达缺陷个体之间进行交配，可以由它们的子代得到本发明蛋白质的纯合表达缺陷个体。
使用卵细胞时，例如，通过微量注射法向卵细胞核内注入DNA溶液，由此可以获得染色体内转染了目标载体的转基因非人哺乳动物。从这些转基因非人哺乳动物中，通过基因同源重组可以选择本发明DNA基因座中带有变异的动物。
如上所述敲除了本发明DNA的个体，确认了通过交配所得的动物个体也敲除了该DNA后，可以在常规的饲养环境中进行饲养传代。
并且，生殖系统也可以根据常规方法获得并保持。即，通过带有该失活DNA的雌雄动物的交配，可以获得同源染色体双方都携带该失活DNA的纯合动物。所得的纯合动物可以通过饲养由母体动物得到1个正常个体和多个纯合子而高效地获得。通过雌雄杂合动物之间的交配，使携带该失活DNA的纯合和杂合动物繁殖传代。
携带失活的本发明DNA的非人哺乳动物胚胎干细胞在制作本发明DNA表达缺陷非人哺乳动物中是非常有用的。
另外，本发明DNA表达缺陷非人哺乳动物由于缺失了由本发明蛋白质衍生的多种生物活性，因此可以作为因本发明蛋白质生物活性失活引起的疾病的动物模型，对研究这些疾病的原因和治疗方法有用。
(8a)对本发明DNA缺失或损伤等引起的疾病具有治疗、预防效果的化合物的筛选方法
本发明DNA表达缺陷非人哺乳动物可以用于筛选对本发明DNA缺失或损伤等引起的疾病具有治疗、预防效果的化合物。
即，本发明提供筛选对因本发明DNA缺失或损伤等引起的疾病，例如癌症等，具有治疗、预防效果的化合物或其盐的方法，其特征在于，给本发明DNA表达缺陷非人哺乳动物施用受试化合物，并观察、测定该动物的变化。
在该筛选方法中使用的本发明DNA表达缺陷非人哺乳动物与上述相同。
受试化合物可以列举例如肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液和血浆等，这些化合物可以是新化合物，也可以是已知化合物。
具体地，可以将本发明DNA表达缺陷非人哺乳动物用受试化合物处理，并与未处理的对照动物进行比较，以该动物的各器官、组织和疾病症状等的变化为指标，评价受试化合物的治疗、预防效果。
作为用受试化合物处理试验动物的方法，例如，可以通过口服给药、静脉注射等，根据试验动物的症状、受试化合物的性质等进行适当选择。另外，受试化合物的给药量可以根据给药方法、受试化合物的性质等适当选择。
例如，筛选对癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)具有预防·治疗效果的化合物时，向本发明DNA表达缺陷非人哺乳动物施用受试化合物，在上述组织中经时观察，与未施用受试化合物的动物组在癌症发病程度或癌症治愈程度上的差异。
在上述筛选方法中，向试验动物施用受试化合物时，如果该试验动物的上述疾病症状得到约10％或更多、优选约30％或更多、更优选约50％或更多的改善，则可以将该受试化合物选作对上述疾病具有治疗、预防效果的化合物。
可以使用该筛选方法的化合物是选自上述受试化合物的化合物，该化合物对因本发明蛋白质的缺损和损伤等引起的疾病具有治疗、预防效果，因此可以作为针对该疾病的安全、低毒性预防·治疗剂等药物使用。另外，由通过上述筛选方法获得的化合物衍生的化合物同样也可以使用。
通过上述筛选方法获得的化合物可以形成盐。作为该化合物的盐，使用与生理学上允许的酸(例如无机酸、有机酸等)或碱(例如碱金属等)的盐，特别优选生理学上允许的酸加成盐。这种盐包括例如与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸和硫酸等)的盐，或与有机酸(例如醋酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、枸橼酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸和苯磺酸等)的盐等。
含有通过上述筛选方法获得的化合物或其盐的药物，可以与上述含有本发明蛋白质的药物同样地制备。
这样得到的制剂安全、毒性低，因此可以向人或哺乳动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、羊、猪、牛、马、猫、狗和猴等)施用。
该化合物或其盐的给药量因对象疾病、给药对象、给药途径等而异。例如，口服给药该化合物时，一般成人(以体重60kg计)乳腺癌患者每天服用该化合物约0.1～100mg，优选约1.0～50mg，更优选约1.0～20mg。非口服给药时，该化合物的单次给药量因给药对象和对象疾病等而异。例如，普通成人(以体重60kg计)乳腺癌患者以注射剂的形式施用该化合物时，每天通过静脉注射施用该化合物约0.01～30mg，优选约0.1～20mg，更优选约0.1～10mg。对其它动物，可以按照换算成每60kg体重的量施用。
(8b)促进或抑制本发明DNA启动子活性的化合物的筛选方法
本发明提供筛选促进或抑制本发明DNA启动子活性的化合物的方法，其特征在于，向本发明DNA表达缺陷非人哺乳动物施用受试化合物，并检测报道基因的表达。
在上述筛选方法中，作为本发明DNA表达缺陷非人哺乳动物，使用在上述本发明DNA表达缺陷非人哺乳动物中，通过转染报道基因使本发明DNA失活、并且该报道基因可以在本发明DNA启动子的控制下进行表达的动物。
受试化合物与上述相同。
报道基因使用与上述相同的报道基因，优选β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、可溶性碱性磷酸酯酶基因和荧光素酶基因等。
在本发明DNA被报道基因取代了的本发明DNA表达缺陷非人哺乳动物中，由于报道基因在本发明DNA启动子的支配下存在，因此可以通过探测(trace)报道基因编码的物质的表达，来检测启动子的活性。
例如，用来源于大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)取代编码本发明蛋白质的DNA区域的一部分时，在本来表达本发明蛋白质的组织中表达β-半乳糖苷酶，而不是本发明蛋白质。因此，通过使用例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-半乳吡喃糖苷(galactopyranoside)(X-gal)等作为β-半乳糖苷酶基质的试剂进行染色，可以简便地观察本发明蛋白质在动物机体内的表达状况。具体地，将本发明蛋白质缺失的小鼠或其组织切片用戊二醛等固定，用磷酸缓冲生理盐水(PBS)洗涤后，与包含X-gal的染色液在室温或37℃附近反应约30分钟～1小时，组织标本用1mM EDTA/PBS溶液洗涤，由此终止β-半乳糖苷酶反应，如果观察到显色则可。另外，也可以根据常规方法检测编码lacZ的mRNA。
可以使用该筛选方法的化合物或其盐，是选自上述受试化合物的化合物，该化合物是促进或抑制本发明DNA的启动子活性的化合物。
通过上述筛选方法获得的化合物可以形成盐。作为该化合物的盐，使用与生理学上允许的酸(例如无机酸等)或碱(例如碱金属等)的盐，特别优选生理学上允许的酸加成盐。这种盐包括例如与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸和硫酸等)的盐，或与有机酸(例如醋酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、枸橼酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸和苯磺酸等)的盐等。
抑制本发明DNA启动子活性的化合物或其盐，由于可以抑制本发明蛋白质的表达、抑制该蛋白质的功能，因此可以作为癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)的预防·治疗剂。
另外，由通过上述筛选方法获得的化合物衍生的化合物同样也可以使用。
含有通过上述筛选方法获得的化合物或其盐的药物，可以与上述含有本发明蛋白质或其盐的药物同样地制备。
这样得到的制剂安全、毒性低，因此可以向人或哺乳动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、羊、猪、牛、马、猫、狗和猴等)施用。
该化合物或其盐的给药量因对象疾病、给药对象、给药途径等而异。例如，口服给药抑制本发明DNA启动子活性的化合物时，一般成人(以体重60kg计)乳腺癌患者每天服用该化合物约0.1～100mg，优选约1.0～50mg，更优选约1.0～20mg。非口服给药时，该化合物的单次给药量因给药对象和对象疾病等而异。例如，普通成人(以体重60kg计)乳腺癌患者以注射剂的形式施用抑制本发明DNA启动子活性的化合物时，每天通过静脉注射施用该化合物约0.01～30mg，优选约0.1～20mg，更优选约0.1～10mg。对其它动物，可以施用以每60kg体重换算的量。
这样，本发明DNA表达缺陷非人哺乳动物，对筛选促进或抑制本发明DNA启动子活性的化合物或其盐是极其有用的，可以对因本发明DNA表达缺陷引起的各种疾病的病因研究或预防·治疗剂的开发作出很大贡献。
另外，如果使用含有本发明蛋白质启动子区域的DNA，在其下游连接编码各种蛋白质的基因，并将其注入动物卵细胞中，从而制备所谓的转基因动物(基因转染动物)，则还可以特异性地合成其蛋白质，并研究其在机体中的作用。进一步地，如果在上述启动子部分结合适当的报道基因，并构建表达该基因的细胞株，则其可以作为下述低分子化合物的研究体系而使用，其中所述低分子化合物具有特异性促进或抑制本发明蛋白质本身在体内的产生能力的作用。
在本说明书中，碱基或氨基酸等用简写表示时，该简写是根据IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature的简写或本领域常用的简写，其例子如下所示。另外，对于氨基酸，存在光学异构体时，除非另有说明，表示L型。
DNA： 脱氧核糖核酸
cDNA： 互补脱氧核糖核酸
A： 腺嘌呤
T： 胸腺嘧啶
G： 鸟嘌呤
C： 胞嘧啶
RNA： 核糖核酸
mRNA： 信使核糖核酸
dATP： 脱氧腺苷三磷酸
dTTP： 脱氧胸苷三磷酸
dGTP： 脱氧鸟苷三磷酸
dCTP： 脱氧胞苷三磷酸
ATP： 腺苷三磷酸
EDTA： 乙二胺四乙酸
SDS： 十二烷基硫酸钠
Gly： 甘氨酸
Ala： 丙氨酸
Val： 缬氨酸
Leu： 亮氨酸
Ile： 异亮氨酸
Ser： 丝氨酸
Thr： 苏氨酸
Cys： 半胱氨酸
Met： 蛋氨酸
Glu： 谷氨酸
Asp： 天冬氨酸
Lys： 赖氨酸
Arg： 精氨酸
His： 组氨酸
Phe： 苯丙氨酸
Tyr： 酪氨酸
Trp： 色氨酸
Pro： 脯氨酸
Asn： 天冬酰胺
Gln： 谷氨酰胺
pGlu： 焦谷氨酸
Sec ： 硒代半胱氨酸(selenocysteine)
另外，本说明书中常用的取代基、保护基团和试剂用下列符号表示：
Me： 甲基
Et： 乙基
Bu： 丁基
Ph： 苯基
TC： 噻唑烷-4(R)-羧酰氨基
Tos： 对甲苯磺酰
CHO ： 甲酰基
Bzl： 苄基
Cl2-Bzl：2，6-二氯苄基
Bom： 苄氧基甲基
Z： 苄氧羰基
Cl-Z： 2-氯苄氧羰基
Br-Z： 2-溴苄基氧基羰基
Boc： 叔丁氧羰基
DNP： 二硝基苯酚
Trt： 三苯甲基
Bum： 叔丁氧甲基
Fmoc： N-9-芴基甲氧羰基
HOBt： 1-羟基苯并三唑
HOOBt：3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三唑
HONB： 1-羟基-5-降冰片烯-2，3-二羧基酰亚胺
DCC： N，N′-二环己基碳化二亚胺
本说明书中序列表的序列号表示以下的序列。
[序列号：1]
表示SEMA4B的氨基酸序列。
[序列号：2]
表示编码具有序列号：1所示氨基酸序列的SEMA4B的DNA的碱基序列。
[序列号：3]
表示包含编码SEMA4B全长基因的DNA的碱基序列。
[序列号：4]
表示SEMA4B-M1的氨基酸序列。
[序列号：5]
表示编码具有序列号：4所示氨基酸序列的SEMA4B-M1的DNA的碱基序列。
[序列号：6]
表示包含编码SEMA4B-M1全长基因的DNA的碱基序列。
[序列号：7]
表示SEMA4B-M2的氨基酸序列。
[序列号：8]
表示编码具有序列号：7所示氨基酸序列的SEMA4B-M2的DNA的碱基序列。
[序列号：9]
表示包含编码SEMA4B-M2全长基因的DNA的碱基序列。
[序列号：10]
表示SEMA4B-M3的氨基酸序列。
[序列号：11]
表示编码具有序列号：10所示氨基酸序列的SEMA4B-M3的DNA的碱基序列。
[序列号：12]
表示包含编码SEMA4B-M3全长基因的DNA的碱基序列。
[序列号：13]
表示实施例2、3、15和16中使用的反义寡核苷酸的碱基序列。
[序列号：14]
表示实施例2、3、15和16中使用的寡核苷酸的碱基序列。
[序列号：15]
表示实施例3中使用的反义寡核苷酸的碱基序列。
[序列号：16]
表示实施例3中使用的寡核苷酸的碱基序列。
[序列号：17]
表示实施例3中使用的引物的碱基序列。
[序列号：18]
表示实施例3中使用的引物的碱基序列。
[序列号：19]
表示实施例4、6和7中使用的引物的碱基序列。
[序列号：20]
表示实施例4和7中使用的引物的碱基序列。
[序列号：21]
表示实施例6中使用的引物的碱基序列。
[序列号：22]
表示实施例8中使用的肽1的氨基酸序列。
[序列号：23]
表示实施例8中使用的肽2的氨基酸序列。
[序列号：24]
表示实施例8中使用的肽3的氨基酸序列。
[序列号：25]
表示实施例8中使用的肽4的氨基酸序列。
后述实施例4中获得的转化体大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10/SEMA4B-M1/pCR4-TOPO从2003年3月4日起保藏在日本茨城县Tsukuba市东1丁目1番地1中央第6(邮编305-8566)的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心，保藏号为FERM BP-8316。
后述实施例4中获得的转化体大肠杆菌TOP10/SEMA4B-M2/pCR4-TOPO从2003年3月4日起保藏在日本茨城县Tsukuba市东1丁目1番地1中央第6(邮编305-8566)的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心，保藏号为FERM BP-8317。
后述实施例4中获得的转化体大肠杆菌TOP 10/SEMA4B-M3/pCR4-TOPO从2003年3月4日起保藏在日本茨城县TSukuba市东1段1号1中央第6(邮编305-8566)的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心，保藏号为FERM BP-8318。
以下通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。
实施例1
基因表达解析
为了明确在肺癌组织中的特异性表达亢进的基因组，以从肺癌组织4例、正常肺组织5例中提取的总RNA(total RNA)(表1)作为材料，用寡核苷酸微阵列(oligonucleotide microarray)(Human Genome U95A，U95B，U95C，U95D，U95E；Affymetrix公司)进行基因表达解析。实验根据Affymetrix公司的实验手册进行(Expression Analysis Technical Manual)。
结果在肺癌组织3例(lot.0011-192-01285、lot.0011-192-01293和lot.0011-192-01297)检测出了Semaphorin 4B(SEMA4B)和后述实施例4中记载的Semaphorin 4B-M1(SEMA4B-M1)、Semaphorin 4B-M2(SEMA4B-M2)以及Semaphorin 4B-M3(SEMA4B-M3)基因的表达亢进(表2)。
[表1]
| 提取了RNA的组织 | 销售单位 |
| 肺癌组织(lot.0009-192-00122)肺癌组织(lot.0011-192-01285)肺癌组织(lot.0011-192-01293)肺癌组织(lot.0011-192-01297)正常肺组织(lot.0009-192-00150)正常肺组织(lot.0009-192-00168)正常肺组织(lot.0011-192-01283)正常肺组织(lot.0011-192-01285)正常肺组织(lot.0011-192-01297) | BioClinical Partners，Inc.BioClinical Partners，Inc.BioClinical Partners，Inc.BioClinical Partners，Inc.BioClinical Partners，Inc.BioClinical Partners，Inc.BioClinical Partners，Inc.BioClinical Partners，Inc.BioClinical Partners，Inc. |
[表2]
| 组织 | 基因表达量 |
| 肺癌组织(lot.0009-192-00122)肺癌组织(lot.0011-192-01285)肺癌组织(lot.0011-192-01293)肺癌组织(lot.0011-192-01297)正常肺组织(lot.0009-192-00150)正常肺组织(lot.0009-192-00168)正常肺组织(lot.0011-192-01283)正常肺组织(lot.0011-192-01285)正常肺组织(lot.0011-192-01297) | ND109.51.9NDNDNDNDND |
基因表达量以用寡核苷酸微点阵检测出了基因表达的全部基因的表达量的中间值为1进行标准化。
ND：未检测出
实施例2
人肺癌细胞株的细胞凋亡诱导
通过抑制SEMA4B和后述实施例4中记载的SEMA4B-M1、SEMA4B-M2和SEMA4B-M3基因的表达，研究是否诱导人肺癌细胞株的细胞凋亡。
首先，将从American Type Culture Collection(ATCC)购入的人非小细胞肺癌细胞株NCI-H1703悬浮在加入了10％胎牛血清(ATCC)的RPMI-1640培养基中(包含25mM HEPES)(Invitrogen Corp.)，然后以1万个细胞/孔的细胞密度(培养基液体的量：0.1ml)接种到96孔平底组织培养板中(BD Falcon社)。在5％二氧化碳气流中在37℃培养一晚后，用反义寡核苷酸转染。
具体地，在设计可以与具有序列号：1、序列号：4、序列号：7和序列号：10所示的氨基酸序列的蛋白质的3′非翻译区域序列杂交的反义寡核苷酸序列(序列号：13)后，合成硫代磷酸化的寡核苷酸，通过HPLC纯化后用于转染实验(以下简称为“反义寡核苷酸)。作为对照，同法将序列号：13所示碱基序列的反向序列(序列号：14)硫代磷酸化，通过HPLC纯化后使用(以下简称为“对照寡核苷酸”)。
将用Opti-MEM(Invitrogen Corp.)稀释了的反义寡核苷酸或对照寡核苷酸与用Opti-MEM(Invitrogen Corp.)稀释至5倍并在室温放置了5分钟的Oligofectamine(Invitrogen Corp.)以8∶3的比例(体积比)混合，并以40μL/孔的比例添加到板上。进行调节使寡核苷酸的最终浓度达到250nM。在上述条件下继续培养3天后，用Cell Death Detection ELISAPLUS试剂盒(RocheDiagnostics)，根据其随附的说明书测定上述两种寡核苷酸的细胞凋亡诱导活性。
结果反义寡核苷酸(序列号：13)与对照寡核苷酸(序列号：14)相比，显示出约1.6倍的细胞凋亡诱导活性，表明具有统计学显著差异(P≤0.01)(表3)。
[表3]
| 细胞凋亡诱导活性(A405-A492) | ||
| 平均值 | 标准偏差 | |
| 空白 | 0.212 | 0.032 |
| 对照寡核苷酸(序列号：14) | 0.410 | 0.017 |
| 反义寡核苷酸(序列号：13) | 0.538 | 0.035 |
实施例3
SEMA4B反义寡核苷酸导致的基因表达量降低
研究施用反义寡核苷酸是否导致SEMA4B基因和后述实施例4中记载的SEMA4B-M1、SEMA4B-M2和SEMA4B-M3基因的表达量降低。
将实施例2中使用的人非小细胞肺癌细胞株NCI-H1703悬浮在与实施例2中相同的培养基中，并以6万个细胞/孔的细胞密度(培养基液体的量：0.6ml)接种到24孔平底组织培养板(BD Falcon社)中。在5％二氧化碳气流中在37℃培养一晚后，按照实施例2中的方法接种反义寡核苷酸。但寡核苷酸的添加量为240μL/孔，并且使用两种反义寡核苷酸(序列号：13和序列号：15)和两种对照寡核苷酸(序列号：14和序列号：16)。
关于来源于序列号：15和序列号：16的反义寡核苷酸和对照寡核苷酸，在设计与具有序列号：1、序列号：4、序列号：7和序列号：10的氨基酸序列的蛋白质的3＇非翻译区域序列杂交的反义寡核苷酸序列(序列号：15)后，合成硫代磷酸化的寡核苷酸，通过HPLC纯化后用于转染实验。同法将序列号：15所示碱基序列的反向序列(序列号：16)硫代磷酸化，并通过HPLC纯化后使用。
转染后，在5％二氧化碳气流中在37℃继续培养24小时。然后用RNeasy(注册商标)Mini Total RNA Kit(QIAGEN)提取总RNA(total RNA)。用大约300ng的总RNA作为模板，用TaqMan Reverse Transcription Reagents(Applied Biosystems)根据其随附的说明书进行逆转录反应。以转变成总RNA时相当于7～9ng的cDNA作为模板，用两种引物(序列号：17)和序列号：18)和SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)测定SEMA4B、SEMA4B-M1、SEMA4B-M2和SEMA4B-M3的表达拷贝数。用TaqManβ-actin Control Reagents(Applied Biosystems)测定相同量的模板cDNA中所含的β-肌动蛋白基因表达量作为内部标准。
用蒸馏水代替寡核苷酸溶液时(以下简称为“非转染组”)，SEMA4B、SEMA4B-M1、SEMA4B-M2和SEMA4B-M3基因的表达量总和为β-肌动蛋白基因表达量的6.6％，而反义寡核苷酸(序列号：13和序列号：15)给药组为0.98％和1.1％，确认基因表达量具有统计学显著差异水平的(P≤0.05)降低。
另一方面，对照寡核苷酸(序列号：14和序列号：16)给药组的表达量为4.1％和3.4％，确认与非转染组相比基因表达量具有统计学显著差异水平的降低。
由此可知，SEMA4B、SEMA4B-M1、SEMA4B-M2和SEMA4B-M3基因的表达抑制与细胞凋亡的诱导相关。
实施例4
编码SEMA4B、SEMA4B-M1、SEMA4B-M2和SEMA4B-M3的cDNA的克隆和碱基序列确定
以来源于人肺癌细胞株(A549)的Marathon-Ready cDNA(CLONTECH社)作为模板，用两种引物(序列号：19和序列号：20)进行PCR反应。该反应液50μl由1μl上述cDNA、2.5U PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase(STRATAGENE社)、各1.0μM的引物(序列号：19和序列号：20)、200μMdNTPs和25μl 2×GC Bufffer I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)组成。PCR反应在95℃进行1分钟后，反复进行以下循环30次：在95℃反应1分钟、在60℃反应1分钟、在72℃反应4分钟，循环后进一步在72℃进行5分钟伸长反应。为了在PCR产物的3′末端添加dATP，加入5U的Ex Taq DNA聚合酶(TakaraShuzo Co.，Ltd.)并在72℃保温7分钟。所得的PCR反应产物用PCRPurification Kit(QIAGEN)纯化，并按照TOPO TA PCR Cloning Kit(InvitrogenCorp.)的方案将其亚克隆到质粒载体pCR4-TOPO(Invitrogen Corp.)。将该克隆转染到大肠杆菌TOP10后，在包含氨苄西林的LB琼脂培养基中筛选携带cDNA的克隆。分析各克隆的碱基序列，结果分别获得序列号：2、序列号：5、序列号：8和序列号：11所示的cDNA碱基序列。
将SEMA4B基因(GenBank Accession No.XM_044533基因)碱基序列中的第1-237和第2749-3766碱基序列分别添加到序列号：2、序列号：5、序列号：8和序列号：11所示碱基序列5′末端和3′末端，分别如序列号：3、序列号：6、序列号：9和序列号：12所示。
序列号：2所示碱基序列编码的氨基酸序列(序列号：1)与SEMA4B基因(GenBank Accession No.XM_044533基因)编码的SEMA4B蛋白质完全一致。
分别将含有序列号：5所示碱基序列编码的氨基酸序列(序列号：4)的蛋白质命名为SEMA4B-M1、含有序列号：8所示碱基序列编码的氨基酸序列(序列号：7)的蛋白质命名为SEMA4B-M2、合有序列号：11所示碱基序列编码的氨基酸序列(序列号：10)的蛋白质命名为SEMA4B-M3。
在SEMA4B-M1的氨基酸序列(序列号：4)中，SEMA4B的氨基酸序列(序列号：1)第208位的Ser被Ile取代。
在编码SEMA4B-M1的DNA的碱基序列(序列号：5)中，编码SEMA4B的DNA碱基序列(序列号：2)第90位的g被a取代、第111位的g被a取代、第623位的g被t取代。第623位的取代伴随着氨基酸取代。
SEMA4B-M2的氨基酸序列(序列号：7)中，SEMA4B的氨基酸序列(序列号：1)第163位的Met被Ile取代。
在编码SEMA4B-M2的DNA的碱基序列(序列号：8)中，编码SEMA4B的DNA的碱基序列(序列号：2)第150位的g被a取代、第489位的g被a取代、第528位的c被t取代、第1266的t被c取代、第1588的c被a取代、第2343位的a被g取代，第489位的取代伴随着氨基酸取代。
在SEMA4B-M3的氨基酸序列(序列号：10)中，SEMA4B的氨基酸序列(序列号：1)第364位的Lys被Asn取代。
在编码SEMA4B-M3的DNA的碱基序列(序列号：11)中，编码SEMA4B的DNA的碱基序列(序列号：2)第1092位的g被t取代，并伴随着氨基酸取代。
分别将携带具有序列号：2所示碱基序列的DNA的质粒命名为SEMA4B/pCR4-TOPO、携带具有序列号：5所示碱基序列的DNA的质粒命名为SEMA4B-M1/pCR4-TOPO、携带具有序列号：8所示碱基序列的DNA的质粒命名为SEMA4B-M2/pCR4-TOPO、携带具有序列号：11所示碱基序列的DNA的质粒命名为SEMA4B-M3/pCR4-TOPO。
并且，将转染了质粒SEMA4B/pCR4-TOPO的转化体、转染了质粒SEMA4B-M1/pCR4-TOPO的转化体、转染了质粒SEMA4B-M2/pCR4-TOPO的转化体和转染了质粒SEMA4B-M3/pCR4-TOPO的转化体分别命名为大肠杆菌TOP 10/SEMA4B/pCR4-TOPO、大肠杆菌TOP10/SEMA4B-M1/pCR4-TOPO大肠杆菌TOP10/SEMA4B-M2/pCR4-TOPO和大肠杆菌TOP10/SEMA4B-M3/pCR4-TOPO。
实施例5
人培养细胞株中基因表达量的研究
以下使用的脑肿瘤细胞系SK-N-MC、SK-N-AS、SK-N-BE、SK-N-DZ、SK-N-FI、SK-N-SH、D341Med、Daoy、DBTRG-05MG、U-118MG、U-87MG、CCF-STTG1和SW 1088；人乳腺癌细胞株HCC1937、ZR-75-1、AU565、MCF-7和MDA-MB-231；人结肠癌细胞株Caco-2、COLO201、COLO 205、COLO 320DM、HCT-8、HT-29、LoVo、LS123、SNU-C1、SK-CO-1、SW 403、SW 48、SW 480、SW 620、SW 837和SW 948；人胎儿肾脏细胞株HEK293；人小细胞肺癌细胞株NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、NCI-H889、NCI-H1672、NCI-H1836、NCI-H2227、NCI-N417和SHP-77：人非小细胞肺癌株A549、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H358、NCI-H460、NCI-H522、NCI-H661、NCI-H810、NCI-H1155、NCI-H1299、NCI-H1395、NCI-H1417、NCI-H1435、NCI-H1581、NCI-H1651、NCI-H1703、NCI-H1793、NCI-H1963、NCI-H2073、NCI-H2085、NCI-H2106、NCI-H2228、NCI-H2342和NCI-H2347；人卵巢癌细胞株ES-2、Caov-3、MDAH2774、NIH：OVCAR3、OV-90、SK-OV-3、TOV-112D和TOV-21G；人胰腺癌细胞株PANC-1、MIA-PaCa-2、AsPC-1、BxPC-3、Capan-1和Capan-2；人前列腺癌细胞株DU145；人视网膜细胞瘤细胞株WERI-Rb-1和Y79；以及人睾丸癌细胞株Cates-1B一共86株从ATCC购入。人正常气管上皮细胞SAEC和人正常前列腺上皮细胞HprEC从Clonetics公司购入。人结肠癌细胞株COCM1、人非小细胞肺癌细胞株VMRC-LCD和人前列腺癌细胞株PC3从JCRB购入。这些细胞株有时在实施例9以后的实施例在也使用。
用RNeasy Mini Total RNA Kit(QIAGEN)由上述91株细胞株制备总RNA。以该总RNA为模板，通过采用随机引物的逆转录反应制备cDNA，通过进行定量的PCR反应检测SEMA4B基因(序列号：2)、SEMA4B-M1基因(序列号：5)、SEMA4B-M2基因(序列号：8)和SEMA4B-M3基因(序列号：11)的表达量。
上述PCR反应中，使用由上述总RNA 3～4ng得到的cDNA作为模板，在与实施例3相同的条件下进行PCR反应，算出SEMA4B、SEMA4B-M1、SEMA4B-M2和SEMA4B-M3基因的表达拷贝数。与此平行地，用TaqManTMHuman β-actin Control Reagents(Applied Biosystems)算出上述总RNA中所含的β-肌动蛋白基因的拷贝数作为内部标准。
上述基因总表达量与β-肌动蛋白基因表达量进行标准化所得的相对表达率如表4所示。
发现上述基因总表达量超过β-肌动蛋白基因表达量1％的癌细胞株17株，从而确认上述基因在癌细胞株中高水平地表达。
[表4]
| 细胞株 | β-肌动蛋白的百分率(％) | 细胞株 | β-肌动蛋白的百分率(％) | 细胞株 | β-肌动蛋白的百分率(％) |
| SK-N-MC | 0.02 | COLO 201 | 0.66 | NCI-H889 | 0.07 |
| SK-N-AS | 0.07 | COLO 205 | 0.40 | NCI-H1672 | 0.10 |
| SK-N-BE | 0.04 | COLO 320DM | 0.12 | NCI-H1836 | 0.08 |
| SK-N-DZ | 0.05 | HCT-8 | 0.36 | NCI-H2227 | 0.15 |
| SK-N-FI | 0.20 | HT-29 | 0.52 | NCI-N417 | 0.04 |
| SK-N-SH | 0.11 | LoVo | 0.58 | SHP-77 | 0.16 |
| D341Med | 0.05 | LS123 | 0.04 | A549 | 0.35 |
| Daoy | 0.08 | SNU-C1 | 0.52 | NCI-H23 | 0.98 |
| DBTRG-05MG | 0.01 | SK-CO-1 | 0.45 | NCI-H226 | 0.04 |
| U-118MG | 0.01 | SW 403 | 0.31 | NCI-H358 | 1.09 |
| U-87MG | 0.20 | SW 48 | 0.06 | NCI-H460 | 0.08 |
| CCF-STTG1 | 0.23 | SW 480 | 0.03 | NCI-H522 | 0.05 |
| SW 1088 | 0.06 | SW 620 | 0.12 | NCI-H661 | 0.05 |
| HCC1937 | 0.17 | SW 837 | 0.59 | NCI-H810 | 0.03 |
| ZR-75-1 | 0.30 | SW 948 | 0.18 | NCI-H1155 | 0.07 |
| AU565 | 0.06 | HEK293 | 0.05 | NCI-H1299 | 0.10 |
| MCF-7 | 0.06 | SAEC | 1.73 | NCI-H1395 | 0.39 |
| MDA-MB-231 | 0.06 | NCI-H187 | 0.38 | NCI-H1417 | 0.21 |
| Caco-2 | 0.04 | NCI-H378 | 0.17 | NCI-H1435 | 0.26 |
| COCM1 | 0.10 | NCI-H526 | 0.14 | NCI-H1581 | 0.16 |
| NCI-H1651 | 1.03 | ES-2 | 0.02 | BxPC-3 | 0.17 |
| NCI-H1703 | 0.21 | Caov-3 | 0.13 | Capan-1 | 0.07 |
| NCI-H1793 | 0.29 | MDAH2774 | 0.37 | Capan-2 | 0.27 |
| NCI-H1963 | 0.12 | NIH:OVCAR3 | 0.14 | HPrEC | 2.87 |
| NCI-H2073 | 0.15 | OV-90 | 0.23 | DU 145 | 3.05 |
| NCI-H2085 | 0.02 | SK-OV-3 | 2.44 | PC3 | 0.43 |
| NCI-H2106 | 0.07 | TOV-112D | 0.06 | WERI-Rb-l | 0.90 |
| NCI-H2228 | 1.89 | TOV-2lG | 1.00 | Y79 | 0.06 |
| NCI-H2342 | 0.18 | PANC-1 | 1.88 | Cares-lB | 0.01 |
| NCI-H2347 | 0.24 | MIA-PaCa-2 | 0.02 | ||
| VMRC-LCD | 0.09 | AsPC-1 | 0.24 |
实施例6
重组型全长蛋白质的动物细胞用表达载体的构建
以实施例4中获得的质粒SEMA4B/pCR4-TOPO为模板通过PCR扩增SEMA4B基因。该反应中的反应液的组成如下：使用2ng的SEMA4B/pCR4-TOPO作为模板，加入Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase(STRATAGENE)2.5U，两种引物(序列号：19和序列号：21)各1μM、dNTPs200μM和10×Pfu Buffer 5μl，使液体量达到50μl。PCR在95℃进行1分钟后，重复以下循环25次：95℃，1分钟；60℃，1分钟；和72℃，4分钟。然后用PCR Purification Kit(QIAGEN)纯化该PCR反应产物，接着用限制酶XbaI和Eco RI处理。质粒p3xFLAG-CMV-14(Sigma)也用XbaI和Eco RI处理。各DNA片段用PCR Purification Kit纯化，并用DNA Ligation Kit ver.2(Takara Bio，Inc.)进行连接反应。将连接反应液转染大肠杆菌TOP10后，在包含氨苄西林的LB培养基中筛选转化了的大肠杆菌，并分析各克隆，结果表明得到包含相当于SEMA4B基因(序列号：2)的cDNA片段的质粒pCMV-14-SEMA4B。
实施例7
带标记的重组型全长蛋白质的动物细胞用表达载体的构建
构建表达在SEMA4B蛋白质的C末端融合了3xFLAG标记的蛋白质的动物细胞用表达载体。除了将通过PCR扩增SEMA4B基因时所用的引物对，变成其它的引物对(序列号：19和序列号：20)之外，按照实施例6中记载的方法筛选转化了的大肠杆菌。结果得到包含下述cDNA片段的质粒pCMV-14-SEMA4B-3xFLAG，所述cDNA片段编码在SEMA4B蛋白质(序列号：1)的C末端融合了3xFLAG标记的蛋白质。
实施例8
肽抗体的制备和纯化
以SEMA4B蛋白质(序列号：1)、SEMA4B-M1蛋白质(序列号：4)、SEMA4B-M2蛋白质(序列号：7)和SEMA4B-M3蛋白质(序列号：10)的氨基酸序列为基础，通过Fmoc固相合成法合成包含12～15个氨基酸的下述4种肽(肽1～4)。
肽1的氨基酸序列[Asn-Ser-Ala-Arg-Glu-Arg-Lys-Ile-Asn-Ser-Ser-Cys(序列号：22)]是在SEMA4B蛋白质(序列号：1)的第402～412位的氨基酸序列的C末端添加了Cys的序列。
肽2的氨基酸序列
[Ser-Val-Val-Ser-Pro-Ser-Phe-Val-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-Pro-Cys(序列号：23)]是SEMA4B蛋白质(序列号：1)的第582-596位的氨基酸序列。
肽3的氨基酸序列
[Pro-Leu-Asp-His-Arg-Gly-Tyr-Gln-Ser-Leu-Ser-Asp-Ser-Pro-Cys(序列号：24)]是在SEMA4B蛋白质(序列号：1)的第781-794位的氨基酸序列的C末端添加了Cys的序列。
肽4的氨基酸序列
[Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Glu-Ser-Glu-Lys-Arg-Pro-Leu-Ser-Cys(序列号：25)]是在SEMA4B蛋白质(序列号：1)的第797-809位的氨基酸序列的C末端添加了Cys的序列。
在上述肽1、肽2、肽3和肽4各肽上结合匙孔戚血蓝蛋白(Keyhole limpethemocyanin，KLH)作为载体蛋白制成结合抗原，并如下所述，制备兔多克隆抗体。
用1只雄性兔KBL：JW(11周龄，Oriental Yeast Co.，Ltd.)作为免疫动物，初次致敏使用弗氏完全佐剂(Difco Laboratories)悬浮液，第2次及其以后使用弗氏不完全佐剂(Difco Laboratories)悬浮液。致敏通过背部皮下注射进行，1次致敏使用各抗原0.5mg，初次致敏后每14天重复3次。在初次致敏后第52天在麻醉下进行颈动脉采血，得到血清约50ml。将如上获得的血清通过硫酸铵盐析法浓缩，所得的粗制IgG级分全部用A蛋白亲和柱(Amersham-Bioscience Corp.)纯化，由此从免疫了肽1、肽2、肽3或肽4的兔分别获得纯IgG约103mg、约76mg、约112mg和约122mg。并且，得到了结合在固定了各免疫原肽的柱上的IgG级分。固定时，利用各肽的C末端Cys，用硼酸缓冲液将肽偶联到Sepharose柱(Amersham-Bioscience Corp.)上。从柱上洗脱时，使用8M尿素/磷酸缓冲化生理盐水(PBS)。洗脱液相对PBS进行透析而除去尿素后，进行超浓缩(ultraconcentration)、膜滤灭菌，由此得到肽1、肽2、肽3和肽4的亲和纯化抗体AS-2531、AS-2532、AS-2591和AS-2592分别约15mg、约126mg、约17mg和约35mg。
实施例9
采用兔肽抗体的免疫印迹法
SEMA4B蛋白质(序列号：1)的检测，用实施例8中制备的纯化肽抗体进行。将来源于人非小细胞肺癌的NCI-H358细胞1.5×106个悬浮在包含10％胎牛血清(JRH社)的RPMI-1640培养基(Invitrogen Corp.)10ml中，并接种到直径10cm的培养皿中，在5％二氧化碳气流下在37℃培养一晚。将实施例6中制备的质粒pCMV-14-SEMA4B 6μg和Plus试剂(Invitrogen CoRP.)以及OPTI-MEM I(Invitrogen Corp.)混合，在室温放置15分钟后，加入LipofectAMINE转染试剂(Invitrogen Corp.)和OPTI-MEM I，并继续在室温放置15分钟。将该混合液滴加到培养液中并继续培养。在表达质粒转染2天后将细胞用冰冷的PBS洗涤，并添加冰冷的RIPA缓冲液[50mM Tris-盐酸缓冲液，pH 7.5，150mM氯化钠、1％Triton X-100、0.1％SDS、1％脱氧胆酸、CompleteTM tablet(Roche Diagnostics社)、磷酸酶抑制剂鸡尾酒-2(Sigma社)]1ml，在4℃放置30分钟。回收该RIPA缓冲液，并以15,000rpm离心分离20分钟，所得的上清作为不含细胞的提取液。将该不含细胞的提取液与2倍浓度的SDS-PAGE用样品缓冲剂[125mM Tris-盐酸缓冲液，pH 6.8，40％甘油、4％SDS、0.04％溴酚蓝和5％2-巯基乙醇]等体积混合，在95℃加热5分钟后，将其中10μl加载加载到10％丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE上。电泳分离的蛋白质按照常规方法转录到Clear Blotting P膜(ATTO)后，在封闭溶液[50mM Tris-盐酸缓冲液，pH 7.5，500mM氯化钠、0.1％吐温20、5％脱脂乳]中在室温放置1小时。然后用封闭溶液将实施例8中制备的肽抗体AS-2531、AS-2532、AS-2591或AS-2592稀释到浓度为3μg/ml，在4℃反应一晚上。接着，在用封闭溶液稀释5万倍或10万倍的HRP-标记抗兔IgG抗体(Amersham-Bioscience Corp.)中在室温放置1小时。检测时使用ECL plus(Amersham-Bioscience Corp.)，按照随附的说明书检测SEMA4B蛋白质。
除AS-2531之外，使用AS-2532、AS-2591和AS-2592中的任何一种时，均在100kD分子量附近位置发现来源于SEMA4B蛋白质的特异性带。
实施例10
使用兔肽抗体的免疫沉淀
使用实施例8中制备的纯化肽抗体，在非变性状态下进行SEMA4B蛋白质的免疫沉淀。
用实施例7中获得的质粒pCMV-14-SEMA4B-3xFLAG，按照与实施例9中同样的操作制备不含细胞的提取液。将Protein G-Sepharose 4FF(Amersham-Bioscience Corp.)用等体积的RIPA缓冲液悬浮，往该悬浮液50μl中加入不含细胞的提取液400μl，进一步加入实施例8中记载的肽抗体AS-2531、AS-2532、AS-2591和AS-2592中的任意一种5μg制备混合液，并在4℃搅拌一晚。将Protein G-Sepharose 4FF共沉淀级分，用RIPA缓冲液洗涤后，悬浮在50μl SDS-PAGE用样品缓冲液[62.5mM Tris-盐酸缓冲液，pH 6.8，20％甘油、2％SDS、0.02％溴酚蓝和2.5％2-巯基乙醇]中，在95℃加热5分钟后，将其中5μl或10μl加载到10％丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE上。检测根据实施例9记载的方法进行。但使用将小鼠抗FLAG M2抗体(Sigma社)用封闭溶液稀释到0.2μg/ml或0.1μg/ml所得的物质作为初级抗原，以将HRP-标记抗小鼠IgG抗体(Amersham-Bioscience Corp.)用封闭溶液稀释2.5万倍或5万倍所得的物质作为次级抗原。
即使使用肽抗体AS-2531、AS-2532、AS-2591和AS-2592中的任意一种进行免疫沉淀，也在100kD分子量附近发现SEMA4B蛋白质的特异性带。
由此可知，肽抗体AS-2531、AS-2532、AS-2591和AS-2592与未变性的SEMA4B蛋白质结合。
实施例11
癌细胞株中SEMA4B蛋白质的表达研究
在2个直径10cm的培养皿中培养肺癌细胞株NCI-H2228、NCI-H1651、NCI-H358、NCI-H23和NCI-H1703；卵巢癌细胞株SKOV-3和TOV-21G；前列腺癌细胞株DU145；和胰腺癌细胞株PANC-1。对于各种细胞，将一个培养皿中的细胞用胰蛋白酶·EDTA(Invitrogen社)分散，并测定细胞数。基于所测得的细胞数，以5×106个细胞/1ml的比例将冰冷的RIPA缓冲液(实施例9中记载的)添加到另一个培养皿中，并在4℃放置30分钟。回收该RIPA缓冲液，以15,000rpm离心分离20分钟，将所得的上清作为不含细胞的提取液。同时，准备按照SizeTM X Protein G Immunoprecipitation Kit(Pierce社)随附的说明书使实施例8中记载的肽抗体AS-2531与Protein G-Sepharose4FF(Amersham-Bioscience Corp.)交联得到的树脂，并用等体积的RIPA缓冲液悬浮。往该悬浮液30μl中加入上述不含细胞的提取液400μl，在4℃搅拌一晚上。将Protein G-Sepharose 4FF共沉淀级分用RIPA缓冲液洗涤后，悬浮在实施例10记载的SDS-PAGE用样品缓冲液中，并在95℃加热5分钟，然后将其中的20μl加载到10％丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE上。使用肽抗体AS-2532按照实施例9中记载的方法进行检测。
上述9种细胞株中，在NCI-H2228、NCI-H358、NCI-H23、SKOV-3、DU145和PANC-1的各细胞株中，在100kD分子量附近发现SEMA4B蛋白质的特异性带。由此可知，SEMA4B蛋白质在上述6种癌细胞株中高水平地表达。
实施例12
稳定表达重组型全长蛋白质的细胞株的建立
将来源于人非小细胞肺癌的NCI-H358细胞2.0×105个悬浮在2ml包含10％胎牛血清(JRH社)、1mM丙酮酸钠和25mM HEPES的RPMI-1640培养基(Invitrogen Corp.)中，并接种到6孔培养板上，然后在5％二氧化碳气流下在37℃培养一晚上。同时，将用OPTI-MEM I(Invitrogen Corp.)稀释了的实施例6中记载的质粒pCMV-14-SEMA4B 1μg与Plus试剂(Invitrogen Corp.)6μl混合，并在室温放置15分钟，然后添加用OPTI-MEM I稀释了的LipofectAMINE转染试剂(Invitrogen Corp.)4μl，继续在室温放置15分钟。将该混合液滴加到培养液中，继续培养1天，然后用胰蛋白酶·EDTA(Invitrogen Corp.)分散细胞，用加入了G418(Promega Corp.)并使其浓度达到400μg/ml的上述培养基稀释10倍，并接种到24孔培养板上。在5％二氧化碳气流下在37℃继续培养，培养期间每3天或4天更换包含G418的上述培养基(G418选择培养基)。然后从1～3个细胞增殖并形成了集落的孔中回收细胞，并等量地接种到48孔培养板的2个孔中。继续培养至细胞密度达到50％或50％以上后，向1个孔的细胞中加入实施例10中记载的SDS-PAGE用样品缓冲液50μl，制备细胞溶解液。在95℃加热5分钟后，将其中5μl加载到10％丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE。按照实施例9中记载的方法用肽抗体AS-2532进行免疫印迹，检测稳定表达组成型(constitutively)表达SEMA4B蛋白质(序列号：1)的细胞。将从另一个孔中回收的细胞稀释到0.7个细胞/孔后接种到96孔培养板上。在5％二氧化碳气流下在37℃继续培养到细胞密度达到50％左右，培养期间每3或4天更换G418选择培养基。再次等量地接种到48孔培养板的2个孔中，并继续培养至细胞密度达到50％以上，由1个孔中的细胞制备细胞溶解液，用该溶解液与上述同法进行免疫印迹。选择最高水平地表达SEMA4B蛋白质(序列号：1)的克隆，得到稳定表达SEMA4B的细胞株SEMA4B/H358。
实施例13
SEMA4B蛋白质定位性研究(生物素标记)
用人非小细胞肺癌细胞株NCI-H2228和NCI-H358和实施例12中制备的重组型全长蛋白质的稳定表达细胞株(SEMA4B/H358)，将暴露在细胞表层上的蛋白质用Cellular Labeling and Immunoprecipitation Kit(RocheDiagnostics)进行生物素标记。然后用1ml按照实施9的方法制备的不含细胞的细胞提取液和5μg实施例8中制备的肽抗体AS-2591，根据实施例10的方法进行免疫沉淀和SDS-PAGE。用HRP标记的链霉抗生物素蛋白(streptoavidin)(Amersham-Bioscience Corp.)进行检测，结果在100kD分子量附近发现SEMA4B蛋白质的特异性带，表明SEMA4B蛋白质、SEMA4B-M1蛋白质、SEMA4B-M2蛋白质和SEMA4B-M3蛋白质局部存在(localized)于细胞表面。
实施例14
SEMA4B蛋白质定位性研究(FACS分析)
将人非小细胞肺癌细胞株NCI-H2228和NCI-H358以及实施例12中记载的SEMA4B/H358分别接种到直径10cm的培养皿中，并培养至亚满底(subconfluent)。将各细胞用PBS洗涤后，加入含有0.5％BSA和5mM EDTA的PBS，并在室温放置15分钟，将细胞分散。然后将该细胞以4×106个/ml的浓度悬浮在缓冲液A[包含2％胎牛血清(JRH社)和0.1％叠氮化钠的HBSS(Hanks′Balanced Salt Solutions，Invitrogen Corp.)]中，加入AS-2532或非免疫兔IgG(Jackson)使其终浓度为10μg/ml，并在冰中放置3小时。用缓冲液A将细胞洗涤后，悬浮到包含10μg/ml的Alexa488标记抗兔IgG抗体(MolecularProbes社)的缓冲液A中，并在冰上放置2小时。再次用缓冲液A洗涤后，用FACScan(BD Biosciences)进行分析。结果所有细胞中均进行兔肽抗体AS-2532特异性染色，表明SEMA4B蛋白质、SEMA4B-M1蛋白质、SEMA4B-M2蛋白质和SEMA4B-M3蛋白质局部存在于细胞表面上。
实施例15
通过转染反义寡核苷酸导致的人非小细胞肺癌细胞株NCI-H358的细胞凋亡
检测在实施例2中记载的NCI-H1703以外的人非小细胞肺癌细胞株中是否也通过转染反义寡核苷酸而诱发细胞凋亡。
将NCI-H358悬浮在包含10％胎牛血清(JRH)、1mM丙酮酸钠和25mMHEPES的RPMI-1640培养基(Invitrogen Corp.)中，然后将NCI-H358按照细胞密度为8×103个/孔(培养基液体的量80μl)，接种到96孔平底组织培养板(BD Falcon社)中，在5％二氧化碳气流中在37℃培养一晚。另一方面，将实施例2中记载的反义寡核苷酸(序列号：13)和对照寡核苷酸(序列号：14)各0.06μg用OPTI-MEM I(Invitrogen Corp.)稀释，并与0.5μl Plus试剂(Invitrogen Corp.)混合，然后在室温放置15分钟。加入用OPTI-MEM I稀释了的LipofectAMINE转染试剂(Invitrogen Corp.)0.4μl，进一步在室温放置15分钟。将该混合液全部添加到NCI-H358培养液中，继续培养3天后，按照Cell Death Detection ELISAPLUS(Roche Diagnostics社)和Caspase-Glo 3/7assay(Promega Corp.)随附的说明书测定上述寡核苷酸诱导细胞凋亡的活性。
结果显示，通过Cell Death Detection ELISAPLUS和Caspase-Glo 3/7试验，在NCI-H358中，与作为阴性对象使用的对照寡核苷酸相比，反义寡核苷酸分别显示1.42倍和1.77倍的细胞凋亡诱导活性，表明具有统计学显著差异(P≤0.01)(表5和6)。
[表5]
| 细胞凋亡诱导活性(A405-A492) | ||
| 平均值 | 标准偏差 | |
| 空白 | 0.217 | 0.007 |
| 对照寡核苷酸(序列号：14) | 0.330 | 0.041 |
| 反义寡核苷酸(序列号：13) | 0.467 | 0.029 |
[表6]
| 细胞凋亡诱导活性(CPS) | ||
| 平均值 | 标准偏差 | |
| 空白 | 7625 | 235 |
| 对照寡核苷酸(序列号：14) | 8727 | 188 |
| 反义寡核苷酸(序列号：13) | 15452 | 570 |
实施例16
通过反义寡核苷酸的转染诱导人非小细胞肺癌细胞株NCI-H2228、NCI-H1651和NCI-H23的细胞凋亡
在NCI-H1703(实施例2)和NCI-H358(实施例15)中也检测了通过转染反义寡核苷酸是否诱发细胞凋亡。
对于NCI-H2228，使用包含10％胎牛血清(JRH)、1mM丙酮酸钠和25mM HEPES的RPMI-1640培养基(Invitrogen Corp.)。对于NCI-H1651，使用包含10％FBS的ACL-4培养基(ATCC)。对于NCI-H23，使用10％胎牛血清(JRH社)和25mM HEPES的RPMI-1640培养基(Invitrogen Corp.)。将各细胞分别悬浮在相应的培养基中，并以7.5×103个/孔(NCI-H2228)、7.5×103个/孔(NCI-H1651)和5×103个/孔(NCI-H23)的细胞密度接种到96孔平底组织培养板(BD Falcon社)中，在5％二氧化碳气流中在37℃培养一晚。另一方面，将实施例2中记载的反义寡核苷酸(序列号：13)和对照寡核苷酸(序列号：14)各0.135μg用OPTI-MEM I(Invitrogen Corp.)稀释，并与0.75μl Plus试剂(Invitrogen Corp.)混合后，在室温放置15分钟。加入用OPTI-MEM I稀释了的LipofectAMINE试剂(Invitrogen Corp.)0.4μl，进一步在室温放置15分钟。将该混合液全部添加到各细胞的培养液中，并继续培养3天后，按照CellDeath Detection ELISAPLUS(Roche Diagnostics)随附的说明书测定上述寡核苷酸诱导细胞凋亡的活性。
结果表明，对于所有的细胞株，与作为阴性对象使用的对照寡核苷酸相比，反义寡核苷酸分别显示1.58倍(NCI-H2228)、1.21倍(NCI-H1651)和1.25倍(NCI-H23)的细胞凋亡诱导活性。算出P-值为P≤0.05(NCI-H2228)、P≤0.05(NCI-H1651)和P≤0.01(NCI-H23)，表明具有统计学显著差异(表7、8和9)。
[表7]
| 细胞凋亡诱导活性(A405-A492) | ||
| 平均值 | 标准偏差 | |
| 空白 | 0.312 | 0.009 |
| 对照寡核苷酸(序列号：14) | 0.526 | 0.043 |
| 反义寡核苷酸(序列号：13) | 0.829 | 0.123 |
[表8]
| 细胞凋亡诱导活性(A405-A492) | ||
| 平均值 | 标准偏差 | |
| 空白 | 0.523 | 0.091 |
| 对照寡核苷酸(序列号：14) | 1.152 | 0.101 |
| 反义寡核苷酸(序列号：13) | 1.390 | 0.104 |
[表9]
| 细胞凋亡诱导活性(A405-A492) | ||
| 平均值 | 标准偏差 | |
| 空白 | 0.678 | 0.028 |
| 对照寡核苷酸(序列号：14) | 1.081 | 0.050 |
| 反义寡核苷酸(序列号：13) | 1.351 | 0.058 |
实施例17
采用兔肽抗体诱发细胞凋亡
用实施例8中获得的兔肽抗体AS-2531和AS-2532处理人非小细胞肺癌细胞株NCI-H2228，并测定这些兔肽抗体的细胞凋亡诱导活性。
将NCI-H2228悬浮在包含10％胎牛血清(JRH)、1mM丙酮酸钠和25mMHEPES的RPMI-1640培养基(Invitrogen Corp.)中，并按照细胞密度达到4×103个细胞/孔，接种到涂布了I型胶原的96孔平底组织培养板(BD Falcon社)中，然后在5％二氧化碳气流中在37℃培养一晚。将实施例8中获得的兔肽抗体AS-2531和AS-2532以及非免疫兔IgG(Jackson社)用PBS稀释，分别将各抗体添加到培养液中，使其终浓度分别达到15μg/ml、45μg/ml和150μg/ml。继续培养5天后，按照Cell Death Detection ELISAPLUS(RocheDiagnostics)随附的说明书测定上述兔肽抗体的细胞凋亡诱导活性。结果显示，与相同浓度的非免疫兔IgG相比，在45μg/ml和15μg/ml的AS-2531存在下，分别显示1.26倍和1.31倍的细胞凋亡诱导活性(P≤0.05和P≤0.01)。另外，与相同浓度的非免疫兔IgG相比，在150μg/ml的AS-2532存在下，显示1.27倍的细胞凋亡诱导活性(P≤0.01)。
由此可知，SEMA4B蛋白质、SEMA4B-M1蛋白质、SEMA4B-M2蛋白质和SEMA4B-M3蛋白质对维持人肺癌细胞的生存起重要作用。
工业适用性
本发明所用的蛋白质在癌细胞中特异性地表达，是癌症的诊断标记。因此，抑制该蛋白质活性的化合物或其盐、抑制该蛋白质基因表达的化合物或其盐、本发明的反义多核苷酸、本发明的抗体可以安全地用作例如癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)的预防·治疗剂、细胞凋亡促进(诱导)剂等。另外，本发明所用的蛋白质或编码该蛋白质的多核苷酸、本发明的抗体等对于筛选癌症(例如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆道癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、胰腺癌、脑瘤、动脉瘤等)预防·治疗剂、细胞凋亡促进(诱导)剂等方面是有用的。
序列表
<110>武田药品工业株式会社(Takeda Pharmaceutical Company Limited)
<120>新型蛋白质及其用途
<130>3132WOOP
<150>JP2002-378052
<151>2002-12-26
<150>JP2003-65497
<151>2003-03-11
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<212>PRT
<213>人
<400>1
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Gly Ala Leu Pro Pro Arg Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
20 25 30
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Asp Asp Lys Ile Tyr Phe Phe Phe Ser Glu Thr Gly Gln Glu Phe Glu
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275 280 285
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Val Leu Gln Asp Val Phe Thr Leu Ser Pro Ser Pro Gln Asp Trp Arg
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385 390 395 400
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Val Arg Ser Arg Met Leu Leu Leu Gln Pro Gln Ala Arg Tyr Gln Arg
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450 455 460
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Pro Arg Val His Ile Ile Glu Glu Leu Gln Ile Phe Ser Ser Gly Gln
485 490 495
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<210>2
<211>2511
<212>DNA
<213>人
<400>2
atgctgcgca ccgcgatggg cctgaggagc tggctcgccg ccccatgggg cgcgctgccg 60
cctcggccac cgctgctgct gctcctgctg ctgctgctcc tgctgcagcc gccgcctccg 120
acctgggcgc tcagcccccg gatcagcctg cctctgggct ctgaagagcg gccattcctc 180
agattcgaag ctgaacacat ctccaactac acagcccttc tgctgagcag ggatggcagg 240
accctgtacg tgggtgctcg agaggccctc tttgcactca gtagcaacct cagcttcctg 300
ccaggcgggg agtaccagga gctgctttgg ggtgcagacg cagagaagaa acagcagtgc 360
agcttcaagg gcaaggaccc acagcgcgac tgtcaaaact acatcaagat cctcctgccg 420
ctcagcggca gtcacctgtt cacctgtggc acagcagcct tcagccccat gtgtacctac 480
atcaacatgg agaacttcac cctggcaagg gacgagaagg ggaatgtcct cctggaagat 540
ggcaagggcc gttgtccctt cgacccgaat ttcaagtcca ctgccctggt ggttgatggc 600
gagctctaca ctggaacagt cagcagcttc caagggaatg acccggccat ctcgcggagc 660
caaagccttc gccccaccaa gaccgagagc tccctcaact ggctgcaaga cccagctttt 720
gtggcctcag cctacattcc tgagagcctg ggcagcttgc aaggcgatga tgacaagatc 780
tactttttct tcagcgagac tggccaggaa tttgagttct ttgagaacac cattgtgtcc 840
cgcattgccc gcatctgcaa gggcgatgag ggtggagagc gggtgctaca gcagcgctgg 900
acctccttcc tcaaggccca gctgctgtgc tcacggcccg acgatggctt ccccttcaac 960
gtgctgcagg atgtcttcac gctgagcccc agcccccagg actggcgtga cacccttttc 1020
tatggggtct tcacttccca gtggcacagg ggaactacag aaggctctgc cgtctgtgtc 1080
ttcacaatga aggatgtgca gagagtcttc agcggcctct acaaggaggt gaaccgtgag 1140
acacagcaga tggtacaccg tgacccaccc gtgcccacac cccggcctgg agcgtgcatc 1200
accaacagtg cccgggaaag gaagatcaac tcatccctgc agctcccaga ccgcgtgctg 1260
aactttctca aggaccactt cctgatggac gggcaggtcc gaagccgcat gctgctgctg 1320
cagccccagg ctcgctacca gcgcgtggct gtacaccgcg tccctggcct gcaccacacc 1380
tacgatgtcc tcttcctggg cactggtgac ggccggctcc acaaggcagt gagcgtgggc 1440
ccccgggtgc acatcattga ggagctgcag atcttctcat cgggacagcc cgtgcagaat 1500
ctgctcctgg acacccacag ggggctgctg tatgcggcct cacactcggg cgtagtccag 1560
gtgcccatgg ccaactgcag cctgtaccgg agctgtgggg actgcctcct cgcccgggac 1620
ccctactgtg cttggagcgg ctccagctgc aagcacgtca gcctctacca gcctcagctg 1680
gccaccaggc cgtggatcca ggacatcgag ggagccagcg ccaaggacct ttgcagcgcg 1740
tcttcggttg tgtccccgtc ttttgtacca acaggggaga agccatgtga gcaagtccag 1800
ttccagccca acacagtgaa cactttggcc tgcccgctcc tctccaacct ggcgacccga 1860
ctctggctac gcaacggggc ccccgtcaat gcctcggcct cctgccacgt gctacccact 1920
ggggacctgc tgctggtggg cacccaacag ctgggggagt tccagtgctg gtcactagag 1980
gagggcttcc agcagctggt agccagctac tgcccagagg tggtggagga cggggtggca 2040
gaccaaacag atgagggtgg cagtgtaccc gtcattatca gcacatcgcg tgtgagtgca 2100
ccagctggtg gcaaggccag ctggggtgca gacaggtcct actggaagga gttcctggtg 2160
atgtgcacgc tctttgtgct ggccgtgctg ctcccagttt tattcttgct ctaccggcac 2220
cggaacagca tgaaagtctt cctgaagcag ggggaatgtg ccagcgtgca ccccaagacc 2280
tgccctgtgg tgctgccccc tgagacccgc ccactcaacg gcctagggcc ccctagcacc 2340
ccactcgatc accgagggta ccagtccctg tcagacagcc ccccggggtc ccgagtcttc 2400
actgagtcag agaagaggcc actcagcatc caagacagct tcgtggaggt atccccagtg 2460
tgcccccggc cccgggtccg ccttggctcg gagatccgtg actctgtggt g 2511
<210>3
<211>3766
<212>DNA
<213>人
<400>3
gctctgccca agccgaggct gcggggccgg cgccggcggg aggactgcgg tgccccgcgg 60
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agtccggccg agccacctga gcccgagccg cgggacaccg tcgctcctgc tctccgaatg 240
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cggccaccgc tgctgctgct cctgctgctg ctgctcctgc tgcagccgcc gcctccgacc 360
tgggcgctca gcccccggat cagcctgcct ctgggctctg aagagcggcc attcctcaga 420
ttcgaagctg aacacatctc caactacaca gcccttctgc tgagcaggga tggcaggacc 480
ctgtacgtgg gtgctcgaga ggccctcttt gcactcagta gcaacctcag cttcctgcca 540
ggcggggagt accaggagct gctttggggt gcagacgcag agaagaaaca gcagtgcagc 600
ttcaagggca aggacccaca gcgcgactgt caaaactaca tcaagatcct cctgccgctc 660
agcggcagtc acctgttcac ctgtggcaca gcagccttca gccccatgtg tacctacatc 720
aacatggaga acttcaccct ggcaagggac gagaagggga atgtcctcct ggaagatggc 780
aagggccgtt gtcccttcga cccgaatttc aagtccactg ccctggtggt tgatggcgag 840
ctctacactg gaacagtcag cagcttccaa gggaatgacc cggccatctc gcggagccaa 900
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tgctccttat gtaaactgag ccctttgttt aaaaaacaat tccaaatgtg aaactagaat 3060
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tggcctcttc accttccaca ttatcccgct gccaccggct gccctgtctc actgcagatt 3240
caggaccagc ttgggctgcg tgcgttctgc cttgccagtc agccgaggat gtagttgttg 3300
ctgccgtcgt cccaccacct cagggaccag agggctaggt tggcactgcg gccctcacca 3360
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<213>人
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Asp Glu Gly Gly Glu Arg Val Leu Gln Gln Arg Trp Thr Ser Phe Leu
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Asp Thr Leu Phe Tyr Gly Val Phe Thr Ser Gln Trp His Arg Gly Thr
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cgcattgccc gcatctgcaa gggcgatgag ggtggagagc gggtgctaca gcagcgctgg 900
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gtgctgcagg atgtcttcac gctgagcccc agcccccagg actggcgtga cacccttttc 1020
tatggggtct tcacttccca gtggcacagg ggaactacag aaggctctgc cgtctgtgtc 1080
ttcacaatga aggatgtgca gagagtcttc agcggcctct acaaggaggt gaaccgtgag 1140
acacagcaga tggtacaccg tgacccaccc gtgcccacac cccggcctgg agcgtgcatc 1200
accaacagtg cccgggaaag gaagatcaac tcatccctgc agctcccaga ccgcgtgctg 1260
aactttctca aggaccactt cctgatggac gggcaggtcc gaagccgcat gctgctgctg 1320
cagccccagg ctcgctacca gcgcgtggct gtacaccgcg tccctggcct gcaccacacc 1380
tacgatgtcc tcttcctggg cactggtgac ggccggctcc acaaggcagt gagcgtgggc 1440
ccccgggtgc acatcattga ggagctgcag atcttctcat cgggacagcc cgtgcagaat 1500
ctgctcctgg acacccacag ggggctgctg tatgcggcct cacactcggg cgtagtccag 1560
gtgcccatgg ccaactgcag cctgtaccgg agctgtgggg actgcctcct cgcccgggac 1620
ccctactgtg cttggagcgg ctccagctgc aagcacgtca gcctctacca gcctcagctg 1680
gccaccaggc cgtggatcca ggacatcgag ggagccagcg ccaaggacct ttgcagcgcg 1740
tcttcggttg tgtccccgtc ttttgtacca acaggggaga agccatgtga gcaagtccag 1800
ttccagccca acacagtgaa cactttggcc tgcccgctcc tctccaacct ggcgacccga 1860
ctctggctac gcaacggggc ccccgtcaat gcctcggcct cctgccacgt gctacccact 1920
ggggacctgc tgctggtggg cacccaacag ctgggggagt tccagtgctg gtcactagag 1980
gagggcttcc agcagctggt agccagctac tgcccagagg tggtggagga cggggtggca 2040
gaccaaacag atgagggtgg cagtgtaccc gtcattatca gcacatcgcg tgtgagtgca 2100
ccagctggtg gcaaggccag ctggggtgca gacaggtcct actggaagga gttcctggtg 2160
atgtgcacgc tctttgtgct ggccgtgctg ctcccagttt tattcttgct ctaccggcac 2220
cggaacagca tgaaagtctt cctgaagcag ggggaatgtg ccagcgtgca ccccaagacc 2280
tgccctgtgg tgctgccccc tgagacccgc ccactcaacg gcctagggcc ccctagcacc 2340
ccactcgatc accgagggta ccagtccctg tcagacagcc ccccggggtc ccgagtcttc 2400
actgagtcag agaagaggcc actcagcatc caagacagct tcgtggaggt atccccagtg 2460
tgcccccggc cccgggtccg ccttggctcg gagatccgtg actctgtggt g 2511
<210>6
<211>3766
<212>DNA
<213>人
<400>6
gctctgccca agccgaggct gcggggccgg cgccggcggg aggactgcgg tgccccgcgg 60
aggggctgag tttgccaggg cccacttgac cctgtttccc acctcccgcc ccccaggtcc 120
ggaggcgggg gcccccgggg cgactcgggg gcggaccgcg gggcggagct gccgcccgtg 180
agtccggccg agccacctga gcccgagccg cgggacaccg tcgctcctgc tctccgaatg 240
ctgcgcaccg cgatgggcct gaggagctgg ctcgccgccc catggggcgc gctgccgcct 300
cggccaccgc tgctgctgct cctgctactg ctgctcctgc tgcagccacc gcctccgacc 360
tgggcgctca gcccccggat cagcctgcct ctgggctctg aagagcggcc attcctcaga 420
ttcgaagctg aacacatctc caactacaca gcccttctgc tgagcaggga tggcaggacc 480
ctgtacgtgg gtgctcgaga ggccctcttt gcactcagta gcaacctcag cttcctgcca 540
ggcggggagt accaggagct gctttggggt gcagacgcag agaagaaaca gcagtgcagc 600
ttcaagggca aggacccaca gcgcgactgt caaaactaca tcaagatcct cctgccgctc 660
agcggcagtc acctgttcac ctgtggcaca gcagccttca gccccatgtg tacctacatc 720
aacatggaga acttcaccct ggcaagggac gagaagggga atgtcctcct ggaagatggc 780
aagggccgtt gtcccttcga cccgaatttc aagtccactg ccctggtggt tgatggcgag 840
ctctacactg gaacagtcat cagcttccaa gggaatgacc cggccatctc gcggagccaa 900
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gcctcagcct acattcctga gagcctgggc agcttgcaag gcgatgatga caagatctac 1020
tttttcttca gcgagactgg ccaggaattt gagttctttg agaacaccat tgtgtcccgc 1080
attgcccgca tctgcaaggg cgatgagggt ggagagcggg tgctacagca gcgctggacc 1140
tccttcctca aggcccagct gctgtgctca cggcccgacg atggcttccc cttcaacgtg 1200
ctgcaggatg tcttcacgct gagccccagc ccccaggact ggcgtgacac ccttttctat 1260
ggggtcttca cttcccagtg gcacagggga actacagaag gctctgccgt ctgtgtcttc 1320
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aacagtgccc gggaaaggaa gatcaactca tccctgcagc tcccagaccg cgtgctgaac 1500
tttctcaagg accacttcct gatggacggg caggtccgaa gccgcatgct gctgctgcag 1560
ccccaggctc gctaccagcg cgtggctgta caccgcgtcc ctggcctgca ccacacctac 1620
gatgtcctct tcctgggcac tggtgacggc cggctccaca aggcagtgag cgtgggcccc 1680
cgggtgcaca tcattgagga gctgcagatc ttctcatcgg gacagcccgt gcagaatctg 1740
ctcctggaca cccacagggg gctgctgtat gcggcctcac actcgggcgt agtccaggtg 1800
cccatggcca actgcagcct gtaccggagc tgtggggact gcctcctcgc ccgggacccc 1860
tactgtgctt ggagcggctc cagctgcaag cacgtcagcc tctaccagcc tcagctggcc 1920
accaggccgt ggatccagga catcgaggga gccagcgcca aggacctttg cagcgcgtct 1980
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gctggtggca aggccagctg gggtgcagac aggtcctact ggaaggagtt cctggtgatg 2400
tgcacgctct ttgtgctggc cgtgctgctc ccagttttat tcttgctcta ccggcaccgg 2460
aacagcatga aagtcttcct gaagcagggg gaatgtgcca gcgtgcaccc caagacctgc 2520
cctgtggtgc tgccccctga gacccgccca ctcaacggcc tagggccccc tagcacccca 2580
ctcgatcacc gagggtacca gtccctgtca gacagccccc cggggtcccg agtcttcact 2640
gagtcagaga agaggccact cagcatccaa gacagcttcg tggaggtatc cccagtgtgc 2700
ccccggcccc gggtccgcct tggctcggag atccgtgact ctgtggtgtg agagctgact 2760
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tgctccttat gtaaactgag ccctttgttt aaaaaacaat tccaaatgtg aaactagaat 3060
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ggggtgctgg ggatgcatcc aaagtggttg tctgagacag agttggaaac cctcaccaac 3180
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caggaccagc ttgggctgcg tgcgttctgc cttgccagtc agccgaggat gtagttgttg 3300
ctgccgtcgt cccaccacct cagggaccag agggctaggt tggcactgcg gccctcacca 3360
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ccaccatatc caccctcgct ccatctttga actcaaacac gaggaactaa ctgcaccctg 3600
gtcctctccc cagtccccag ttcaccctcc atccctcacc ttcctccact ctaagggata 3660
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atgcacttta tgtcattttt taataaagtc tgaagaatta ctgttt 3766
<210>7
<211>837
<212>PRT
<213>人
<400>7
Met Leu Arg Thr Ala Met Gly Leu Arg Ser Trp Leu Ala Ala Pro Trp
5 10 15
Gly Ala Leu Pro Pro Arg Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
20 25 30
Leu Leu Leu Gln Pro Pro Pro Pro Thr Trp Ala Leu Ser Pro Arg Ile
35 40 45
Ser Leu Pro Leu Gly Ser Glu Glu Arg Pro Phe Leu Arg Phe Glu Ala
50 55 60
Glu His Ile Ser Asn Tyr Thr Ala Leu Leu Leu Ser Arg Asp Gly Arg
65 70 75 80
Thr Leu Tyr Val Gly Ala Arg Glu Ala Leu Phe Ala Leu Ser Ser Asn
85 90 95
Leu Ser Phe Leu Pro Gly Gly Glu Tyr Gln Glu Leu Leu Trp Gly Ala
100 105 110
Asp Ala Glu Lys Lys Gln Gln Cys Ser Phe Lys Gly Lys Asp Pro Gln
115 120 125
Arg Asp Cys Gln Asn Tyr Ile Lys Ile Leu Leu Pro Leu Ser Gly Ser
130 135 140
His Leu Phe Thr Cys Gly Thr Ala Ala Phe Ser Pro Met Cys Thr Tyr
145 150 155 160
Ile Asn Ile Glu Asn Phe Thr Leu Ala Arg Asp Glu Lys Gly Asn Val
165 170 175
Leu Leu Glu Asp Gly Lys Gly Arg Cys Pro Phe Asp Pro Asn Phe Lys
180 185 190
Ser Thr Ala Leu Val Val Asp Gly Glu Leu Tyr Thr Gly Thr Val Ser
195 200 205
Ser Phe Gln Gly Asn Asp Pro Ala Ile Ser Arg Ser Gln Ser Leu Arg
210 215 220
Pro Thr Lys Thr Glu Ser Ser Leu Asn Trp Leu Gln Asp Pro Ala Phe
225 230 235 240
Val Ala Ser Ala Tyr Ile Pro Glu Ser Leu Gly Ser Leu Gln Gly Asp
245 250 255
Asp Asp Lys 1le Tyr Phe Phe Phe Ser Glu Thr Gly Gln Glu Phe Glu
260 265 270
Phe Phe Glu Asn ThrI le Val Ser Arg Ile Ala Arg Ile Cys Lys Gly
275 280 285
Asp Glu Gly Gly Glu Arg Val Leu Gln Gln Arg Trp Thr Ser Phe Leu
290 295 300
Lys Ala Gln Leu Leu Cys Ser Arg Pro Asp Asp Gly Phe Pro Phe Asn
305 310 315 320
Val Leu Gln Asp Val Phe Thr Leu Ser Pro Ser Pro Gln Asp Trp Arg
325 330 335
Asp Thr Leu Phe Tyr Gly Val Phe Thr Ser Gln Trp His Arg Gly Thr
340 345 350
Thr Glu Gly Ser Ala Val Cys Val Phe Thr Met Lys Asp Val Gln Arg
355 360 365
Val Phe Ser Gly Leu Tyr Lys Glu Val Asn Arg Glu Thr Gln Gln Met
370 375 380
Val His Arg Asp Pro Pro Val Pro Thr Pro Arg Pro Gly Ala Cys Ile
385 390 395 400
Thr Asn Ser Ala Arg Glu Arg Lys Ile Asn Ser Ser Leu Gln Leu Pro
405 410 415
Asp Arg Val Leu Asn Phe Leu Lys Asp His Phe Leu Met Asp Gly Gln
420 425 430
Val Arg Ser Arg Met Leu Leu Leu Gln Pro Gln Ala Arg Tyr Gln Arg
435 440 445
Val Ala Val His Arg Val Pro Gly Leu His His Thr Tyr Asp Val Leu
450 455 460
Phe Leu Gly Thr Gly Asp Gly Arg Leu His Lys Ala Val Ser Val Gly
465 470 475 480
Pro Arg Val His Ile Ile Glu Glu Leu Gln Ile Phe Ser Ser Gly Gln
485 490 495
Pro Val Gln Asn Leu Leu Leu Asp Thr His Arg Gly Leu Leu Tyr Ala
500 505 5l0
Ala Ser His Ser Gly Val Val Gln Val Pro Met Ala Asn Cys Ser Leu
515 520 525
Tyr Arg Ser Cys Gly Asp Cys Leu Leu Ala Arg Asp Pro Tyr Cys Ala
530 535 540
Trp Ser Gly Ser Ser Cys Lys His Val Ser Leu Tyr Gln Pro Gln Leu
545 550 555 560
Ala Thr Arg Pro Trp Ile Gln Asp Ile Glu Gly Ala Ser Ala Lys Asp
565 570 575
Leu Cys Ser Ala Ser Ser Val Val Ser Pro Ser Phe Val Pro Thr Gly
580 585 590
Glu Lys Pro Cys Glu Gln Val Gln Phe Gln Pro Asn Thr Val Asn Thr
595 600 605
Leu Ala Cys Pro Leu Leu Ser Asn Leu Ala Thr Arg Leu Trp Leu Arg
610 615 620
Asn Gly Ala Pro Val Asn Ala Ser Ala Ser Cys His Val Leu Pro Thr
625 630 635 640
Gly Asp Leu Leu Leu Val Gly Thr Gln Gln Leu Gly Glu Phe Gln Cys
645 650 655
TrD Ser Leu Glu Glu Gly Phe Gln Gln Leu Val Ala Ser Tyr Cys Pro
660 665 670
Glu Val Val Glu Asp Gly Val Ala Asp Gln Thr Asp Glu Gly Gly Ser
675 680 685
Val Pro Val Ile Ile Ser Thr Ser Arg Val Ser Ala Pro Ala Gly Gly
690 695 700
Lys Ala Ser Trp Gly Ala Asp Arg Ser Tyr Trp Lys Glu Phe Leu Val
705 710 715 720
Met Cys Thr Leu Phe Val Leu Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Phe Leu
725 730 735
Leu Tyr Arg His Arg Asn Ser Met Lys Val Phe Leu Lys Gln Gly Glu
740 745 750
Cys Ala Ser Val His Pro Lys Thr Cys Pro Val Val Leu Pro Pro Glu
755 760 765
Thr Arg Pro Leu Asn Gly Leu Gly Pro Pro Ser Thr Pro Leu Asp His
770 775 780
Arg Gly Tyr Gln Ser Leu Ser Asp Ser Pro Pro Gly Ser Arg Val Phe
785 790 795 800
Thr Glu Ser Glu Lys Arg Pro Leu Ser Ile Gln Asp Ser Phe Val Glu
805 810 815
Val Ser Pro Val Cys Pro Arg Pro Arg Val Arg Leu Gly Ser Glu Ile
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Arg Asp Ser Val Val
835
<210>8
<211>2511
<212>DNA
<213>人
<400>8
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ctcagcggca gtcacctgtt cacctgtggc acagcagcct tcagccccat gtgtacctac 480
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tgctccttat gtaaactgag ccctttgttt aaaaaacaat tccaaatgtg aaactagaat 3060
gagagggaag agatagcatg gcatgcagca cacacggctg ctccagttca tggcctccca 3120
ggggtgctgg ggatgcatcc aaagtggttg tctgagacag agttggaaac cctcaccaac 3180
tggcctcttc accttccaca ttatcccgct gccaccggct gccctgtctc actgcagatt 3240
caggaccagc ttgggctgcg tgcgttctgc cttgccagtc agccgaggat gtagttgttg 3300
ctgccgtcgt cccaccacct cagggaccag agggctaggt tggcactgcg gccctcacca 3360
ggtcctgggc tcggacccaa ctcctggacc tttccagcct gtatcaggct gtggccacac 3420
gagaggacag cgcgagctca ggagagattt cgtgacaatg tacgcctttc cctcagaatt 3480
cagggaagag actgtcgcct gccttcctcc gttgttgcgt gagaacccgt gtgccccttc 3540
ccaccatatc caccctcgct ccatctttga actcaaacac gaggaactaa ctgcaccctg 3600
gtcctctccc cagtccccag ttcaccctcc atccctcacc ttcctccact ctaagggata 3660
tcaacactgc ccagcacagg ggccctgaat ttatgtggtt tttatacatt ttttaataag 3720
atgcacttta tgtcattttt taataaagtc tgaagaatta ctgttt 3766
<210>10
<211>837
<212>PRT
<213>人
<400>10
Met Leu Arg Thr Ala Met Gly Leu Arg Ser Trp Leu Ala Ala Pro Trp
5 10 15
Gly Ala Leu Pro Pro Arg Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
20 25 30
Leu Leu Leu Gln Pro Pro Pro Pro Thr Trp Ala Leu Ser Pro Arg Ile
35 40 45
Ser Leu Pro Leu Gly Ser Glu Glu Arg Pro Phe Leu Arg Phe Glu Ala
50 55 60
Glu His Ile Ser Asn Tyr Thr Ala Leu Leu Leu Ser Arg Asp Gly Arg
65 70 75 80
Thr Leu Tyr Val Gly Ala Arg Glu Ala Leu Phe Ala Leu Ser Ser Asn
85 90 95
Leu Ser Phe Leu Pro Gly Gly Glu Tyr Gln Glu Leu Leu Trp Gly Ala
100 105 110
Asp Ala Glu Lys Lys Gln Gln Cys Ser Phe Lys Gly Lys Asp Pro Gln
115 120 125
Arg Asp Cys Gln Asn Tyr Ile Lys Ile Leu Leu Pro Leu Ser Gly Ser
130 135 140
His Leu Phe Thr Cys Gly Thr Ala Ala Phe Ser Pro Met Cys Thr Tyr
145 150 155 160
Ile Asn Met Glu Asn Phe Thr Leu Ala Arg Asp Glu Lys Gly Asn Val
165 170 175
Leu Leu Glu Asp Gly Lys Gly Arg Cys Pro Phe Asp Pro Asn Phe Lys
180 185 190
Ser Thr Ala Leu Val Val Asp Gly Glu Leu Tyr Thr Gly Thr Val Ser
195 200 205
Ser Phe Gln Gly Asn Asp Pro Ala Ile Ser Arg Ser Gln Ser Leu Arg
210 215 220
Pro Thr Lys Thr Glu Ser Ser Leu Asn Trp Leu Gln Asp Pro Ala Phe
225 230 235 240
Val Ala Ser Ala Tyr Ile Pro Glu Ser Leu Gly Ser Leu Gln Gly Asp
245 250 255
Asp Asp Lys Ile Tyr Phe Phe Phe Ser Glu Thr Gly Gln Glu Phe Glu
260 265 270
Phe Phe Glu Asn Thr Ile Val Ser Arg Ile Ala Arg Ile Cys Lys Gly
275 280 285
Asp Glu Gly Gly Glu Arg Val Leu Gln Gln Arg Trp Thr Ser Phe Leu
290 295 300
Lys Ala Gln Leu Leu Cys Ser Arg Pro Asp Asp Gly Phe Pro Phe Asn
305 3l0 315 320
Val Leu Gln Asp Val Phe Thr Leu Ser Pro Ser Pro Gln Asp Trp Arg
325 330 335
Asp Thr Leu Phe Tyr Gly Val Phe Thr Ser Gln Trp His Arg Gly Thr
340 345 350
Thr Glu Gly Ser Ala Val Cys Val Phe Thr Met Asn Asp Val Gln Arg
355 360 365
Val Phe Ser Gly Leu Tyr Lys Glu Val Asn Arg Glu Thr Gln Gln Met
370 375 380
Val His Arg Asp Pro Pro Val Pro Thr Pro Arg Pro Gly Ala Cys Ile
385 390 395 400
Thr Asn Ser Ala Arg Glu Arg Lys Ile Asn Ser Ser Leu Gln Leu Pro
405 410 415
Asp Arg Val Leu Asn Phe Leu Lys Asp His Phe Leu Met Asp Gly Gln
420 425 430
Val Arg Ser Arg Met Leu Leu Leu Gln Pro Gln Ala Arg Tyr Gln Arg
435 440 445
Val Ala Val His Arg Val Pro Gly Leu His His Thr Tyr Asp Val Leu
450 455 460
Phe Leu Gly Thr Gly Asp Gly Arg Leu His Lys Ala Val Ser Val Gly
465 470 475 480
Pro Arg Val His Ile Ile Glu Glu Leu Gln Ile Phe Ser Ser Gly Gln
485 490 495
Pro Val Gln Asn Leu Leu Leu Asp Thr His Arg Gly Leu Leu Tyr Ala
500 505 510
Ala Ser His Ser Gly Val Val Gln Val Pro Met Ala Asn Cys Ser Leu
515 520 525
Tyr Arg Ser Cys Gly Asp Cys Leu Leu Ala Arg Asp Pro Tyr Cys Ala
530 535 540
Trp Ser Gly Ser Ser Cys Lys His Val Ser Leu Tyr Gln Pro Gln Leu
545 550 555 560
Ala Thr Arg Pro Trp Ile Gln Asp Ile Glu Gly Ala Ser Ala Lys Asp
565 570 575
Leu Cys Ser Ala Ser Ser Val Val Ser Pro Ser Phe Val Pro Thr Gly
580 585 590
Glu Lys Pro Cys Glu Gln Val Gln Phe Gln Pro Asn Thr Val Asn Thr
595 600 605
Leu Ala Cys Pro Leu Leu Ser Asn Leu Ala Thr Arg Leu Trp Leu Arg
610 615 620
Asn Gly Ala Pro Val Asn Ala Ser Ala Ser Cys His Val Leu Pro Thr
625 630 635 640
Gly Asp Leu Leu Leu Val Gly Thr Gln Gln Leu Gly Glu Phe Gln Cys
645 650 655
Trp Ser Leu Glu Glu Gly Phe Gln Gln Leu Val Ala Ser Tyr Cys Pro
660 665 670
Glu Val Val Glu Asp Gly Val Ala Asp Gln Thr Asp Glu Gly Gly Ser
675 680 685
Val Pro Val Ile Ile Ser Thr Ser Arg Val Ser Ala Pro Ala Gly Gly
690 695 700
Lys Ala Ser Trp Gly Ala Asp Arg Ser Tyr Trp Lys Glu Phe Leu Val
705 710 715 720
Met Cys Thr Leu Phe Val Leu Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Phe Leu
725 730 735
Leu Tyr Arg His Arg Asn Ser Met Lys Val Phe Leu Lys Gln Gly Glu
740 745 750
Cys Ala Ser Val His Pro Lys Thr Cys Pro Val Val Leu Pro Pro Glu
755 760 765
Thr Arg Pro Leu Asn Gly Leu Gly Pro Pro Ser Thr Pro Leu Asp His
770 775 780
Arg Gly Tyr Gln Ser Leu Ser Asp Ser Pro Pro Gly Ser Arg Val Phe
785 790 795 800
Thr Glu Ser Glu Lys Arg Pro Leu Ser Ile Gln Asp Ser Phe Val Glu
805 810 815
Val Ser Pro Val Cys Pro Arg Pro Arg Val Arg Leu Gly Ser Glu Ile
820 825 830
Arg Asp Ser Val Val
835
<210>11
<211>2511
<212>DNA
<213>人
<400>11
atgctgcgca ccgcgatggg cctgaggagc tggctcgccg ccccatgggg cgcgctgccg 60
cctcggccac cgctgctgct gctcctgctg ctgctgctcc tgctgcagcc gccgcctccg 120
acctgggcgc tcagcccccg gatcagcctg cctctgggct ctgaagagcg gccattcctc 180
agattcgaag ctgaacacat ctccaactac acagcccttc tgctgagcag ggatggcagg 240
accctgtacg tgggtgctcg agaggccctc tttgcactca gtagcaacct cagcttcctg 300
ccaggcgggg agtaccagga gctgctttgg ggtgcagacg cagagaagaa acagcagtgc 360
agcttcaagg gcaaggaccc acagcgcgac tgtcaaaact acatcaagat cctcctgccg 420
ctcagcggca gtcacctgtt cacctgtggc acagcagcct tcagccccat gtgtacctac 480
atcaacatgg agaacttcac cctggcaagg gacgagaagg ggaatgtcct cctggaagat 540
ggcaagggcc gttgtccctt cgacccgaat ttcaagtcca ctgccctggt ggttgatggc 600
gagctctaca ctggaacagt cagcagcttc caagggaatg acccggccat ctcgcggagc 660
caaagccttc gccccaccaa gaccgagagc tccctcaact ggctgcaaga cccagctttt 720
gtggcctcag cctacattcc tgagagcctg ggcagcttgc aaggcgatga tgacaagatc 780
tactttttct tcagcgagac tggccaggaa tttgagttct ttgagaacac cattgtgtcc 840
cgcattgccc gcatctgcaa gggcgatgag ggtggagagc gggtgctaca gcagcgctgg 900
acctccttcc tcaaggccca gctgctgtgc tcacggcccg acgatggctt ccccttcaac 960
gtgctgcagg atgtcttcac gctgagcccc agcccccagg actggcgtga cacccttttc 1020
tatggggtct tcacttccca gtggcacagg ggaactacag aaggctctgc cgtctgtgtc 1080
ttcaeaatga atgatgtgca gagagtcttc agcggcctct acaaggaggt gaaccgtgag 1140
acacagcaga tggtacaccg tgacccaccc gtgcccacac cccggcctgg agcgtgcatc 1200
accaacagtg cccgggaaag gaagatcaac tcatccctgc agctcccaga ccgcgtgctg 1260
aactttctca aggaccactt cctgatggac gggcaggtcc gaagccgcat gctgctgctg 1320
cagccccagg ctcgctacca gcgcgtggct gtacaccgcg tccctggcct gcaccacacc 1380
tacgatgtcc tcttcctggg cactggtgac ggccggctcc acaaggcagt gagcgtgggc 1440
ccccgggtgc acatcattga ggagctgcag atcttctcat cgggacagcc cgtgcagaat 1500
ctgctcctgg acacccacag ggggctgctg tatgcggcct cacactcggg cgtagtccag 1560
gtgcccatgg ccaactgcag cctgtaccgg agctgtgggg actgcctcct cgcccgggac 1620
ccctactgtg cttggagcgg ctccagctgc aagcacgtca gcctctacca gcctcagctg 1680
gccaccaggc cgtggatcca ggacatcgag ggagccagcg ccaaggacct ttgcagcgcg 1740
tcttcggttg tgtccccgtc ttttgtacca acaggggaga agccatgtga gcaagtccag 1800
ttccagccca acacagtgaa cactttggcc tgcccgctcc tctccaacct ggcgacccga 1860
ctctggctac gcaacggggc ccccgtcaat gcctcggcct cctgccacgt gctacccact 1920
ggggacctgc tgctggtggg cacccaacag ctgggggagt tccagtgctg gtcactagag 1980
gagggcttcc agcagctggt agccagctac tgcccagagg tggtggagga cggggtggca 2040
gaccaaacag atgagggtgg cagtgtaccc gtcattatca gcacatcgcg tgtgagtgca 2100
ccagctggtg gcaaggccag ctggggtgca gacaggtcct actggaagga gttcctggtg 2160
atgtgcacgc tctttgtgct ggccgtgctg ctcccagttt tattcttgct ctaccggcac 2220
cggaacagca tgaaagtctt cctgaagcag ggggaatgtg ccagcgtgca ccccaagacc 2280
tgccctgtgg tgctgccccc tgagacccgc ccactcaacg gcctagggcc ccctagcacc 2340
ccactcgatc accgagggta ccagtccctg tcagacagcc ccccggggtc ccgagtcttc 2400
actgagtcag agaagaggcc actcagcatc caagacagct tcgtggaggt atccccagtg 2460
tgcccccggc cccgggtccg ccttggctcg gagatccgtg actctgtggt g 25l1
<210>12
<211>3766
<212>DNA
<213>人
<400>12
gctctgccca agccgaggct gcggggccgg cgccggcggg aggactgcgg tgccccgcgg 60
aggggctgag tttgccaggg cccacttgac cctgtttccc acctcccgcc ccccaggtcc 120
ggaggcgggg gcccccgggg cgactcgggg gcggaccgcg gggcggagct gccgcccgtg 180
agtccggccg agccacctga gcccgagccg cgggacaccg tcgctcctgc tctccgaatg 240
ctgcgcaccg cgatgggcct gaggagctgg ctcgccgccc catggggcgc gctgccgcct 300
cggccaccgc tgctgctgct cctgctgctg ctgctcctgc tgcagccgcc gcctccgacc 360
tgggcgctca gcccccggat cagcctgcct ctgggctctg aagagcggcc attcctcaga 420
ttcgaagctg aacacatctc caactacaca gcccttctgc tgagcaggga tggcaggacc 480
ctgtacgtgg gtgctcgaga ggccctcttt gcactcagta gcaacctcag cttcctgcca 540
ggcggggagt accaggagct gctttggggt gcagacgcag agaagaaaca gcagtgcagc 600
ttcaagggca aggacccaca gcgcgactgt caaaactaca tcaagatcct cctgccgctc 660
agcggcagtc acctgttcac ctgtggcaca gcagccttca gccccatgtg tacctacatc 720
aacatggaga acttcaccct ggcaagggac gagaagggga atgtcctcct ggaagatggc 780
aagggccgtt gtcccttcga cccgaatttc aagtccactg ccctggtggt tgatggcgag 840
ctctacactg gaacagtcag cagcttccaa gggaatgacc cggccatctc gcggagccaa 900
agccttcgcc ccaccaagac cgagagctcc ctcaactggc tgcaagaccc agcttttgtg 960
gcctcagcct acattcctga gagcctgggc agcttgcaag gcgatgatga caagatctac 1020
tttttcttca gcgagactgg ccaggaattt gagttctttg agaacaccat tgtgtcccgc 1080
attgcccgca tctgcaaggg cgatgagggt ggagagcggg tgctacagca gcgctggacc 1140
tccttcctca aggcccagct gctgtgctca cggcccgacg atggcttccc cttcaacgtg 1200
ctgcaggatg tcttcacgct gagccccagc ccccaggact ggcgtgacac ccttttctat 1260
ggggtcttca cttcccagtg gcacagggga actacagaag gctctgccgt ctgtgtcttc 1320
acaatgaatg atgtgcagag agtcttcagc ggcctctaca aggaggtgaa ccgtgagaca 1380
cagcagatgg tacaccgtga cccacccgtg cccacacccc ggcctggagc gtgcatcacc 1440
aacagtgccc gggaaaggaa gatcaactca tccctgcagc tcccagaccg cgtgctgaac 1500
tttctcaagg accacttcct gatggacggg caggtccgaa gccgcatgct gctgctgcag 1560
ccccaggctc gctaccagcg cgtggctgta caccgcgtcc ctggcctgca ccacacctac 1620
gatgtcctct tcctgggcac tggtgacggc cggctccaca aggcagtgag cgtgggcccc 1680
cgggtgcaca tcattgagga gctgcagatc ttctcatcgg gacagcccgt gcagaatctg 1740
ctcctggaca cccacagggg gctgctgtat gcggcctcac actcgggcgt agtccaggtg 1800
cccatggcca actgcagcct gtaccggagc tgtggggact gcctcctcgc ccgggacccc 1860
tactgtgctt ggagcggctc cagctgcaag cacgtcagcc tctaccagcc tcagctggcc 1920
accaggccgt ggatccagga catcgaggga gccagcgcca aggacctttg cagcgcgtct 1980
tcggttgtgt ccccgtcttt tgtaccaaca ggggagaagc catgtgagca agtccagttc 2040
cagcccaaca cagtgaacac tttggcctgc ccgctcctct ccaacctggc gacccgactc 2100
tggctacgca acggggcccc cgtcaatgcc tcggcctcct gccacgtgct acccactggg 2160
gacctgctgc tggtgggcac ccaacagctg ggggagttcc agtgctggtc actagaggag 2220
ggcttccagc agctggtagc cagctactgc ccagaggtgg tggaggacgg ggtggcagac 2280
caaacagatg agggtggcag tgtacccgtc attatcagca catcgcgtgt gagtgcacca 2340
gctggtggca aggccagctg gggtgcagac aggtcctact ggaaggagtt cctggtgatg 2400
tgcacgctct ttgtgctggc cgtgctgctc ccagttttat tcttgctcta ccggcaccgg 2460
aacagcatga aagtcttcct gaagcagggg gaatgtgcca gcgtgcaccc caagacctgc 2520
cctgtggtgc tgccccctga gacccgccca ctcaacggcc tagggccccc tagcacccca 2580
ctcgatcacc gagggtacca gtccctgtca gacagccccc cggggtcccg agtcttcact 2640
gagtcagaga agaggccact cagcatccaa gacagcttcg tggaggtatc cccagtgtgc 2700
ccccggcccc gggtccgcct tggctcggag atccgtgact ctgtggtgtg agagctgact 2760
tccagaggac gctgccctgg cttcaggggc tgtgaatgct cggagagggt caactggacc 2820
tcccctccgc tctgctcttc gtggaacacg accgtggtgc ccggcccttg ggagccttgg 2880
ggccagctgg cctgctgctc tccagtcaag tagcgaagct cctaccaccc agacacccaa 2940
acagccgtgg ccccagaggt cctggccaaa tatgggggcc tgcctaggtt ggtggaacag 3000
tgctccttat gtaaactgag ccctttgttt aaaaaacaat tccaaatgtg aaactagaat 3060
gagagggaag agatagcatg gcatgcagca cacacggctg ctccagttca tggcctccca 3120
ggggtgctgg ggatgcatcc aaagtggttg tctgagacag agttggaaac cctcaccaac 3180
tggcctcttc accttccaca ttatcccgct gccaccggct gccctgtctc actgcagatt 3240
caggaccagc ttgggctgcg tgcgttctgc cttgccagtc agccgaggat gtagttgttg 3300
ctgccgtcgt cccaccacct cagggaccag agggctaggt tggcactgcg gccctcacca 3360
ggtcctgggc tcggacccaa ctcctggacc tttccagcct gtatcaggct gtggccacac 3420
gagaggacag cgcgagctca ggagagattt cgtgacaatg tacgcctttc cctcagaatt 3480
cagggaagag actgtcgcct gccttcctcc gttgttgcgt gagaacccgt gtgccccttc 3540
ccaccatatc caccctcgct ccatctttga actcaaacac gaggaactaa ctgcaccctg 3600
gtcctctccc cagtccccag ttcaccctcc atccctcacc ttcctccact ctaagggata 3660
tcaacactgc ccagcacagg ggccctgaat ttatgtggtt tttatacatt ttttaataag 3720
atgcacttta tgtcattttt taataaagtc tgaagaatta ctgttt 3766
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>13
cagtgccaac ctagccctct 20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>14
tctcccgatc caaccgtgac 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>15
caacaactac atcctcggct 20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>16
tcggctccta catcaacaac 20
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
cctcgcccgg gacccctact gtgc 24
<210>18
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
cttggcgctg gctccctcga tgtcctg 27
<210>19
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
aattgaattc atgctgcgca ccgcgatg 28
<210>20
<21l>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
aagctctaga caccacagag tcacggatct 30
<210>21
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
aagctctaga tcacaccaca gagtcacgga 30
<210>22
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>22
Asn Ser Ala Arg Glu Arg Lys Ile Asn Ser Ser Cys
5 10
<210>23
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>23
Ser Val Val Ser Pro Ser Phe Val Pro Thr Gly Glu Lys Pro Cys
5 10 15
<210>24
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>24
Pro Leu Asp His Arg Gly Tyr Gln Ser Leu Ser Asp Ser Pro Cys
5 10 15
<210>25
<211>14
<212>PRT
<213>人
<400>25
Ser Arg Val Phe Thr Glu Ser Glu Lys Arg Pro Leu Ser Cys
5 10
Claims (42)
1、蛋白质或其盐，其含有与序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列。
2、蛋白质或其盐，其包含序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列。
3、权利要求1所述的蛋白质的部分肽或其盐。
4、多核苷酸，其含有编码权利要求1所述的蛋白质或其部分肽的多核苷酸。
5、权利要求4所述的多核苷酸，其为DNA。
6、权利要求5所述的多核苷酸，其含有序列号：5、序列号：8或序列号：11所示的碱基序列。
7、多核苷酸，其包含序列号：5、序列号：8或序列号：11所示的碱基序列。
8、重组载体，其含有权利要求4所述的多核苷酸。
9、被权利要求8所述的重组载体转化了的转化体。
10、权利要求1所述的蛋白质或其部分肽或其盐的制备方法，其特征在于，培养权利要求9所述的转化体，从而生成·蓄积权利要求1所述的蛋白质或其部分肽。
11、含有权利要求1所述的蛋白质或其部分肽或其盐的药物。
12、含有权利要求4所述的多核苷酸的药物。
13、含有权利要求4所述的多核苷酸的诊断药物。
14、一种抗体，其是权利要求1所述的蛋白质或其部分肽或其盐的抗体。
15、含有权利要求14所述抗体的药物。
16、含有权利要求14所述抗体的诊断药物。
17、多核苷酸，其含有与权利要求4所述多核苷酸互补或者基本上互补的碱基序列的全部或其一部分。
18、含有权利要求17所述多核苷酸的药物。
19、权利要求1所述的蛋白质的定量方法，其特征在于，使用权利要求14所述的抗体。
20、与权利要求1所述的蛋白质或其功能相关的疾病的诊断方法，其特征在于，使用权利要求19所述的定量方法。
21、抑制权利要求1所述蛋白质的表达的化合物或其盐的筛选方法，其特征在于，使用权利要求1所述的蛋白质或其部分肽或其盐。
22、用于筛选抑制权利要求1所述的蛋白质表达的化合物或其盐的试剂盒，其含有权利要求1所述的蛋白质或其部分肽或其盐。
23、抑制权利要求1所述蛋白质的基因表达的化合物或其盐的筛选方法，其特征在于，使用权利要求4所述的多核苷酸。
24、用于筛选抑制权利要求1所述蛋白质的基因表达的化合物或其盐的试剂盒，其含有权利要求4所述的多核苷酸。
25、权利要求11、12、15或18所述的药物，其为癌症预防·治疗剂。
26、权利要求11、12、15或18所述的药物，其为细胞凋亡促进剂。
27、权利要求13或16所述的诊断药物，其为癌症的诊断药物。
28、细胞凋亡促进剂，其含有抑制权利要求1所述的蛋白质或其部分肽表达或者抑制该蛋白质的基因表达的物质。
29、细胞凋亡促进剂，其含有下述蛋白质或其部分肽或其盐的抗体，所述蛋白质包含与序列号：1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列。
30、癌症预防·治疗剂，其含有下述蛋白质或其部分肽或其盐的抗体，所述蛋白质包含与序列号：1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列。
31、多核苷酸，其含有与编码下述蛋白质或其部分肽的多核苷酸的碱基序列互补或基本上互补的碱基序列或其一部分，所述蛋白质包含与序列号：1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列。
32、含有权利要求31所述的多核苷酸的药物。
33、权利要求32所述的药物，其为细胞凋亡促进剂。
34、细胞凋亡促进剂的筛选方法，其特征在于，使用编码下述蛋白质或其部分肽的多核苷酸，所述蛋白质包含与序列号：1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列。
35、用于筛选细胞凋亡促进剂的试剂盒，其特征在于，含有编码下述蛋白质或其部分肽的多核苷酸，所述蛋白质包含与序列号：1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列。
36、细胞凋亡促进剂，其含有抑制下述蛋白质或其部分肽表达或者抑制该蛋白质的基因表达的物质，所述蛋白质包含与序列号：1所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列。
37、癌症预防·治疗方法，其特征在于，向哺乳动物施用有效量的(i)抑制下述蛋白质或其部分肽或其盐表达的物质，所述蛋白质包含与序列号：1、序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；(ii)抑制该蛋白质或其部分肽的基因表达的物质；或(iii)该蛋白质或其部分肽或其盐的抗体。
38、癌细胞的细胞凋亡促进方法，其特征在于，向哺乳动物施用有效量的(i)抑制下述蛋白质或其部分肽或其盐表达的物质，所述蛋白质包含与序列号：1、序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；(ii)抑制该蛋白质或其部分肽的基因表达的物质；或(iii)该蛋白质或其部分肽或其盐的抗体。
39、癌症的预防·治疗方法，其特征在于，抑制下述蛋白质或其部分肽或其盐表达，所述蛋白质包含与序列号：1、序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；或者抑制该蛋白质或其部分肽的基因表达。
40、癌细胞的细胞凋亡促进方法，其特征在于，抑制下述蛋白质或其部分肽或其盐表达，所述蛋白质包含与序列号：1、序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；或抑制该蛋白质或其部分肽的基因表达。
41、下述物质在制备癌症预防·治疗剂中的用途，所述物质为(i)抑制下述蛋白质或其部分肽或其盐表达的物质，所述蛋白质包含与序列号：1、序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；(ii)抑制该蛋白质或其部分肽的基因表达的物质；或(iii)该蛋白质或其部分肽或其盐的抗体。
42、下述物质在制备癌细胞细胞凋亡促进剂中的用途，所述物质为(i)抑制下述蛋白质或其部分肽或其盐表达的物质，所述蛋白质包含与序列号：1、序列号：4、序列号：7或序列号：10所示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列；(ii)抑制该蛋白质或其部分肽的基因表达的物质；或(iii)该蛋白质或其部分肽或其盐的抗体。
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