JP2017169486A - 遺伝子発現用カセット及びその産生物 - Google Patents
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Abstract
Description
1.目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)が、プロモーター(P)とエンハンサー(P')で挟まれる構造を有する遺伝子発現用カセットにおいて、さらにプロモーター(P)の上流及びエンハンサー(P')の下流にトランスポゾン配列(T)を含むことを特徴とする、遺伝子発現用カセット。
2.さらに、プロモーター(P)の上流及び/又はエンハンサー(P')の下流に、複製開始配列(S)が配置されていることを特徴とする、前項1に記載の遺伝子発現用カセット。
3.プロモーター(P)、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)、エンハンサー(P')及びトランスポゾン配列(T)が含まれ、更に選択的に複製開始配列(S)を含む遺伝子発現用カセットが、以下の1)〜4)のいずれかに示す順序で含まれる、前項1又は2に記載の遺伝子発現用カセット:
1)(T)、(P)、(X)、(P')、(T);
2)(T)、(S)、(P)、(X)、(P')、(T);
3)(T)、(P)、(X)、(P')、(S)、(T);
4)(T)、(S)、(P)、(X)、(P')、(S)、(T)。
4.複製開始配列(S)の上流に核マトリックス結合配列(M)が配置されていることを特徴とする前項2又は3に記載の遺伝子発現用カセット。
5.トランスポゾン配列(T)、プロモーター(P)、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)、エンハンサー(P')、核マトリックス結合配列(M)、複製開始配列(S)及びトランスポゾン配列(T)を含む、遺伝子発現用カセット。
6.配列(S)が、ROIS及び/又はARSである前項2〜5のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
7.プロモーター(P)が、CMVプロモーター、CMV-iプロモーター、SV40プロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター及びCAGプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、前項1〜6のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
8.目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)の下流に連結したエンハンサー(P')が、hTERTエンハンサー、CMVエンハンサー及びSV40エンハンサーから選択されるいずれか1種又は複数種を含む、前項1〜7のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
9.目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)において、目的遺伝子が、HRG、PD-1、EMMPRIN、NPTNβ、EMB、RAGE、MCAM、ALCAM、ErbB2及び抗体のいずれかから選択されるタンパク質の部分又は全体をコードする遺伝子を含む、前項1〜8のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
10.前項1〜9のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを含む、遺伝子発現用プラスミド。
11.前項1〜9のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを含む、遺伝子発現用ベクター。
12.前項1〜9のいずれかに記載の発現用カセットを用いて目的遺伝子を発現させる方法。
13.前項1〜9のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを用いて産生されたタンパク質。
1)(T)、(P)、(X)、(P')、(T);
2)(T)、(S)、(P)、(X)、(P')、(T);
3)(T)、(P)、(X)、(P')、(S)、(T);
4)(T)、(S)、(P)、(X)、(P')、(S)、(T)。
本実施例では、各種コンストラクトの遺伝子発現用カセットを構築した。具体的には、IDT社のプロモーターのないクローニング用プラスミドベクター(pIDT-SMART)に特許文献4に示す一過性発現において最も高効率にタンパク質を産生可能な遺伝子発現用カセットを挿入することにより、pCMViR-TSC発現ベクターを作製した(図1)。pCMViRとは、CMV-iプロモーターの下流にRU5'配列が挿入されていることを示す。
CTCGTTCATTCACGTTTTTGAACCCGTGGAGGACGGGCAGACTCGCGGTGCAAATGTGTTTTACAGCGTGATGGAGCAGATGAAGATGCTCGACACGCTGCAGAACACGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGTGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTATGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAGGCCTCCACGGCC
TTCCTGTCCTCACAGGAACGAAGTCCCTAAAGAAACAGTGGCAGCCAGGTTTAGCCCCGGAATTGACTGGATTCCTTTTTTAGGGCCCATTGGTATGGCTTTTTCCCCGTATCCCCCCAGGTGTCTGCAGGCTCAAAGAGCAGCGAGAAGCGTTCAGAGGAAAGCGATCCCGTGCCACCTTCCCCGTGCCCGGGCTGTCCCCGCACGCTGCCGGCTCGGGGATGCGGGGGGAGCGCCGGACCGGAGCGGAGCCCCGGGCGGCTCGCTGCTGCCCCCTAGCGGGGGAGGGACGTAATTACATCCCTGGGGGCTTTGGGGGGGGGCTGTCCCTGATATCTATAACAAGAAAATATATATATAATAAGTTATCACGTAAGTAGAACATGAAATAACAATATAATTATCGTATGAGTTAAATCTTAAAAGTCACGTAAAAGATAATCATGCGTCATTTTGACTCACGCGGTCGTTATAGTTCAAAATCAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGCCTCACGGGAGCTCCAAGCGGCGACTGAGATGTCCTAAATGCACAGCGACGGATTCGCGCTATTTAGAAAGAGAGAGCAATATTTCAAGAATGCATGCGTCAATTTTACGCAGACTATCTTTCTAGGGTTAATCTAGCTGCATCAGGATCATATCGTCGGGTCTTTTTTCCGGCTCAGTCATCGCCCAAGCTGGCGCTATCTGGGCATCGGGGAGGAAGAAGCCCGTGCCTTTTCCCGCGAGGTTGAAGCGGCATGGAAAGAGTTTGCCGAGGATGACTGCTGCTGCATTGACGTTGAGCGAAAACGCACGTTTACCATGATGATTCGGGAAGGTGTGGCCATGCACGCCTTTAACGGTGAACTGTTCGTTCAGGCCACCTGGGATACCAGTTCGTCGCGGCTTTTCCGGACACAGTTCCGGATGGTCAGCCCGAAGCGCATCAGCAACCCGAACAATACCGGCGACAGCCGGAACTGCCGTGCCGGTGTGCAGATTAATGACAGCGGTGCGGCGCTGGGATATTACGTCAGCGAGGACGGGTATCCTGGCTGGATGCCGCAGAAATGGACATGGATA
AATCTGAGCCAAGTAGAAGACCTTTTCCCCTCCTACCCCTACTTTCTAAGTCACAGAGGCTTTTTGTTCCCCCAGACACTCTTGCAGATTAGTCCAGGCAGAAACAGTTAGATGTCCCCAGTTAACCTCCTATTTGACACCACTGATTACCCCATTGATAGTCACACTTTGGGTTGTAAGTGACTTTTTATTTATTTGTATTTTTGACTGCATTAAGAGGTCTCTAGTTTTTTACCTCTTGTTTCCCAAAACCTAATAAGTAACTAATGCACAGAGCACATTGATTTGTATTTATTCTATTTTTAGACATAATTTATTAGCATGCATGAGCAAATTAAGAAAAACAACAACAAATGAATGCATATATATGTATATGTATGTGTGTACATATACACATATATATATATATTTTTTTTCTTTTCTTACCAGAAGGTTTTAATCCAAATAAGGAGAAGATATGCTTAGAACTGAGGTAGAGTTTTCATCCATTCTGTCCTGTAAGTATTTTGCATATTCTGGAGACGCAGGAAGAGATCCATCTACATATCCCAAAGCTGAATTATGGTAGACAAAGCTCTTCCACTTTTAGTGCATCAATTTCTTATTTGTGTAATAAGAAAATTGGGAAAACGATCTTCAATATGCTTACCAAGCTGTGATTCCAAATATTACGTAAATACACTTGCAAAGGAGGATGTTTTTAGTAGCAATTTGTACTGATGGTATGGGGCCAAGAGATATATCTTAGAGGGAGGGCTGAGGGTTTGAAGTCCAACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAGCCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTG
TAGCTTGTATTTTTTGTAATTTAAAATAATGATGTATTAAAAACATTTGTATTCTCTATATATATTTTAAATTTAGTTTAATTTCATAAACATTTCTCAAGAGTATATTTTGTGCAGGGCATATTGCTAGTCATTATGGGATCTATATAGTTATGTTAAATTTAAAGTATGGTCTTACGGGGGAAGATGATAGAAAATGTACATTTATAAACTTCCTGCAATGTATGAGTTATTATGTTATAAACTTTTACATATTTTGACCCATTTAATCCCCATTTTGTAGATGAGTAGACTGAGGCTCATGAAATGATAAAGATTTTCCCATGGTATCAGGAATAAGAGTTGTCAAAGTAAAATTAAAACCAGGACTTTTGGCTCCCTAAAGCTATTCTAATGCTATTATTTCAAGCATAAAGGCTAGTTTTTATGTAAGTTATAAAAGAGATACACATTTAC
TACCACACAGTCTAAGCTGAACCTGGTTGGTTAACTTGAAAAATGCAGAGATGTAGTTACATCAGCAGTGGGAAGACAAGAAGATCAGTTTCAGTGGGAGAAGTCATTGCATTGGGAGGGGTAATTAACAGAGTGGTAGCATATGTGGAATGTGGGCTCTATAGATAAGGACTGGCAGGAATGTTGTGTACCAGGGCTGGGGGGATATAGAGGGTAAGGAAGTCTGGCCTTGAAATCAGGGAACAAAGGACAACAAAACTTAAACGAGCTAAACCTTTGAAGAAGAATTTCTTACTGTAGTCAGCGATCATTATTGTAAACCTATGACAGTTCTTTCAAAATATTTTTCAGACTTGTCAACCGCTGTA
実施例1で構築したNo.1〜10の各種遺伝子発現用カセット(図2)を含む発現ベクター(No.1〜10の各遺伝子発現ベクター)を作製した。図2に示すpCMViR-TSCを含むベクターをコントロールとした。No.1〜10の内、CHO細胞において最も有効な高効率発現プラスミドベクターであるNo.4遺伝子発現ベクターの全塩基配列を図5(配列番号8)に示した。また、HEK293T細胞において最も有効な高効率発現プラスミドベクターであるNo.1遺伝子発現ベクターの全塩基配列を図6(配列番号9)に示した。図2に示す各遺伝子発現用カセットは、目的遺伝子であるGFP-2A-PuroをコードするcDNAの配列をEcoRI制限酵素サイトとXbaI制限酵素サイトを用いて正方向に挿入した。
10% FCS含有GIBCO(R) Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) で培養を行ったCHO細胞((Chinese Hamster Ovary cells)及びHEK293T細胞(Human embryonic kidney cells)を6ウェルプレートで70%〜80%までコンフルエントに培養した。FuGENE(商標)-HD(遺伝子導入試薬)を用いて、No.1〜10の各遺伝子発現ベクター及びコントロールを、トランスポゼース発現ベクターとDNA量 1 : 1でコトランスフェクトした。トランスポゼース発現ベクターは、一過性発現用のベクターであるpCMViR-TSC ベクターにトランスポゼース遺伝子を搭載しており、このベクターをNo.1〜10の本発明のトランスポゾン配列 (TP) 搭載各遺伝子発現ベクターとコトランスフェクトすることにより、トランスポゾン配列の末端で遺伝子発現用カセットが切り出され、宿主ゲノム中のTTAA部位に効率よく目的遺伝子が挿入される。このような方法でトランスフェクトした細胞を24時間インキュベート後、細胞のGFP蛍光強度を蛍光プレートリーダー (FLUOROSKAN ASCENT FL, Thermo scientific) を用いて測定した。ベクターを導入していない細胞を(-)とした。
本実施例では、遺伝子組換えヒトHRGは、以下のように作製した。実施例1に示すCHO細胞において最も有効な高効率遺伝子発現用カセットであるNo.4遺伝子発現用カセットを用い、目的遺伝子として、配列番号10に示すヒトHRGのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. BC069574 (NCBI))で特定される塩基配列からなるDNA)を用い、No.4-HRG発現ベクターを作製した(図11参照) 。具体的には、10% FCS含有GIBCO(R) Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) で培養を行ったCHO細胞((Chinese Hamster Ovary cells)にFuGENE(商標)-HD(遺伝子導入試薬)を用いて、上記No.4-HRG発現ベクター、トランスポゼース発現ベクター、薬剤耐性遺伝子発現ベクターとして実施例1に示すNo.4遺伝子発現ベクターをDNA量 5 : 4:1でコトランスフェクトした。 遺伝子導入し、48時間培養後から、Puromycin(抗生物質)10μg/mLを添加して、3日に1回培地交換を行いながら3週間薬剤選択培養を行った。
VSPTDCSAVEPEAEKALDLINKRRRDGYLFQLLRIADAHLDRVENTTVYYLVLDVQESDCSVLSRKYWNDCEPPDSRRPSEIVIGQCKVIATRHSHESQDLRVIDFNCTTSSVSSALANTKDSPVLIDFFEDTERYRKQANKALEKYKEENDDFASFRVDRIERVARVRGGEGTGYFVDFSVRNCPRHHFPRHPNVFGFCRADLFYDVEALDLESPKNLVINCEVFDPQEHENINGVPPHLGHPFHWGGHERSSTTKPPFKPHGSRDHHHPHKPHEHGPPPPPDERDHSHGPPLPQGPPPLLPMSCSSCQHATFGTNGAQRHSHNNNSSDLHPHKHHSHEQHPHGHHPHAHHPHEHDTHRQHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHCHDFQDYGPCDPPPHNQGHCCHGHGPPPGHLRRRGPGKGPRPFHCRQIGSVYRLPPLRKGEVLPLPEANFPSFPLPHHKHPLKPDNQPFPQSVSESCPGKFKSGFPQVSMFFTHTFPK
国際公開WO2013/183494号公報の図5に示すフローチャートに従いHRG:2μM、最終濃度1μM)50μlを好中球浮遊液(5×105 cell/mL)50μlに加えた系での好中球の形態をCalceinで細胞を蛍光標識して、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、遺伝子組換えHRG及び血漿由来HRGのいずれも同じ効力で正球状形態を誘導することが観察された(図12)。
本実験例では、盲腸結紮腹膜炎(cecal ligation and puncture: CLP)敗血症モデルで
カプランマイヤー法による生存率を調べた。マウスの腹腔内より盲腸を取り出して、盲腸根部を縫合糸により結紮し、18ゲージ注射針を用いて盲腸壁層に穿刺してCLP敗血症モデルを作製した。単開腹(sham)マウスをコントロールとした。術後5分、24時間及び48時間目に、遺伝子組換えHRG(HRG:400μg/マウス)を尾静脈内投与した(n=10)。HSA及びPBSをコントロールとした(n=10)。その結果、カプランマイヤー法で解析した結果、遺伝子組換えHRG投与グループは有意に高い累積生存率が確認された(図13)。
単離したヒト好中球を、イソルミノール(最終濃度 50mM)とHorse radish peroxidase type IV(最終濃度 4 U/mL)を添加してインキュベートし、細胞外放出活性酸素分子種レベルを反応開始15分後に化学発光で測定した。HRG非存在下のレベルを100%とし、0.01〜1.0μM濃度のHRG存在下での値を%表示で算出した(図14)。その結果、遺伝子組換えHRGはヒト血漿から精製したHRGと略等しい活性酸素分子種の産生抑制活性を示した。
本実施例では、遺伝子組換え操作によるPD-1細胞外ドメインの産生について説明する。本実施例では、プロモーターの上流にTP配列、プロモーターの下流に発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物の下流にエンハンサー、さらにその下流にMIS配列、ROIS配列、TP配列を連結させた遺伝子発現ベクターを用いて、目的タンパク質を安定かつ高生産するCHO細胞を作製し、その細胞を用いて医薬品候補となるタンパク質を高効率に生産した。使用したコンストラクトの構造を図1(B)に示した。図2のNo.4のコンストラクトを用い、発現させようとする遺伝子をinserted geneとして挿入した。医薬品候補となるタンパク質は、すべて抗体の一部であるヒトIgGの Fc領域と融合させることにより、一般的に体内での安定性が低く薬効が得にくいと考えられているタンパク質製剤の安定性を向上させ、さらにヒトIgG2のFc領域を用いることで、補体活性が低く、副作用となる炎症反応が緩和される医薬品となると考えられる。ヒトIgG2 Fc領域の全塩基配列は図15に示し、リンカー及び制限酵素認識部位を含む塩基配列を、配列表の配列番号11に示した。ヒトIgG2 Fc領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号12に示した。
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
GWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV
本実施例では、遺伝子組換え操作によるEMMPRIN細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図17に示すEMMPRIN細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. ENSG00000172270 (Ensembl))で特定される塩基配列からなるDNA)の塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(exEMMPRIN-Fc)を作製し、用いた他は、実施例4と同手法により遺伝子組換え操作を行い、EMMPRIN細胞外ドメイン+ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexEmmprin-Fcという。EMMPRIN細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号16に示した。
ASGAAGTVFTTVEDLGSKILLTCSLNDSATEVTGHRWLKGGVVLKEDALPGQKTEFKVDSDDQWGEYSCVFLPEPMGTANIQLHGPPRVKAVKSSEHINEGETAMLVCKSESVPPVTDWAWYKITDSEDKALMNGSESRFFVSSSQGRSELHIENLNMEADPGQYRCNGTSSKGSDQAIITLRVRSHL
本実施例では、遺伝子組換え操作によるNPTNβ細胞外ドメインの産生について説明する。
QNAGFVKSPMSETKLTGDAFELYCDVVGSPTPEIQWWYAEVNRAESFRQLWDGARKRRVTVNTAYGSNGVSVLRITRLTLEDSGTYECRASNDPKRNDLRQNPSITWIRAQATISVLQKPRIVTSEEVIIRDSPVLPVTLQCNLTSSSHTLTYSYWTKNGVELSATRKNASNMEYRINKPRAEDSGEYHCVYHFVSAPKANATIEVKAAPDITGHKRSENKNEGQDATMYCKSVGYPHPDWIWRKKENGMPMDIVNTSGRFFIINKENYTELNIVNLQITEDPGEYECNATNAIGSASVVTVLRVRSHL
本実施例では、遺伝子組換え操作によるEMB細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図19に示すEMB細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. BC059398 (NCBI))で特定される塩基配列からなるDNA)の塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(exEMBβ-Fc)を作製し、用いた他は、実施例4と同手法により遺伝子組換え操作を行い、EMB細胞外ドメイン+ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexEMB-Fcという。EMB細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号20に示した。
DGSAPDSPFTSPPLREEIMANNFSLESHNISLTEHSSMPVEKNITLERPSNVNLTCQFTTSGDLNAVNVTWKKDGEQLENNYLVSATGSTLYTQYRFTIINSKQMGSYSCFFREEKEQRGTFNFKVPELHGKNKPLISYVGDSTVLTCKCQNCFPLNWTWYSSNGSVKVPVGVQMNKYVINGTYANETKLKITQLLEEDGESYWCRALFQLGESEEHIELVVLSYLVP
本実施例では、遺伝子組換え操作によるRAGE細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図20に示すRAGE細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. ENSG00000204305 (Ensembl))で特定される塩基配列からなるDNA)の塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(exRAGE-Fc)を作製し、用いた他は、実施例4と同手法により遺伝子組換え操作を行い、RAGE細胞外ドメイン+ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexRAGE-Fcという。RAGE細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号22に示した。
QNITARIGEPLVLKCKGAPKKPPQRLEWKLNTGRTEAWKVLSPQGGGPWDSVARVLPNGSLFLPAVGIQDEGIFRCQAMNRNGKETKSNYRVRVYQIPGKPEIVDSASELTAGVPNKVGTCVSEGSYPAGTLSWHLDGKPLVPNEKGVSVKEQTRRHPETGLFTLQSELMVTPARGGDPRPTFSCSFSPGLPRHRALRTAPIQPRVWEPVPLEEVQLVVEPEGGAVAPGGTVTLTCEVPAQPSPQIHWMKDGVPLPLPPSPVLILPEIGPQDQGTYSCVATHSSHGPQESRAVSISIIEPGEEGPTAGSVGGSGLGTLA
本実施例では、遺伝子組換え操作によるMCAM細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図21に示すMCAM細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. BC056418 (NCBI))で特定される塩基配列からなるDNA)の塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(exMCAM-Fc)を作製し、用いた他は、実施例4と同手法により遺伝子組換え操作を行い、MCAM細胞外ドメイン+ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexMCAM-Fcという。MCAM細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号24に示した。
VPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEKRTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPLGIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYCELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKEGDRVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTNDNGVLVLEPARKEHSGRYECQGLDLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQWLREETGQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVNVAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEASGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTGLSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESRG
本実施例では、遺伝子組換え操作によるALCAM細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図22に示すALCAM細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. BC137097 (NCBI))で特定される塩基配列からなるDNA)の塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(exALCAM-Fc)を作製し、用いた他は、実施例4と同手法により遺伝子組換え操作を行い、ALCAM細胞外ドメイン+ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexALCAM-Fcという。ALCAM細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号26に示した。
WYTVNSAYGDTIIIPCRLDVPQNLMFGKWKYEKPDGSPVFIAFRSSTKKSVQYDDVPEYKDRLNLSENYTLSISNARISDEKRFVCMLVTEDNVFEAPTIVKVFKQPSKPEIVSKALFLETEQLKKLGDCISEDSYPDGNITWYRNGKVLHPLEGAVVIIFKKEMDPVTQLYTMTSTLEYKTTKADIQMPFTCSVTYYGPSGQKTIHSEQAVFDIYYPTEQVTIQVLPPKNAIKEGDNITLKCLGNGNPPPEEFLFYLPGQPEGIRSSNTYTLTDVRRNATGDYKCSLIDKKSMIASTAITVHYLDLSLNPSGEVTRQIGDALPVSCTISASRNATVVWMKDNIRLRSSPSFSSLHYQDAGNYVCETALQEVEGLKKRESLTLIVEGKPQIKMTKKTDPSGLSKTIICHVEGFPKPAIQWTITGSGSVINQTEESPYINGRYYSKIIISPEENVTLTCTAENQLERTVNSLNVSAISIPEHDEADEISDENREKVNDQAK
本実施例では、遺伝子組換え操作によるErbB2細胞外ドメインの産生について説明する。目的遺伝子として、図23に示すErbB2細胞外ドメインのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. ENSG00000141736 (Ensembl))で特定される塩基配列からなるDNA)の塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(exErbB2-Fc)を作製し、用いた他は、実施例4と同手法により遺伝子組換え操作を行い、ErbB2細胞外ドメイン+ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をexErbB2-Fcという。ErbB2細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号28に示した。
TQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLT
本実施例では、目的遺伝子として、図24に示すHRGのコーディング領域をコードするDNA(GenBank Accession No. BC069574 (NCBI))で特定される塩基配列からなるDNA)の塩基配列へ図15に示すヒトIgG2のFc領域をコードする配列を融合し、ポリヌクレオチド(HRG-Fc)を作製し、用いた他は、実施例4と同手法により遺伝子組換え操作を行い、HRG+ヒトIgG2のFc融合タンパク質を作製した。本実施例で作製したFc融合タンパク質をHRG-Fcという。HRGのアミノ酸配列は実施例3と同様に配列表の配列番号10に示した。
実施例4〜12の方法で作製した各精製Fc融合タンパク質をSDS-PAGEを用いて分離し、CBB染色によってFc融合タンパク質の純度を確認した(図25)。さらにこの精製Fc融合タンパク質のタンパク質量をBradford法により定量し、500mL培養時の精製タンパク質量を算出し、表1に示した。
Claims (13)
- 目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)が、プロモーター(P)とエンハンサー(P')で挟まれる構造を有する遺伝子発現用カセットにおいて、さらにプロモーター(P)の上流及びエンハンサー(P')の下流にトランスポゾン配列(T)を含むことを特徴とする、遺伝子発現用カセット。
- さらに、プロモーター(P)の上流及び/又はエンハンサー(P')の下流に、複製開始配列(S)が配置されていることを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子発現用カセット。
- プロモーター(P)、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)、エンハンサー(P')及びトランスポゾン配列(T)が含まれ、更に選択的に複製開始配列(S)を含む遺伝子発現用カセットが、以下の1)〜4)のいずれかに示す順序で含まれる、請求項1又は2に記載の遺伝子発現用カセット:
1)(T)、(P)、(X)、(P')、(T);
2)(T)、(S)、(P)、(X)、(P')、(T);
3)(T)、(P)、(X)、(P')、(S)、(T);
4)(T)、(S)、(P)、(X)、(P')、(S)、(T)。 - 複製開始配列(S)の上流に核マトリックス結合配列(M)が配置されていることを特徴とする請求項2又は3に記載の遺伝子発現用カセット。
- トランスポゾン配列(T)、プロモーター(P)、目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)、エンハンサー(P')、核マトリックス結合配列(M)、複製開始配列(S)及びトランスポゾン配列(T)を含む、遺伝子発現用カセット。
- 複製開始配列(S)が、ROIS及び/又はARSである請求項2〜5のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
- プロモーター(P)が、CMVプロモーター、CMV-iプロモーター、SV40プロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター及びCAGプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、請求項1〜6のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
- 目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)の下流に連結したエンハンサー(P')が、hTERTエンハンサー、CMVエンハンサー及びSV40エンハンサーから選択されるいずれか1種又は複数種を含む、請求項1〜7のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
- 目的遺伝子及びポリA付加配列を含むDNA構築物(X)において、目的遺伝子が、HRG、PD-1、EMMPRIN、NPTNβ、EMB、RAGE、MCAM、ALCAM、ErbB2及び抗体のいずれかから選択されるタンパク質の部分又は全体をコードする遺伝子を含む、請求項1〜8のいずれかに記載の遺伝子発現用カセット。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを含む、遺伝子発現用プラスミド。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを含む、遺伝子発現用ベクター。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の発現用カセットを用いて目的遺伝子を発現させる方法。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の遺伝子発現用カセットを用いて産生されたタンパク質。
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