CN112512545A - 活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂 - Google Patents

活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂 Download PDF

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CN112512545A CN201980049910.XA CN201980049910A CN112512545A CN 112512545 A CN112512545 A CN 112512545A CN 201980049910 A CN201980049910 A CN 201980049910A CN 112512545 A CN112512545 A CN 112512545A
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Abstract

本发明提供一种活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，涉及含有具有富组氨酸序列的肽作为有效成分的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂。该富组氨酸序列为由以下所示的序列号2～8中的任一种或多种确定的氨基酸序列(序列号2)DLHPH(序列号3)KHHSH(序列号4)EQHPH(序列号5)GHHPH(序列号6)AHHPH(序列号7)EHDTH(序列号8)RQHPH。

Description

活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂
技术领域
本发明涉及活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂。具体而言，涉及作为有效成分而含有具有富组氨酸序列的肽的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂。
本申请要求通过引用而援引在此的日本申请的日本特愿2018-105652号的优先权。
背景技术
在活性氧类(Reactive Oxygen Species：ROS)中，存在自由基的活性氧和非自由基的活性氧。在包括脂质关联物质的广义的意义上的活性氧中，作为自由基，以反应性由高到低的顺序，可列举为羟基自由基(·OH)、烷氧基自由基(LO·)、过氧自由基(LOO·)、过氧化氢自由基(HOO·)、一氧化氮(NO·)、二氧化氮(NO2·)、超氧阴离子自由基(O2 -·)等。作为非自由基的活性氧，可列举为单态氧(1O2)、臭氧(O3)、过氧化氢(H2O2)、脂质过氧化氢(LOOH)等。
生物体内的过剩的活性氧类在超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase：SOD)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等生物体内抗氧化机制的作用下被去除。但是，若抗氧化机制因老化、疾病等降低，则由活性氧类引起的各种疾病风险变高。例如，当因铁的过量摄取而在肝脏中积蓄铁时，由于芬顿反应而促进羟基自由基的产生，使肝炎等发病。作为芬顿反应抑制剂，公开了以D-半胱氨酸作为有效成分的药剂(专利文献1)。在专利文献1中，记载了为了阻碍羟基自由基的生成、消除单态氧而使用D-半胱氨酸的内容。在活性氧抑制剂中使用虾青素和姜黄素的内容被公开(专利文献2)。在专利文献2中，记载了作为用于防止食品、医药品的脂质等容易氧化的成分的氧化的活性氧抑制剂而使用虾青素和姜黄素的内容。但是，据认为，专利文献1以及专利文献2所示的药剂存在经肠道吸收极低而生物体利用率较低的问题。羟基自由基在产生后立即与附近的分子发生反应，发挥较强的氧化力。而且，据认为，引起可逆或不可逆的细胞障碍，其结果是引起各种疾病。为了防止该细胞障碍、疾病等，正在开发大量的药剂，但羟基自由基的反应性非常高、且寿命非常短，因此在羟基自由基产生后捕捉该羟基自由基的药剂的效果有限。
富组氨酸糖蛋白质(Histidine-rich glycoprotein；HRG)是由Heimburger等(1972)鉴定的分子量约为80kDa的血浆蛋白质。是由合计507个氨基酸构成、且其中存在66个组氨酸的高度含有组氨酸的蛋白质，主要在肝脏中合成，以约100～150μg/mL这样的被认为是非常高的浓度存在于人血浆中。已知HRG参与凝血纤溶系统的调节、血管新生的控制(非专利文献1)。进一步地，公开了通过给药包含HRG的部分的多肽(以下，也称为“HRG多肽”)来阻碍血管形成的方法、包含HRG多肽、与HRG多肽结合的抗体以及受体、HRG缺乏性血浆以及多核苷酸、对HRG多肽进行编码的载体以及宿主细胞的制药组合物以及产品(专利文献3)。另外，关于血管新生的领域，存在与含有来源于HRG的中央区域的亚片段的、具有抗血管新生活性的实质上纯粹的连续多肽的使用相关的公开(专利文献4)。进一步地，还公开了以HRG作为有效成分的嗜中性粒细胞-血管内皮细胞粘附抑制剂(专利文献5)。虽然像这样阐明了HRG的作用，但没有关于抗氧化作用的报道。
使用由特别的结构构成的基因表达盒来制作目标蛋白质的内容(专利文献6)被公开。其中，示出了通过使用该基因表达盒，能够得到能够稳定且高产地产生目标蛋白质的细胞的内容，作为所制作的蛋白质的例子，在实施例中示出了HRG、HRG-Fc融合蛋白质等。
包括嗜中性粒细胞在内的吞噬细胞因细菌、各种颗粒状或可溶性刺激物等使存在于细胞膜中的NAD(P)H氧化酶活化，从而产生活性氧。例如，在非专利文献2中也进行了报道。在非专利文献2中，虽然示出了HRG对嗜中性粒细胞产生的各种作用，但未示出对由嗜中性粒细胞产生的活性氧的作用。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Blood,Vol.117,No.7,2093-2101(2011)
非专利文献2：EBioMedicine,9,180-194(2016),Available online 4 June 2016
专利文献
专利文献1：日本特开2001-288078号公报
专利文献2：日本特开2014-019660号公报
专利文献3：日本特表2004-527242号公报
专利文献4：日本特表2007-528710号公报
专利文献5：日本专利第5807937号公报(国际公开2013/183494号)
专利文献6：国际公开2017/061354号
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的问题在于提供一种活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂。
用于解决问题的手段
提供一种以具有富组氨酸序列的肽作为有效成分的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂。本申请的发明人为了解决上述问题而反复进行深入研究的结果是，首次发现具有富组氨酸序列的肽具有羟基自由基、过氧自由基的产生抑制、消除活性，从而完成了本发明。
即，本发明由以下构成。
1、一种活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其以具有富组氨酸序列的肽作为有效成分。
2、根据前项1所述的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其中，富组氨酸序列为选自序列号1所示的氨基酸序列的一部分，且包含至少5个氨基酸，该5个氨基酸中的2个以上的氨基酸为组氨酸。
3、根据前项1或2所述的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其中，富组氨酸序列为由以下所示的序列号2～8中的任一种或多种确定的氨基酸序列。
(序列号2)DLHPH
(序列号3)KHHSH
(序列号4)EQHPH
(序列号5)GHHPH
(序列号6)AHHPH
(序列号7)EHDTH
(序列号8)RQHPH
4、根据前项2或3所述的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其中，作为有效成分的具有富组氨酸序列的肽包含1～20个富组氨酸序列。
5、根据前项1所述的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其中，作为有效成分的具有富组氨酸序列的肽包含从序列号1所示的氨基酸序列的N末端起第330～389位所确定的氨基酸序列、或者在从所述序列号1所示的氨基酸序列的N末端起第330～389位所确定的氨基酸序列中取代、缺失、附加、或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任意至少一种的氨基酸序列。
6、根据前项1所述的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其中，作为有效成分的具有富组氨酸序列的肽包含序列号1所示的氨基酸序列、或者在所述序列号1所示的氨基酸序列中取代、缺失、附加、或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任意至少一种的氨基酸序列。
7、根据前项1～6中任一项所述的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其中，活性氧是羟基自由基和/或过氧自由基。
8、根据前项1～7中任一项所述的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其中，所述活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂用于生物体内的过剩的活性氧的产生抑制和/或消除促进。
A、一种活性氧的产生抑制方法和/或消除促进方法，其中，使用具有富组氨酸序列的肽作为有效成分。
B、根据前项A所述的活性氧的产生抑制方法和/或消除促进方法，其中，富组氨酸序列为选自序列号1所示的氨基酸序列的部分，且包含至少5个氨基酸，该5个氨基酸中的2个以上的氨基酸为组氨酸。
C、根据前项A或B所述的活性氧的产生抑制方法和/或消除促进方法，其中，富组氨酸序列为由以下所示的序列号2～8中的任一种或多种确定的氨基酸序列。
(序列号2)DLHPH
(序列号3)KHHSH
(序列号4)EQHPH
(序列号5)GHHPH
(序列号6)AHHPH
(序列号7)EHDTH
(序列号8)RQHPH
D、根据前项B或C所述的活性氧的产生抑制方法和/或消除促进方法，其中，具有富组氨酸序列的肽包含1～20个富组氨酸序列。
E、根据前项A所述的活性氧的产生抑制方法和/或消除促进方法，其中，作为有效成分的具有富组氨酸序列的肽包含从序列号1所示的氨基酸序列的N末端起第330～389位所确定的氨基酸序列、或者在从所述序列号1所示的氨基酸序列的N末端起第330～389位所确定的氨基酸序列中取代、缺失、附加、或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任意至少一种的氨基酸序列。
F、根据前项A所述的活性氧的产生抑制方法和/或消除促进方法，其中，作为有效成分的具有富组氨酸序列的肽包含序列号1所示的氨基酸序列、或者在所述序列号1所示的氨基酸序列中取代、缺失、附加、或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任意至少一种的氨基酸序列。
G、根据前项A～F中任一项所述的活性氧的产生抑制方法和/或消除促进方法，其中，活性氧是羟基自由基和/或过氧自由基。
H、根据前项A～G中任一项所述的活性氧的产生抑制方法和/或消除促进方法，其中，所述活性氧的产生抑制方法和/或消除促进方法用于生物体内的过剩的活性氧的产生抑制和/或消除促进。
发明效果
本发明的以具有富组氨酸序列的肽作为有效成分的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂在无细胞的体系中也具有羟基自由基、过氧自由基的产生抑制、消除活性。具有富组氨酸序列的肽与二价的铁离子结合，抑制基于芬顿反应的反应性极高的羟基自由基的产生。
附图说明
图1是表示具有富组氨酸序列的肽、HRG的结构的图。
图2是表示HRG针对羟基自由基的抗氧化作用的图。图2中的A是表示作为对照的没食子酸(GA)针对羟基自由基的抗氧化作用的图。图2中的B是表示各浓度的HRG针对羟基自由基的抗氧化作用的图。图2中的C是表示各浓度的HRG或GA针对羟基自由基的抗氧化作用的图。(实施例1)
图3是表示富组氨酸肽针对羟基自由基的抗氧化作用的图。图3中的A是表示缓冲液、HRG、富组氨酸肽以及对照肽针对羟基自由基的抗氧化作用的图。图3中的B是表示各浓度的富组氨酸肽的抗氧化作用的图。图3中的C是表示HRG或富组氨酸肽针对羟基自由基的抗氧化作用的图。(实施例2)
图4-1是表示HRG与各种金属离子的结合性的图。且是表示HRG与二价铁离子、三价铁离子、二价钴离子的结合性的图。(实施例3)
图4-2是表示HRG与各种金属离子的结合性的图。且是表示HRG与二价锌离子、二价铜离子、二价镍离子的结合性的图。(实施例3)
图5-1是表示序列号10所示的富组氨酸肽与各种金属离子的结合性的图。且是表示富组氨酸肽与二价铁离子、三价铁离子、二价钴离子的结合性的图。(实施例3)
图5-2是表示富组氨酸肽与各种金属离子的结合性的图。且是表示富组氨酸肽与二价锌离子、二价铜离子、二价镍离子的结合性的图。(实施例3)
图6-1是表示序列号11所示的对照肽与各种金属离子的结合性的图。且是表示对照肽与二价铁离子、三价铁离子、二价钴离子的结合性的图。(实施例3)
图6-2是表示对照肽与各种金属离子的结合性的图。且是表示对照肽与二价锌离子、二价铜离子、二价镍离子的结合性的图。(实施例3)
图7是表示针对过氧自由基的抗氧化作用的图。图7中的A是表示作为对照的水溶性维生素E(Tro)针对过氧自由基的抗氧化作用的图。图7中的B是表示各浓度的HRG针对过氧自由基的抗氧化作用的图。图7中的C是表示各浓度的HRG或水溶性维生素E针对过氧自由基的抗氧化作用的图。(实施例4)
图8是表示富组氨酸肽针对过氧自由基的抗氧化作用的图。图8中的A是表示缓冲液、HRG、富组氨酸肽以及对照肽针对过氧自由基的抗氧化作用的图。图8中的B是表示各浓度的富组氨酸肽针对过氧自由基的抗氧化作用的图。图8中的C是表示HRG或富组氨酸肽针对过氧自由基的抗氧化作用的图。(实施例5)
图9是表示HRG不具有针对超氧化物的抗氧化作用的结果的图。(参考例1)
图10是表示HRG不具有过氧化氢酶样活性的结果的图。(参考例2)
具体实施方式
本发明涉及“以具有富组氨酸序列的肽作为有效成分的、活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂”。成熟HRG由序列号1所示的氨基酸序列构成，是由合计507个氨基酸构成、且是其中存在66个组氨酸的高度含有组氨酸的蛋白质。构成成熟HRG的氨基酸序列中，从N末端起第330～389位所确定的部位被称为富组氨酸结构域(参照图1)。
作为本发明的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂中含有的有效成分的“具有富组氨酸序列的肽”可以是由序列号1所示的氨基酸序列构成的成熟HRG蛋白质，也可以是作为选自序列号1所示的氨基酸序列中的一部分的、包含一个至多个富组氨酸结构域的肽、多肽或蛋白质。进一步地，本发明的“具有富组氨酸序列的肽”只要是包含后述的“富组氨酸序列”的肽、多肽或蛋白质即可，并不限定于由序列号1所示的氨基酸序列或选自序列号1所示的氨基酸序列的部分序列构成的肽、多肽或蛋白质。优选为选自序列号1所示的氨基酸序列的一部分、且包含构成富组氨酸结构域的氨基酸序列。以下，在本说明书中，作为有效成分的“具有富组氨酸序列的肽”的概念中也包含HRG。
成熟HRG的氨基酸序列(序列号1)
VSPTDCSAVEPEAEKALDLINKRRRDGYLFQLLRIADAHLDRVENTTVYYLVLDVQESDCSVLSRKYWNDCEPPDSRRPSEIVIGQCKVIATRHSHESQDLRVIDFNCTTSSVSSALANTKDSPVLIDFFEDTERYRKQANKALEKYKEENDDFASFRVDRIERVARVRGGEGTGYFVDFSVRNCPRHHFPRHPNVFGFCRADLFYDVEALDLESPKNLVINCEVFDPQEHENINGVPPHLGHPFHWGGHERSSTTKPPFKPHGSRDHHHPHKPHEHGPPPPPDERDHSHGPPLPQGPPPLLPMSCSSCQHATFGTNGAQRHSHNNNSSDLHPHKHHSHEQHPHGHHPHAHHPHEHDTHRQHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHCHDFQDYGPCDPPPHNQGHCCHGHGPPPGHLRRRGPGKGPRPFHCRQIGSVYRLPPLRKGEVLPLPEANFPSFPLPHHKHPLKPDNQPFPQSVSESCPGKFKSGFPQVSMFFTHTFPK
在本说明书中，“具有富组氨酸序列的肽”中的“富组氨酸序列”是指，为选自序列号1所示的氨基酸序列的一部分、且包含至少5个氨基酸，该5个氨基酸中的2个以上、优选为3个以上的氨基酸为组氨酸的序列。具体而言，可列举为序列号2～8所示的氨基酸序列。
富组氨酸序列
(序列号2)DLHPH
(序列号3)KHHSH
(序列号4)EQHPH
(序列号5)GHHPH
(序列号6)AHHPH
(序列号7)EHDTH
(序列号8)RQHPH
作为上述有效成分的“具有富组氨酸序列的肽”可以是由上述富组氨酸序列、例如序列号2～8中的任一个所示的富组氨酸序列构成的肽本身，也可以是包含两个以上的例如序列号2～8中的任一个所示的富组氨酸序列的肽。在包含两个以上序列号2～8中的任一个所示的富组氨酸序列的情况下，可以是包含两个以上相同富组氨酸序列的肽，也可以是分别包含不同富组氨酸序列的肽。该具有富组氨酸序列的肽中含有的“富组氨酸序列”的数量没有特别限定，可以为一个至多个，例如为1～20个、1～15个，优选为1～12个，更优选为2～12个。在含有多处该富组氨酸序列的情况下，可以连续地含有，也可以在之间夹着不同的氨基酸序列。在序列号1所示的氨基酸序列中，包含一个由序列号2确定的富组氨酸序列、一个由序列号3确定的富组氨酸序列、一个由序列号4确定的富组氨酸序列、六个由序列号5确定的富组氨酸序列、一个由序列号6确定的富组氨酸序列、一个由序列号7确定的富组氨酸序列、一个由序列号8确定的富组氨酸序列。
作为有效成分的“具有富组氨酸序列的肽”可以是包含从序列号1所示的氨基酸序列的N末端起第330～389位所确定的氨基酸序列、或者在从上述序列号1所示的氨基酸序列的N末端起第330～389位所确定的氨基酸序列中取代、缺失、附加、或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任意至少一种的氨基酸序列的肽或蛋白质。进一步地，作为有效成分的“具有富组氨酸序列的肽或富组氨酸糖蛋白质”可以是包含序列号1所示的氨基酸序列、或者在上述序列号1所示的氨基酸序列中取代、缺失、附加、或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任意至少一种的氨基酸序列的肽或蛋白质。
在本发明的作为有效成分的具有富组氨酸序列的肽为HRG的情况下，该成熟HRG能够通过从生物体成分中分离、纯化来制备的方法、使用基因重组技术来制作的方法、或者通过合成来进行制作。来自生物体成分的分离、纯化，例如可以从血浆、血清等血液、脊髓液、淋巴液等生物体成分中纯化或分离。优选的生物体成分为血浆、血清等血液成分。从生物体成分中分离、纯化的方法可以应用自身公知的方法或今后开发的所有方法。例如，也可以通过使血浆通过使用Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid，镍-次氮基三乙酸)琼脂糖树脂制备的亲和柱来进行制备。
在使用基因重组技术来制作本发明的作为有效成分的具有富组氨酸序列的肽的情况下，可以应用自身公知的方法或今后开发的所有方法。也可以将对具有该富组氨酸序列的肽进行编码的cDNA克隆到表达载体中来进行制备。例如，也可以是通过由GenBankAccession No.NM000412确定的核苷酸的整体或部分生物合成的蛋白质。例如，也可以将对成熟HRG的氨基酸序列(序列号1)进行编码的全长cDNA、或对其一部分进行编码的cDNA克隆到表达载体中来进行制作。使用基因重组技术来制作HRG的方法，具体而言，可以应用专利文献6所示的方法。例如将对HRG进行编码的全长cDNA、或对具有HRG活性的部分进行编码的cDNA、例如对成熟HRG的氨基酸序列(序列号1)进行编码的全长cDNA、或对其一部分进行编码的cDNA克隆到表达载体中来制备HRG表达载体。
具有富组氨酸序列的肽可以通过自身公知的肽制作方法来进行制作。例如也可以通过肽合成方法来进行制作。
由本发明的“活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂”进行产生抑制和/或消除促进的活性氧的种类没有特别限定，特别优选为羟基自由基、过氧自由基。活性氧是大气中含有的氧分子变化为反应性更高的化合物的总称。活性氧通过氧分子捕获不成对电子而按照超氧化物、过氧化氢、羟基自由基、过氧自由基的顺序生成。超氧化物是由氧分子生成的最初的还原体，是其他活性氧的前体，与对生物体而言具有重要作用的一氧化氮反应而使其作用消灭。活性氧用于排除侵入至生物体内或在生物体内生成的毒素等，能够通过氧化力使毒素氧化而使毒素功能消失。但是，活性氧的过剩的生成、在不应出现的场所的生成会破坏在该局部的生成与消除的平衡关系，成为所谓的氧化应激负荷的状态，活性氧攻击构成生物体的膜、组织的生物体内分子，诱发各种疾病。即，氧化应激不仅破坏毒素而且破坏身体中的细胞，从而成为老化的原因、或引起各种疾病。过剩的活性氧不仅对生物体膜、核酸、蛋白质、体内活性因子等造成各种障碍而引起膜脂质的过度氧化反应、氧化性损伤、蛋白质变性等，还作为大多数生命现象的信息传递的控制因素而发挥作用。
作为生成活性氧的环境因素，可列举为大气污染物质、放射线、某种药剂、紫外线、烟草等，在生物体内，可列举为线粒体电子传递系统、微粒体电子传递系统内的某种酶、氧化酶系酶、含铁蛋白质等。在炎症、缺血性疾病等的关联中，以嗜中性粒细胞为首的吞噬细胞也受到关注。包括嗜中性粒细胞在内的吞噬细胞因细菌、各种颗粒状或可溶性刺激物等，使存在于细胞膜中的NAD(P)H氧化酶活化而产生活性氧。生物体内的活性氧类作为各种疾病、不健康的原因而被阐明，活性氧类被认为是各种细胞死亡、癌症、动脉硬化、高血压、糖尿病等的原因之一。也可知由嗜中性粒细胞生成的过剩的活性氧类在以缺血再灌注损伤、自身免疫疾病为首的炎症反应中对组织障碍性起到作用。所产生的超氧化物酶性或非酶性地受到还原，成为反应性更高的活性氧(羟基自由基、过氧自由基)。认为在急性呼吸窘迫综合征、溃疡性大肠炎、急性胃粘膜病变、贝切特氏病等中，由活化的嗜中性粒细胞产生的活性氧类参与病变的形成。
在本发明的“活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂”中，除了作为有效成分的具有富组氨酸序列的有效量的肽以外，还可以适量含有药理学上可接受的载体等。作为该药理学上可接受的载体，例如可以列举为赋形剂(包括单糖类、低聚糖、多糖类)、崩解剂或崩解助剂、结合剂、润泽剂、润滑剂、包衣剂、色素、稀释剂、基剂、溶解剂或溶解助剂、等渗剂、pH调节剂、稳定剂、喷射剂、增稠剂(包括几丁质、几丁聚糖、增稠多糖类)以及粘接剂等。
本发明的“活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂”能够用作起因于生物体内的活性氧类的各种疾病、不健康的治疗剂或治疗辅助剂。各种疾病、不健康具体可列举为各种细胞死亡、癌症、动脉硬化、高血压、糖尿病、缺血再灌注损伤、急性呼吸窘迫综合征、急性胃黏膜病变、自身免疫疾病等。在自身免疫疾病中，可列举为溃疡性大肠炎、贝切特氏病等。
本发明的“活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂”为了作为上述疾病的治疗剂或治疗辅助剂使用，可以局部给药，也可以全身给药。其给药量、给药频率、给药期间，考虑对象疾病的种类、症状、对象者的年龄、性别来适当设定即可。在本发明的“活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂”为非口服给药的形态的情况下，可以含有灭菌后的水性的或非水性的溶液、悬浊液以及乳浊液。作为非水性稀释剂的例子，为丙二醇、聚乙二醇、植物油以及有机酯组合物，植物油例如为橄榄油，有机酯组合物例如为油酸乙酯，它们适于注射。水性载体可以包括药理学上可接受的水、醇性水性溶液、乳浊液、悬浊液、食盐水以及缓冲介质。非口服载体可以包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖以及氯化钠、林格氏乳酸以及结合油。静脉内载体例如可以包括液体用补充物、营养以及电解质(例如，基于林格氏葡萄糖的物质)。本发明的“活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂”还可以包含保存剂、稳定剂以及其他添加剂，例如抗微生物化合物(包括抗菌剂、抗生素)、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体等中的一种或两种以上。
本发明的“活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂”在作为上述疾病的治疗剂或治疗辅助剂使用的情况下，可以与其他的医药品制剂中的一种或两种以上并用来进行给药。作为可并用的其他医药品制剂，没有特别限定，通常可以是已经市售的治疗剂、预防剂、或今后开发的治疗剂、预防剂中的任一种。该其他的其他医药品制剂优选为与本发明的“活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂”的作用机理不同的医药品制剂。通过并用本发明的“活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂”，还能够减少其他医药品制剂的给药量。在其他医药品制剂具有副作用的情况下，通过并用本发明的“活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂”，能够减少其他医药品制剂的给药，是有用的。
本发明的“活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂”除了作为上述医药品的使用以外，还可以作为化妆品、健康食品、特定保健用食品、功能性食品等的原料、化妆品辅助剂、食品辅助剂来使用。
实施例
通过以下的实施例、实验例、比较例对本发明进行具体说明，但本发明当然并不限定于这些实施例等。
(实施例1)针对羟基自由基的抗氧化作用1
在本实验例中，关于HRG，对针对羟基自由基的抗氧化活性进行确认。在本实施例以及后述的实施例、参考例中使用的HRG以人血浆为起始原料，通过专利文献5(国际公开2013/183494号)的实施例1所示的方法进行制作。通过Hanks液(Hanks'Balanced SaltSolution：HBSS)进行稀释来制作各浓度的HRG试样。作为阳性对照，使用GA(没食子酸)。
针对羟基自由基的抗氧化活性使用OxiSelectTM HORAC Activity Assay Kit(Cell Biolabs,San Diego,CA)按照说明书进行测定。在试样溶液中加入荧光探针溶液，在37℃下孵育30分钟，加入羟基自由基引发剂(H2O2)和芬顿试剂，基于借助羟基自由基导致的氢原子移动(HAT；hydrogen atom transfer)的荧光探针的氧化来测量荧光强度(Ex/Em＝485nm/538nm)。在羟基自由基的存在下，荧光探针的荧光消光，在具有抗氧化活性的情况下，消光受到抑制。作为试样溶液，使用0.01～1μM的HRG溶液、或50～100μM的GA溶液。
A、对于50～100μM的GA(没食子酸)试样溶液，按照上述测定方法，以每隔五分钟测量一次共测量60分钟的方式，对荧光强度(Ex/Em＝485nm/538nm)进行测量。以GA和空白组的荧光强度为纵轴、且以测定时间为横轴进行绘制。对GA的依赖于浓度的、针对羟基自由基的抗氧化作用进行确认(图2中的A)。
B、对于0～1μM的HRG试样溶液，按照上述测定方法，以每隔五分钟测量一次共测量60分钟的方式，对荧光强度(Ex/Em＝485nm/538nm)进行测量。以HRG和空白组的荧光强度为纵轴、且以测定时间为横轴进行绘制。对HRG的依赖于浓度的、针对羟基自由基的抗氧化作用进行确认(图2中的B)。
C、针对羟基自由基的抗氧化活性(NetAUC)
对GA或HRG的荧光强度的曲线下面积(Area Under the Curve：AUCsample)与空白组的曲线下面积(AUCblank)之差，以在反应开始后每隔五分钟测定一次共测定60分钟的方式，计算出NetAUC。确认HRG针对羟基自由基具有较强的抗氧化作用(图2中的C)。
(实施例2)针对羟基自由基的抗氧化作用2
在本实施例中，通过与实施例1相同的方法确认富组氨酸肽(序列号10)对羟基自由基的抗氧化作用。针对对照肽(序列号11)也同样地进行了确认。
·富组氨酸肽：GHHPHGHHPH(序列号10)
·对照肽：GAAPAGAAPA(序列号11)
序列号10所示的氨基酸序列是将两个序列号5的氨基酸序列连结而成的序列，序列号11所示的氨基酸序列是将序列号10所示的氨基酸序列中的组氨酸取代为精氨酸的序列。上述各肽是利用Sigma Genosis公司的定制肽合成服务制作的。另外，本实施例的富组氨酸肽以及对照肽在后述的实施例、参考例中也使用。
A、向HRG(1μM)、富组氨酸肽(6μM)或对照肽(6μM)的各溶液中加入荧光探针溶液，通过与实施例1相同的方法测定针对羟基自由基的抗氧化活性。HRG以及富组氨酸肽具有较强的抗氧化作用，与此相对，对照肽与缓冲液(Buffer)同样地未显示出抗氧化作用(图3中的A)。
B、对于富组氨酸肽溶液(0.1～10μM)，加入荧光探针溶液，进行基于与实施例1相同的方法的针对羟基自由基的抗氧化活性的测定。富组氨酸肽显示出依赖于浓度的、较强的抗氧化活性(图3中的B)。
C、针对羟基自由基的抗氧化活性(NetAUC)
对组氨酸肽或HRG的荧光强度的曲线下面积(Area Under the Curve：AUCsample)与空白组的曲线下面积(AUCblank)之差，以在反应开始后每隔五分钟测定一次共测定60分钟的方式，计算出NetAUC。确认组氨酸肽以及HRG对羟基自由基具有较强的抗氧化作用(图3中的C)。
(实施例3)金属离子结合性
在本实施例中，为了调查HRG对芬顿反应中的作为必需因子的金属离子的结合性，使用量热法进行实验。量热仪使用MicroCal iTC200，按照说明书对各种金属(铁、铜、钴、锌、镍)与各试样的结合性进行测定。
其结果是，确认了HRG与二价金属离子(铁、铜、钴、锌、镍)结合(图4-1、图4-2)，但不与三价铁离子结合(图4-1)。本次是首次明确了HRG与二价铁离子结合。进一步地明确了多个二价金属离子与一个HRG分子结合，明确了HRG与二价金属离子有效地结合(图4-1)。进一步地确认了富组氨酸肽也与二价金属离子(铁、铜、钴、锌、镍)结合，但不与三价铁离子结合(图5-1、图5-2)。对照肽不与各种金属离子结合(图6-1、图6-2)。根据上述结果，确认了组氨酸对于二价金属离子的结合而言是很重要的。
进一步地明确了多个二价金属离子与一个HRG分子结合，明确了HRG与二价金属离子有效地结合。进一步地，根据富组氨酸肽(参照序列号10)是结合的中心，对照肽(参照序列号11)与二价金属离子不结合，表明组氨酸对该结合是重要的。由此可知，HRG通过与作为羟基自由基产生路径的芬顿反应所必需的二价金属离子(铁、钴等)结合，从而阻碍该反应。
(实施例4)针对过氧自由基的抗氧化作用1
在本实施例中，对于HRG，调查其针对过氧自由基的抗氧化作用。作为阳性对照，使用水溶性维生素E。针对过氧自由基的抗氧化活性使用OxiSelectTM ORAC Activity AssayKit(Cell Biolabs,San Diego,CA)按照说明书进行测定。在试样溶液中加入荧光探针溶液，在37℃下孵育30分钟，加入2,2'-偶氮双-(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(AAPH)，立即测量荧光强度(Ex/Em＝485nm/538nm)。在过氧自由基的存在下，荧光探针的荧光消光，在具有抗氧化活性的情况下，消光受到抑制。
A、对于0～6.25μM的水溶性维生素E试样溶液，以每隔五分钟测量一次共测量60分钟的方式，对荧光强度(Ex/Em＝485nm/538nm)进行测量。对水溶性维生素E的依赖于浓度的、针对过氧自由基的抗氧化作用进行确认(图7中的A)。
B、对于0～1μM的HRG试样溶液，按照上述测定方法，以每隔五分钟测量一次共测量60分钟的方式，对荧光强度(Ex/Em＝485nm/538nm)进行测量。对HRG的依赖于浓度的、针对过氧自由基的抗氧化作用进行确认(图7中的B)。
C、针对过氧自由基的抗氧化活性(NetAUC)
对水溶性维生素E或HRG的荧光强度的曲线下面积(Area Under the Curve：AUCsample)与空白组的曲线下面积(AUCblank)之差，以在反应开始后每隔五分钟测定一次共测定60分钟的方式，计算出NetAUC。确认HRG针对过氧自由基具有抗氧化作用(图7中的C)。
(实施例5)针对过氧自由基的抗氧化作用2
在本实施例中，对于富组氨酸肽，以与实施例4同样的方式，调查针对过氧自由基的抗氧化作用。
A、向HRG(1μM)、富组氨酸肽(6μM)或对照肽(6μM)的各溶液中加入荧光探针溶液，通过与实施例4相同的方法测定针对过氧自由基的抗氧化活性。HRG显示出较强的抗氧化作用，与此相对，富组氨酸肽虽然稍弱但也显示出抗氧化作用。对照肽与缓冲液(Buffer)同样地未显示出抗氧化作用(图8中的A)。
B、对于富组氨酸肽溶液(0.1～10μM)，加入荧光探针溶液，进行基于与实施例4相同的方法的针对过氧自由基的抗氧化活性的测定。富组氨酸肽显示出虽然稍低但依赖于浓度的抗氧化活性(图8中的B)。
C、针对过氧自由基的抗氧化活性(NetAUC)
对富组氨酸肽或HRG的荧光强度的曲线下面积(Area Under the Curve：AUCsample)与空白组的曲线下面积(AUCblank)之差，以在反应开始后每隔五分钟测定一次共测定60分钟的方式，计算出NetAUC。HRG对于过氧自由基具有抗氧化作用，但富组氨酸肽的抗氧化活性比HRG弱(图8中的C)。启示了HRG针对过氧自由基的效果不仅是由富组氨酸区域产生的作用。
(参考例1)HRG针对超氧化物的抗氧化作用
在本参考例中，使用DetectX Superoxide Dismutase(SOD)ColorimetricActivity Kit(Arbor Assays,Ann Arbor,MI)来确认HRG针对超氧化物的抗氧化作用。HRG使用通过实施例1所示的方法制作的来源于血浆的HRG。超氧化物阴离子(O2-)由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶(XOD)系统产生，使用色原体溶液进行检测。超氧化物歧化酶(SOD)是对从O2-向氧分子和过氧化氢的变化进行催化的金属酶。由于SOD的存在，上述O2-浓度降低，使色素信号降低。
按照说明书，在0.01～1μM的HRG溶液中加入黄嘌呤氧化酶和底物，在室温下孵育20分钟后，针对反应溶液测定波长450nm下的吸光度。作为对照，针对SOD也同样地进行测定。其结果是，明确了HRG不具有针对过氧化物的消除活性(图9)。
(参考例2)HRG的过氧化氢酶作用
在本参考例中，使用OxiSelectTM Catalase Activity Assay Kit(Cell Biolabs,San Diego,CA)，确认HRG是否具有过氧化氢酶样活性。HRG使用通过实施例1所示的方法制作的来源于血浆的HRG。使已知量的过氧化氢与0.01～1μM的HRG反应，接着，针对残留的过氧化氢，在HRP的存在下，对探针(比色测定：DHBS+AAP，荧光测定：ADHP(10-乙酰基-3,7-二羟基苯噁嗪))在37℃下孵育30分钟，对产生的荧光强度(Ex/Em＝544nm/590nm)进行测定。作为对照，对过氧化氢酶也同样地进行测定。其结果是，明确了HRG不具有过氧化氢酶样活性(图10)。
由上述结果可确认，HRG以及富组氨酸肽对羟基自由基显示出较强的抗氧化活性。确认了这样的较强的抗氧化活性是由具有富组氨酸序列的部位的作用而产生的。HRG还示出了针对过氧自由基的抗氧化活性。另一方面，HRG对超氧化物几乎没有显示出抗氧化作用。
工业实用性
如以上详细说明的那样，确认了本发明的具有富组氨酸序列的肽对羟基自由基显示出较强的抗氧化活性。确认了这样的较强的抗氧化活性是由HRG的富组氨酸结构域、具有富组氨酸序列的部位的作用而产生的。HRG还显示出了针对过氧自由基的抗氧化活性。另一方面，HRG对超氧化物几乎没有显示出抗氧化作用。
虽然尝试了各种针对活性氧的抗氧化剂的开发，但由于羟基自由基的反应性非常高、且寿命非常短，因此对羟基自由基有效地发挥作用的药剂的开发并没有取得进展。根据本发明的具有富组氨酸序列的肽，能够有效地抑制羟基自由基的产生。
SEQUENCE LISTING
<110> 国立大学法人冈山大学
<120> 活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂
<130> YU2068302JPP
<150> JP P2018-105652
<151> 2018-05-31
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 507
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Val Ser Pro Thr Asp Cys Ser Ala Val Glu Pro Glu Ala Glu Lys Ala
1 5 10 15
Leu Asp Leu Ile Asn Lys Arg Arg Arg Asp Gly Tyr Leu Phe Gln Leu
20 25 30
Leu Arg Ile Ala Asp Ala His Leu Asp Arg Val Glu Asn Thr Thr Val
35 40 45
Tyr Tyr Leu Val Leu Asp Val Gln Glu Ser Asp Cys Ser Val Leu Ser
50 55 60
Arg Lys Tyr Trp Asn Asp Cys Glu Pro Pro Asp Ser Arg Arg Pro Ser
65 70 75 80
Glu Ile Val Ile Gly Gln Cys Lys Val Ile Ala Thr Arg His Ser His
85 90 95
Glu Ser Gln Asp Leu Arg Val Ile Asp Phe Asn Cys Thr Thr Ser Ser
100 105 110
Val Ser Ser Ala Leu Ala Asn Thr Lys Asp Ser Pro Val Leu Ile Asp
115 120 125
Phe Phe Glu Asp Thr Glu Arg Tyr Arg Lys Gln Ala Asn Lys Ala Leu
130 135 140
Glu Lys Tyr Lys Glu Glu Asn Asp Asp Phe Ala Ser Phe Arg Val Asp
145 150 155 160
Arg Ile Glu Arg Val Ala Arg Val Arg Gly Gly Glu Gly Thr Gly Tyr
165 170 175
Phe Val Asp Phe Ser Val Arg Asn Cys Pro Arg His His Phe Pro Arg
180 185 190
His Pro Asn Val Phe Gly Phe Cys Arg Ala Asp Leu Phe Tyr Asp Val
195 200 205
Glu Ala Leu Asp Leu Glu Ser Pro Lys Asn Leu Val Ile Asn Cys Glu
210 215 220
Val Phe Asp Pro Gln Glu His Glu Asn Ile Asn Gly Val Pro Pro His
225 230 235 240
Leu Gly His Pro Phe His Trp Gly Gly His Glu Arg Ser Ser Thr Thr
245 250 255
Lys Pro Pro Phe Lys Pro His Gly Ser Arg Asp His His His Pro His
260 265 270
Lys Pro His Glu His Gly Pro Pro Pro Pro Pro Asp Glu Arg Asp His
275 280 285
Ser His Gly Pro Pro Leu Pro Gln Gly Pro Pro Pro Leu Leu Pro Met
290 295 300
Ser Cys Ser Ser Cys Gln His Ala Thr Phe Gly Thr Asn Gly Ala Gln
305 310 315 320
Arg His Ser His Asn Asn Asn Ser Ser Asp Leu His Pro His Lys His
325 330 335
His Ser His Glu Gln His Pro His Gly His His Pro His Ala His His
340 345 350
Pro His Glu His Asp Thr His Arg Gln His Pro His Gly His His Pro
355 360 365
His Gly His His Pro His Gly His His Pro His Gly His His Pro His
370 375 380
Gly His His Pro His Cys His Asp Phe Gln Asp Tyr Gly Pro Cys Asp
385 390 395 400
Pro Pro Pro His Asn Gln Gly His Cys Cys His Gly His Gly Pro Pro
405 410 415
Pro Gly His Leu Arg Arg Arg Gly Pro Gly Lys Gly Pro Arg Pro Phe
420 425 430
His Cys Arg Gln Ile Gly Ser Val Tyr Arg Leu Pro Pro Leu Arg Lys
435 440 445
Gly Glu Val Leu Pro Leu Pro Glu Ala Asn Phe Pro Ser Phe Pro Leu
450 455 460
Pro His His Lys His Pro Leu Lys Pro Asp Asn Gln Pro Phe Pro Gln
465 470 475 480
Ser Val Ser Glu Ser Cys Pro Gly Lys Phe Lys Ser Gly Phe Pro Gln
485 490 495
Val Ser Met Phe Phe Thr His Thr Phe Pro Lys
500 505
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Asp Leu His Pro His
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Lys His His Ser His
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Glu Gln His Pro His
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Gly His His Pro His
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Ala His His Pro His
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Glu His Asp Thr His
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Arg Gln His Pro His
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Gly Ala Ala Pro Ala Gly Ala Ala Pro Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Gly His His Pro His Gly His His Pro His
1 5 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 标准肽
<400> 11
Gly Ala Ala Pro Ala Gly Ala Ala Pro Ala
1 5 10

Claims (8)

1.一种活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其中，所述活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂以具有富组氨酸序列的肽作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其中，富组氨酸序列为选自序列号1所示的氨基酸序列的一部分，且包含至少5个氨基酸，该5个氨基酸中的2个以上的氨基酸为组氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其中，富组氨酸序列为由以下所示的序列号2～8中的任一种或多种确定的氨基酸序列。
(序列号2)DLHPH
(序列号3)KHHSH
(序列号4)EQHPH
(序列号5)GHHPH
(序列号6)AHHPH
(序列号7)EHDTH
(序列号8)RQHPH
4.根据权利要求2或3所述的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其中，作为有效成分的具有富组氨酸序列的肽包含1～20个富组氨酸序列。
5.根据权利要求1所述的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其中，作为有效成分的具有富组氨酸序列的肽包含从序列号1所示的氨基酸序列的N末端起第330～389位所确定的氨基酸序列、或者在从所述序列号1所示的氨基酸序列的N末端起第330～389位所确定的氨基酸序列中取代、缺失、附加、或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任意至少一种的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其中，作为有效成分的具有富组氨酸序列的肽包含序列号1所示的氨基酸序列、或者在所述序列号1所示的氨基酸序列中取代、缺失、附加、或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列中的任意至少一种的氨基酸序列。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其中，活性氧是羟基自由基和/或过氧自由基。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂，其中，所述活性氧的产生抑制剂和/或消除促进剂用于生物体内的过剩的活性氧的产生抑制和/或消除促进。
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