CN105255895A - 用于真核细胞系的提高蛋白表达水平的mar转录调控元件及其表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于真核细胞系的提高蛋白表达水平的MAR转录调控元件及其表达系统，首次利用CHO细胞克隆出具有转录调节功能的DNA调控元件(MAR)，通过一系列载体构建及稳定细胞株筛选，证明了此DNA调控元件可提高蛋白质的表达产量。还首次将此MAR调控元件与睡美人转座子载体结合，从而构建了一种适用于高效稳定表达医用蛋白质药物的表达系统，与传统的质粒表达系统相比，该系统具有如下优点：高蛋白质产量；稳定持久地蛋白表达；大大缩短筛选克隆的时间；快速便捷的基因克隆。本发明中的表达系统，可显著提高医用蛋白质药物的产量和质量，一经投入工业化使用，将极大地降低生产成本，产生巨大的社会和经济效益。

Description

用于真核细胞系的提高蛋白表达水平的MAR转录调控元件及其表达系统

技术领域

本发明涉及一种哺乳动物细胞系统，具体说，是一种用于真核细胞系的提高蛋白表达水平的MAR转录调控元件及其表达系统。

背景技术

医用蛋白质药物具有较强的生理活性，显著的疗效及较高的安全性等优点，在目前的医药市场上占有重要的比例,截止2014年，在全球范围内约占有1,000亿美元(约合6，200亿人民币)的市场份额。抗体作为机体免疫应答的效应分子，能够特异性识别、中和或清除诱发疾病的抗原，是理想的靶向治疗药物。目前欧美市场已有总计三十余种治疗性抗体上市销售。以上抗体药物已经在免疫性疾病、癌症等治疗领域取得巨大成功。以罗氏公司的抗HER2的Trastuzumab抗体为例，美国食品及药物管理局(FDA)于1998年批准其作为治疗恶性肿瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺癌的抗体药物。并且已成为国际通行的针对HER2阳性乳腺癌临床治疗的金标准(Goldenstandard)。据估计，到2023年HER2阳性乳腺癌的市场份额将高达126亿美元(约合780亿人民币)。目前在国际上销量最高由欧美主要生产厂家垄断的几种医用抗体的专利在未来几年内将陆续到期，从而为中国及其他发展中国家在这方面的发展提供了难得的发展机遇。以Trastuzumab为例，它的欧洲专利保护期已于2014年到期，其美国专利于2019年到期。因此在可以预见的未来10年，医用抗体制药业将呈现飞速发展且竞争更加激烈的局面。

中国医用蛋白质药物的表达与纯化业由于起步晚，其行业发展受限于诸多技术瓶颈，如：工程细胞系构建与筛选、大规模培养工艺开发，单抗的纯化与质控等，因此普遍存在着细胞系表达水平低，培养规模小和纯化能力不够等技术问题。所以，上述产业化关键技术的突破可加快中国抗体产业的发展进程。数据表明，一个年销售额达1亿美元左右的蛋白质药物，通常需要年产约100公斤重组蛋白的产能作为产品支撑。因此，蛋白质药物的表达与纯化，其技术水平和产能规模，将直接影响蛋白质药物的成本和盈利。

在当前国际通用的各种医用蛋白表达系统有很多种，如大肠杆菌为代表的原核表达系统，以及以酵母、植物、昆虫细胞为代表的真核细胞表达系统等。而这些表达系统生产出的蛋白质，无论是在理化性质，还是在功能上都与天然蛋白质存在较大的差异，因此利用哺乳动物细胞表达系统来生产医用蛋白质是现代医药领域的研究重点。目前市场上被美国FDA批准的蛋白质药物，超过50％来自于哺乳动物细胞的表达系统，主要包括中华仓鼠细胞chinesehamsterovarycell(CHO)，人胚肾细胞humanembryonickidneycell(HEK-293)等表达细胞系。

高效的表达载体系统是医用蛋白质药物的关键。构建高效的表达载体细胞是提高哺乳动物细胞医用蛋白质产量的首要策略，也是目前制约医用蛋白质产业化的瓶颈。外源基因可以通过质粒载体转染的方式导入哺乳动物宿主细胞，表达目的蛋白。一般来讲，适用于哺乳动物细胞蛋白表达的载体，大多为穿梭载体，不仅含有便于载体扩增和大量制备的原核序列，如复制子和抗生素基因等，还含有真核生物表达序列如调控外源基因转录与翻译活性的启动子、增强子、终止子及polyA信号等。由于蛋白质药物的表达通常采用稳定表达的细胞系，因此，为获得蛋白的高效表达，不仅需要表达载体的优化，同时还需要提供适于载体表达的染色体环境，即所谓的“位置效应”。表达载体的优化，一般包括选用较强的启动子，表达基因进行密码子优化等；同时为增加表达载体在细胞内的拷贝数，在表达载体中加入一些筛选基因如基于氨甲喋呤(methotrexate,MTX)的二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)。“位置效应”是优化表达载体时应当着重考虑的。当质粒携带表达基因转入宿主细胞时，质粒将被随机整合到宿主染色体基因组上的某个区域，此整合区域的空间构象，显著影响基因的转录和表达。近年来，一些DNA顺式调控元件，如核基质附着区(MatrixAttachmentRegion,MAR)被鉴定出来。功能上，当这些DNA元件与外源基因处于同一顺反子时，能够保持外源基因的高表达而对插入位点所处的染色质结构没有影响。已发现的DNA元件包括基因座控制区(LCR)、支架/基质附着区(S/MAR)、绝缘子、染色质开放元件(UCOE)和抗阻遏物(STAR元件)等(Ref2)。这些DNA顺式调控元件构建到表达载体上，可显著提高基因的表达水平和蛋白的翻译水平。

筛选高效稳定表达的细胞克隆是提高哺乳动物细胞蛋白质产量的另一重要策略。传统质粒载体需要转染宿主细胞获得稳定表达，耗时且费力，不利于医用蛋白质的大规模生产。虽然杆状病毒载体和慢病毒载体可以较高的拷贝数整合到宿主的基因组，但病毒载体的制备具有一定的难度，特别是大规模的制备；而且，慢病毒载体亦有安全性的潜在风险。另一方面，增加表达基因在宿主细胞内的拷贝数，是筛选高效表达细胞株的有效方法。当前常用的筛选高效稳定表达克隆的体系有两类：一类是基于氨甲喋呤的二氢叶酸还原酶筛选体系；另一类是基于甲硫氨酸亚砜的谷氨酰胺合成酶筛选体系。细胞培养在含有一定浓度的氨甲喋呤或甲硫氨酸亚砜的培养基中，外界环境的压力使得表达基因在宿主细胞内扩增，拷贝数增加，进而提供蛋白质药物的表达产量。但是上述两种筛选体系都存在耗时长和成本高等缺点，不利于生物制药的产业化。因此，采用一种非病毒载体，同时这种载体能够以较高的拷贝数并稳定整合到宿主细胞的基因组内，将极大地提高蛋白质药物的产量，而且可大大缩短筛选细胞克隆所需的时间。

用睡美人转座子(SleepingBeauty,SB)作为表达载体具有质粒无可比拟的优点。转座子是染色体上可自主复制和移位的DNA作用元件。睡美人转座子是第一个应用于高等哺乳动物细胞相关研究的转座子。SB转座子由两部分组成：转座酶基因和能被转座酶基因所识别的两端反向重复序列。SB转座子采用“剪切-粘贴”的作用机制进行转座。转座酶特异识别转座子两端反向重复序列，从转座子载体上切下位于两端反向重复序列的DNA元件，并插入到新的整合位点上。因此，SB转座子做为非病毒的基因载体，具有较高的生物安全性；同时结构简单，容易操作；对位于两端反向重复序列之间的DNA片段，没有插入片段的长度限制。重要的是，通过SB转座子，可以使DNA片段稳定地整合到基因组内，从而实现基因的稳定表达。因此，利用睡美人转座子作为医用蛋白质药物的表达载体，有文献报道，可数倍提高蛋白质药物的产量，而且由于SB转座子载体以较高的基因拷贝数稳定整合，大大缩短了筛选高效稳定表达克隆的时间和过程。并且，由于稳定地整合到宿主细胞基因组内，因此在大规模细胞培养生产蛋白质药物的过程中，不会出现质粒载体中的基因丢失等缺点，使得单位体积的细胞培养基最大可能地生产出表达蛋白质，从而最大限度地利用培养基，最终降低了生产成本，同时提高了产量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于真核细胞系的提高蛋白表达水平的MAR转录调控元件及表达系统，发现并鉴定了新型的DNA调控元件；以此调控元件为基础，结合基因转座子技术，优化和构建了真核表达载体。随后通过转染及筛选，所获得的细胞株，可高效，稳定地表达医用蛋白质药物。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于真核细胞系的提高蛋白表达水平的MAR转录调控元件，所述MAR转录调控元件为具有增强转录的功能的DNA顺式作用元件，MAR转录调控元件为MAR1，MAR2，MAR3.MAR4，MAR5中的任意一种，MAR1的核苷酸序列为SEQIDNO.1,MAR2的核苷酸序列为SEQIDNO.2,MAR3的核苷酸序列为SEQIDNO.3,MAR4的核苷酸序列为SEQIDNO.4和MAR5的核苷酸序列为SEQIDNO.5。

所述MAR转录调控元件提取于中国仓鼠卵巢细胞系CHO。

含有所述MAR转录调控元件的高效稳定的医用重组抗体的哺乳动物细胞表达载体，包括：1)使得基因高效表达的DNA顺式作用元件MAR，2)睡美人转座子载体表达抗体基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；3)筛选标记基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；4)IRES序列SEQIDNO.8。

所述睡美人转座子载体，含有可被转座酶识别的反向重复序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。

所述筛选基因为二氢叶酸还原酶基因DHFR，所述IRES元件为基因合成的FMDVIRES序列。

所述MAR转录调控元件为MAR2。

一种高效稳定表达重组抗体的稳定细胞株的筛选方法，利用上述的哺乳动物细胞表达载体，将目标基因转染到哺乳动物宿主细胞，筛选获得高表达目标基因的稳定细胞株。

所述哺乳动物宿主细胞是中华仓鼠卵巢细胞CHO和人胚肾上皮细胞HEK293。

所述筛选方法包括针对筛选标记的抗生素筛选和针对扩增标记基因的药物加压筛选。

所述的高效稳定表达重组抗体的稳定细胞株的筛选方法获得的高效稳定表达的细胞株。

本发明的有益效果是：首次利用CHO细胞克隆出具有转录调节功能的DNA调控元件(MAR)，通过一系列载体构建及稳定细胞株筛选，证明了此DNA调控元件可提高蛋白质的表达产量。以此为基础，还首次将此MAR调控元件与睡美人转座子载体结合，从而构建了一种适用于高效稳定表达医用蛋白质药物的表达系统。并以表达纯化抗HER2的IgG为例，证明了与传统的质粒表达系统相比，该系统具有如下优点：较高的蛋白质产量(与质粒系统相比，高达10倍的产量)；稳定持久地蛋白表达(细胞系传50代后，仍保持相近的蛋白表达产量)；大大缩短筛选克隆的时间(一个月左右)；快速便捷的基因克隆。

附图说明

图1是中华仓鼠卵巢上皮细胞培养的生长曲线。

图2是用抗H4的抗体进行染色体免疫沉淀，经一系列处理，所得的DNA样品进行1％琼脂糖凝胶电泳图。

图3是微阵列分析试验中，从染色体免疫共沉淀所得的DNA样品中扩增β-actin用于PCR扩增的阳性对照。

图4是表达EGFP的真核表达载体的图谱(比较pEGFP-Control(A)和pEGFP-MAR(B)，MARDNA元件插入在CMV启动子的上游)。

图5是流式细胞仪定量分析筛选的稳定细胞系绿色荧光蛋白的表达。

图6是在荧光显微镜下观察稳定表达GFP的CHO细胞系。

图7是pMetLuc载体和MAR2-pMetLuc载体的结构示意图。

图8是MARDNA元件可增强荧光素酶蛋白的表达。

图9是构建HER2抗体的真核表达载体。

图10是MAR2DNA调节元件增强质粒载体介导的HER2抗体表达。

图11是表达HER2抗体的转座子载体。

图12是转座子载体转染的CHO细胞，具有较高的阳性细胞克隆数。

图13是MAR2可增强转座子载体介导的HER2抗体的表达产量。

图14是转座子载体介导的抗体长期稳定表达。

图15是肿瘤细胞结合试验验证表达纯化的抗体。

图16是表达载体的优化。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

实施例1:中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)的特异DNA调控元件的发现和鉴定

染色体DNA与其周围的DAN结合蛋白相互缠绕，折叠，形成特定的染色质空间构象。这种空间构象直接决定了基因的转录水平。研究表明，一些DNA结合蛋白影响并决定染色质的空间构象，例如组蛋白Histone3和4.当H3或H4被乙酰化，其所处的染色质处于“打开”状态；反之，当H3或H4被去乙酰化，其所处的染色质处于“关闭”状态。因此，一个合理的假设是，组蛋白H3或H4所结合的DNA片段，将具有基因转录调控的功能。所以，试验上把染色体以物理或化学方法打碎成一定长度的DNA片段，用特异性的抗H3或H4的抗体进行染色体免疫共沉淀，随后以PCR以及DNA测序的方法来找出可能的DNA调控元件。目前许多此类的DNA调控元件，用人胚肾上皮细胞系HEK293被鉴定出来。考虑到CHO细胞系广泛用于医用蛋白质药物表达的事实，我们用培养的CHO细胞进行DNA调控元件的鉴定。

从CHO细胞提取新型的DNA调节元件我们使用特异性抗-乙酰化组蛋白H4的抗体进行染色质免疫沉淀(CHIP)。首先，使用Hyclone的无血清培养基在37℃和5％C02条件下培养CHO细胞，在存活细胞密度达到最高时(4.1X10⁶细胞/毫升)(见图1)进行离心(l000Xg，5分钟，室温)收集细胞。

5X10⁷细胞在含有1％甲醛的培养基中固定10分钟后，加入甘胺酸至终浓度125mM，离心(2000Xg，10分钟，4℃)后，移除上清，加入PBS至细胞沉淀中以悬浮清洗细胞。然后，再次离心细胞悬浮液。吸除PBS后，将SDS裂解缓冲液加入至细胞沉淀中以悬浮和裂解细胞。在置于冰上的超声匀浆器(Branson,25％持续输出)中对每个通过细胞裂解获得的样品进行DNA片段化后，向其中加入含有蛋白酶抑制剂混合物和蛋白G-固定的琼脂糖的稀释缓冲液。在4℃将上述的混合物混匀1小时，接着离心，然后收集上清液。随后，向其中加入兔IgG或抗乙酰组蛋白H4抗体，接着4℃旋转过夜。向得到的溶液中加入G蛋白-固定的琼脂糖，并且在4℃旋转所得混合物1小时，接着离心，然后收集沉淀。洗脱条件如下：分别用低浓度，高浓度，及LiCl免疫复合洗涤缓冲液洗涤各两次，随后用TE缓冲液洗涤4次，最后用洗脱缓冲液(含有20μllM碳酸氢钠、10μlSDS和170μl无菌水)作用30分钟，离心并收集上清。为进一步纯化DNA，去除RNA和蛋白质杂质，5Μ氯化钠加入上清液中，在65℃将所得混合物加热过夜。然后加入RNA酶A以降解RNA，37℃孵育所得混合物30分钟。然后向其中加入0.5MEDTA、1MTris-HCl和蛋白酶K以降解蛋白质杂质，在45℃让所得混合物孵育2小时。最后，向其中加入RIPA缓冲液洗脱，接着用旋转过滤器(Spinfilter)离心(10000rpm,30秒,室温)，这步之后就得到纯化染色质-免疫沉淀的DNA。经此方法处理过的DNA片段经1％的琼脂糖凝胶电泳，主要分布于1-3.5Kb之间(见图2)。

微阵列分析：使用GenomePlex全基因组扩增(WGA)试剂盒(Sigma),扩增ChIP样品。具体步骤如下：10μlDNA(10ng/μl)与1μl片段化缓冲液混匀，置于95℃共计4min，冰浴5分钟。加入2μL1X文库制备缓冲液和1μL文库稳定溶液。吹打/短暂的震荡混合样品，离心5-10秒，并在热循环仪加热95℃/2min，随后冰浴5分钟，再次短暂离心5-10秒。添加1μL文库制备酶，离心混匀。

使用以下条件处理样品：温度/时间：16℃，20分钟；24℃，20分钟；37℃，20分钟；75℃5分钟。处理后的样品进行GenomePlexPCR扩增：7.5微升10X扩增缓冲液，47.5μL无菌水，5微升的JumpStartTaqDNA聚合酶和15微升文库DNA。PCR扩增条件如下：周期数/温度/时间95℃3分钟，94℃15秒，65℃5分钟(重复步骤2-314次)。我们采用β-actin作为PCR扩增的阳性对照。所用的PCR引物序列为5'-AAGGAGATCACTGCTCTGGC-3'，5’-GCCATCTCATGGGTACTTGGA-3’。PCR产物进行1％凝胶电泳。如图3所示，β-actin在样品中得到特异性扩增，表明PCR扩增成功。

我们对扩增的DNA进行ChlP-on-chip分析(NimbleGen)。根据ChlP-on-chip分析的结果，我们选择了5个具有60％或更多AT含量的序列进行进一步功能分析。这些序列分别命名为MAR1(SEQIDNO.1),MAR2(SEQIDNO.2),MAR3(SEQIDNO.3),MAR4(SEQIDNO.4)和MAR5(SEQIDNO.5)。

实施例2:利用建立表达GFP荧光的稳定细胞系检测MAR元件对蛋白表达量的影响。

为鉴定上述MAR序列对基因转录和翻译的作用，我们在pEGFP-Control载体插入由实施例1中所获得的MAR序列。这些MAR序列克隆在pEGFP-Control的SV40早期启动子的上游，依次命名为pEGFP-MAR1到pEGFP-MAR5。随后，这些GFP表达载体被转入到CHO细胞并筛选稳定表达克隆。

MAR元件由PCR方法(94℃30秒和68℃2分钟，30个循环)进行扩增，在一些实验中，由于没有合适的酶切位点，因此采用了Gibson合成(Gibsonassembly)的方法进行克隆的构建，具体实验步骤按照说明书进行(gibsonassemblymastermixture,NEB)。对于PCR扩增的MAR元件，通过PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，随后用限制性内切酶EcoRI和XhoI消化纯化的PCR产物；与此同时，pEGFP-Control载体亦用相同的限制性内切酶消化。分别对消化过的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳来分离，并用胶回收试剂盒(Qiagen)对目的条带回收并纯化。然后，进行连接反应(T4连接酶，NEB)和转化。转化条件如下，解冻的感受态细胞DH5α，与连接反应后的10μl溶液混合，置于冰上5分钟。此后，混合物采用热激(42℃，45秒)反应，随后置于冰上3分钟。向该细胞悬液加入1mlLB培养基，并37℃振摇1小时。然后，将转化混合物铺于含有50ug/ml卡那霉素的LB培养板，于37℃孵育14-16小时。然后，挑取单个细菌克隆，过夜培养于4ml含50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中。第二天，用碱裂解法提取质粒，通过酶切鉴定及核酸序列测定，籍此构建pEGFP-Control表达载体。在本发明中，这些DNA元件的插入位置都位于pEGFP-Control载体的CMV启动子之前。载体线性化时所用的酶切位点是：MluI。载体分别命名为pEGFP-MAR1，pEGFP-MAR2，pEGFP-MAR3，pEGFP-MAR4,pEGFP-MAR5。质粒结构以MAR2为例见图4。所用的引物序列如下：

MAR1-F:TGTACGGGCCAGATATACGCGTTGAGGAAACCTAGGAAATCTATAGGASEQIDNO.10

MAR1-R:ATAACTAGTCAATAATCAATGTCATGTATGCGAGAGGTAGSEQIDNO.11

MAR2-F:TGTACGGGCCAGATATACGCGTAGAAGCTAGTCACCAAAACAATTAATSEQIDNO.12

MAR2-R:ATAACTAGTCAATAATCAATGTCAGAAGGTTTTATGGAGACTTCTCSEQIDNO.13

MAR3-F:GTACGGGCCAGATATACGCGTCTTGTTTTCTCCTAAATGCATTGTATGGSEQIDNO.14

MAR3-R:ATAACTAGTCAATAATCAATGTCATCCACAAGGTGAATGAACTACACTGGCSEQIDNO.15

MAR4-F:TGTACGGGCCAGATATACGCGTAGCAAACAAGGCAGGATGTAGTTGSEQIDNO.16

MAR4-R:ATAACTAGTCAATAATCAATGTCAACCATAACAAATCAGGACCGTCTATGSEQIDNO.17

MAR5-F:TGTACGGGCCAGATATACGCGTACTTCATGAAGTTAACAACCCSEQIDNO.18

MAR5-R:ATAACTAGTCAATAATCAATGTCACTGGAAATGGAGATAAAGATGGTATCSEQIDNO.19

细胞培养和转染和稳定细胞系的获得：将CHODG44细胞系培养于DMEM:F12的培养基，细胞培养基中添加1xHT和10％胎牛血清(FBS)，以上试剂皆来自于Gibco公司。pEGFP-MAR质粒用Lipofectmine2000转染进CHO细胞。48小时后使用流式细胞分选仪(FACS)分选GFP阳性细胞。随后用500μg/ml嘌呤霉素选择2周后，得到稳定表达GFP细胞克隆。不含MAR的pEGFP载体作为试验对照。

绿色荧光蛋白的流式细胞仪分析：对每个载体所得到的稳定细胞系，随机各挑选5个克隆，用FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson公司)对细胞进行FACS分析。细胞经上下吹打，制成单细胞悬液，吸取0.2ml移入FACS管内，经流式细胞仪分析绿色荧光蛋白的荧光强度。流式细胞仪的数据分析采用FlowJo软件分析，同时用MFI(Meanoffluorescenceindex)来量化荧光强度。结果表明，在五种MAR的DNA元件中，pEGFP-MAR2转染的细胞，大约有56.9％的GFP+阳性细胞，其MFI的数值最高，为1202；而pEGFP-MAR5和pEGFP-MAR3的MFI数值远低于MAR2,甚至MAR5大约是MAR2的一半，表明MAR2具有较强的增强蛋白表达的能力。以pEGFP的MFI值为基准，从而计算出相对荧光强度的变化。(见图5，用图示的质粒转染CHO细胞并筛选稳定表达的细胞系。每种稳定细胞株随机挑选5个细胞克隆，进行流式细胞仪分析GFP荧光表达的强度。荧光强度用FlowJo软件进行分析。以pEGFP作为荧光强度的基准来计算荧光强度的相对值)。

绿色荧光蛋白的荧光显微镜观察：用Olympus产Fluoview100激光共聚焦荧光显微镜镜下观察绿色荧光蛋白在细胞内的表达。结果表明，pEGFP-MAR2载体转染的细胞，具有最高的绿色荧光强度(见图6)可见pEGFP-MAR2载体转染得到的稳定细胞株，相比与不含MAR元件的对照细胞株，有较高的荧光强度)，与流式细胞分析结果相一致。这些结果表明，我们所鉴定的MAR2DNA调节元件具有或增强基因转录，从而加强蛋白表达的功能。

实施例3:利用分泌型的荧光素酶蛋白在CHO细胞内的稳定表达来检测MAR元件对分泌性蛋白表达的作用

构建MAR-pMetLuc表达载体：pMetLuc载体系Clontech公司产品。此载体含有CMV启动子，表达分泌型的荧光素酶基因。采用与上述相似的分子克隆方法，把上述中获得的MAR元件分别插入到pMetLuc载体中CMV启动子的上游。命名为MAR2-pMetLuc，MAR4-pMetLuc，MAR5-pMetLuc。载体的结构示意图如图7(pMetLuc载体表达可分泌的荧光素酶蛋白(图左)。三个MARDNA调节元件分别克隆到CMV启动子的上游(图右)。pMetLuc载体用scaI酶切。克隆采用的引物如下。

MAR2-luc-F:GGTTTTTTGTGTGAATCGATAGTACTAAGAAGCTAGTCACCAAAACAATTAATSEQIDNO.20

MAR2-luc-R:ATTCTAGGCTTAGGATAAGTTTATTGTGAAGGTTTTATGGAGACTTCTCSEQIDNO.21

MAR4-luc-F:GGTTTTTTGTGTGAATCGATAGTACTAAGCAAACAAGGCAGGATGTAGTTGGSEQIDNO.22

MAR4-luc-R:ATTCTAGGCTTAGGATAAGTTTATTGTACCATAACAAATCAGGACCGTCTATGSEQIDNO.23

MAR5-luc-F:GGTTTTTTGTGTGAATCGATAGTACTAACTTCATGAAGTTAACAACCCTGTCSEQIDNO.24

MAR5-luc-R:ATTCTAGGCTTAGGATAAGTTTATTGTCTGGAAATGGAGATAAAGATGGTATCSEQIDNO.25

稳定细胞系的筛选及荧光素酶活性的测定：上述构建的携带MAR的载体以及作为对照的pMetLuc用Lipofectmine2000转染进CHO细胞，按照实施例2相同步骤筛选建立含有各DNA元件的稳定细胞系，再随机挑选稳定克隆进行培养。分泌表达到细胞上清中的荧光素酶，可作用于其荧光素底物并发光，根据信号的强弱，可知细胞分泌表达荧光素酶蛋白的多少。分泌表达的荧光素酶的检测采用Clontech公司的Ready-To-GlowSecretedLuciferaseAssay试剂盒进行分析。由于荧光素酶蛋白分泌到细胞上清，不需要裂解细胞，因此采用不同时间的细胞上清来观察不同的MAR元件对蛋白表达的作用，以及蛋白表达的强弱及持续的时间。对含MAR2，MAR4，MAR5或对照的稳定CHO细胞系细胞提取20μL细胞培养上清，加入荧光素酶的底物50μL，用发光检测仪(ModulusTMLuminometer)测定其相对光强度单位(Relativelightunit，RLU)。

结果表明，携带MAR2-pMetLuc的细胞分泌表达的荧光素酶，在12-48小时期间，蛋白的表达不断加强，而在48-60小时期间，蛋白随有所降低，但相比较于MAR4，MAR5和对照，仍有较高的表达量；而MAR4，MAR5和对照转染的细胞,和MAR2相比，不仅它们的蛋白表达产量低，而且蛋白表达持续的时间亦较短(见图8，表达载体，包括pMetLuc,MAR2-pMetLuc,MAR4-pMetLuc和MAR5-pMetLuc,分别转染到CHO细胞中,筛选出稳定细胞系，再挑选含不同DNA元件的细胞克隆进行培养。在不同的时间内，取细胞培养上清进行荧光素酶蛋白的浓度分析)。因此，MAR2元件具有显著的增强蛋白表达的能力。此结果亦和实施例2中绿色荧光蛋白表达强度的结果相一致。

实施例4：MAR2调节元件增强HER2抗体药物的表达

Trastuzumab是针对HER2的单克隆抗体。我们构建表达Trastuzumab的表达载体。为研究MAR2元件在医用蛋白质药物表达的作用，我们亦构建了含有MAR2的表达载体。根据HER2抗体的氨基酸序列，转变成核苷酸序列并通过基因合成的方法得到cDNA。这些cDNA包含有Kozak共有序列(GCCACC)，后接起始密码子(ATG)，随后是白细胞介素-2的信号肽序列以介导抗体分泌。相应的限制性内切酶的位点(BamHI和EcoRI位点)，分别位于cDNA的5‘端和3‘端以用于载体的构建。在基因合成时，重链和轻链cDNA通过IRES序列连接起来。以实施例2中的pEGFP-Control作为模板，进一步构建表达抗体的哺乳动物表达载体。我们运用现代分子克隆技术，将表达抗体的DNA片段，包括重链cDNA-IRES-轻链cDNA，插入到pEGFP-Control表达载体中。

PCR产物经纯化后，用BamHI和EcoRI进行酶切反应；与此同时，pEGFP-Control载体亦用BamHI和EcoRI进行酶切。酶切的产物，经1％琼脂糖凝胶电泳进行DNA分离，回收所需的DNA片段。随后，进行体外连接反应，将酶切的质粒载体，与插入片段相连接。经4℃过夜，连接产物采用化学方法，转入到E.coli感受态细胞中，随后铺于含有50ug/ml卡那霉素的琼脂平板上过夜培养。细菌克隆被挑选并置于含4ml培养液的试管中，经200rpm振荡培养过夜，第二天提取质粒，并酶切鉴定。同时质粒被测序。结果表明，抗体表达的DNA片段正确地连接到表达载体中，我们将之命名为pH2I。所用的引物序列如下：

HER2-F:AAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGTACAGGATGCAACTCSEQIDNO.26

HER2-R:TGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTAACACTCGCCCCGGTTGAAGCTCTTGSEQIDNO.27

为了获得稳定的抗体CHO细胞表达株及提高抗体的表达产量，我们采用传统的DHFR加压筛选的方法。因此，我们对上述pH2I载体进行改造。通过基因克隆手段，用CHO细胞的DHFR基因置换pH2I载体自身的Puromycin抗性基因。所得的载体命名为pH2ID。然后我们把片段MAR2克隆到载体pH2ID中，具体来说，我们PCR扩增MAR2，然后采用上述载体的酶切位点NruI，把MAR2插入在CMV启动子的上游。所得的载体命名为pMH2ID(见图9，HER2的抗体基因，包括重链，轻链和IRES连接子等，克隆到pEGFP-Control载体CMV启动子下游。MAR2DNA调节元件克隆到CMV启动子的上游。考虑到稳定细胞系的筛选，CHO细胞的DHFR基因克隆到SV40启动子之后)。

全人源抗HER2单克隆抗体表达株的筛选：将上述表达载体，包括pMH2ID，和上述不含MAR2DNA元件的对照pH2ID分别转染到CHO细胞，经过筛选获得抗体稳定表达的CHO细胞系。具体步骤如下：CHO/DHFR-细胞，在F12/DMEM(含10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10ug/ml甘氨酸、15ug/ml次黄嘌呤5ug/m、胸腺嘧啶；37℃，5％CO₂)培养，取对数生长期细胞，细胞覆盖得到约50-70％，采用脂质体法转染上述细胞。取5μg质粒及20μlLipofectamine2000Reagent，按Lipofectamine2000Reagent试剂盒说明书进行转染。每天观察细胞的形态。转染48小时后，用磷酸缓冲液PBS充分洗涤细胞5次，换选择培养基(不含甘氨酸、次黄嘌呤、胸腺嘧啶的F12/DMEM培养基，含7％的血清)培养，培育7-10天，筛选出pMH2ID阳性，和对照pH2ID阳性的细胞克隆。这些阳性克隆被保存于液氮中。

全人源抗HER2单克隆抗体的表达纯化：将上述保存的阳性克隆，每组随机复苏各5株，用50ml无血清培养基(EX-CELL302，SIGMA-ALDRICH公司)培养，用rProteinASepharose4FastFlow亲和柱进行抗体的纯化。随后将纯化得到的全人源抗HER2单克隆抗体用PBS进行透析，最后用紫外吸收法测定抗体的含量。结果表明，转染pMH2ID(含有MAR2DNA调节片段)的细胞克隆，它们的抗体表达产量，明显高于不含有MAR2DNA调节片段的pH2ID质粒转染的细胞克隆，抗体的产量大约是后者的3.5倍左右(见图10，上述的经过筛选的细胞株，分别随机挑选5个，放大到50ml的体积内进行小规模培养，培养10天后，培养上清用ProteinA柱纯化抗体，并检测抗体的产量和浓度)。

实施例5:利用MAR元件与睡美人(SleepingBeauty)转座子结合构建高效HER2抗体的表达载体

“睡美人”转座子载体由于睡美人转座子载体独特的优点，其在蛋白的表达，稳定细胞克隆的筛选及基因治疗等领域的应用已被广泛报道，如“RestorationofdystrophinexpressionusingtheSleepingBeautytransposon”PLoSCurr.2011December22；“SleepingBeauty-baculovirushybridvectorsforlong-termgeneexpressionintheeye”TheJournalofGeneMedicine02/2014,16(1-2)；“OptimizedSleepingBeautytransposonsrapidlygeneratestabletransgeniccelllines”BiotechnologyJournalVolume10,Issue4,pages647–653,April2011等等。pSB及HB转座酶载体可由爱博环球生物技术有限公司无偿提供，其中HB转座酶基因经过密码子优化，在哺乳动物细胞中有较高的表达水平。用上述构建的质粒载体,包括pMH2ID，通过PCR扩增抗体表达的序列元件，包括MAR2，CMV启动子，抗体的重链和轻链基因(用IRES相连)，及DHFR基因等，PCR产物经QIAGEN试剂盒纯化回收；同时pSB以位于两个IR/DR之间的多酶切位点切开后用Klenow补平。上述PCR产物及载体用T4连接酶4℃过夜，转入大肠杆菌，以标准流程培养，提取质粒，以酶切合测序鉴定。所得质粒用PCR扩增包括5‘端IR-DR，MAR2，CMV启动子，抗体的重链和轻链基因(用IRES相连)，DHFR基因，及3‘端IR-DR等，PCR产物经QIAGEN试剂盒纯化回收；pEGFP-Control载体亦用NruII和BstBI酶切过夜。酶切的产物经胶回收后，用Klenow补平并纯化回收。然后用T4连接酶把插入片段与载体进行连接反应，连接反应产物转染到E.coli感受态细胞中，挑选克隆并提质粒，经酶切鉴定和测序，鉴定出含有抗体表达的序列元件的转座子载体，抗体表达所需的序列元件包括在转座子载体的两个ITR之间。载体命名为pSBT-MH2ID(见图11，抗体表达元件，包括CMV启动子、重链和轻链基因及BGHpA等，克隆到pSB转座子载体上)。

用转座子转染的稳定表达HER2抗体的CHO细胞株的筛选：当转座子载体和HB转座酶共转染到细胞内，可使转座子载体内两个ITR之间的DNA片段以TATA位点特异的方式插入到基因组中，形成稳定的表达HER2抗体的细胞株。具体操作如下，5μg的载体，包括pSBT-MH2ID，与2μg的HB转座酶质粒混合，采用与上述质粒转染相似的方式，转染、筛选及鉴定阳性克隆。结果表明，经过7-10天的类似质粒转染细胞的筛选后，转座子转染细胞所形成的细胞克隆数大约是不含转座子的pMH2ID质粒转染所形成的细胞克隆数的20倍左右(见图12，采用与质粒相同的转染及筛选方法，经过7-10天后，转座子载体所得到的CHO细胞克隆数大约是质粒转染的20倍)。

抗体产量的比较：转座子载体转染所筛选的阳性克隆，它们表达的抗体产量及抗体的纯化，采用与上述质粒载体相同的方法，从pSBT-MH2ID转染的阳性克隆中，随机挑选五个，并于50ml的无血清培养基中放大培养。经ProteinA纯化柱纯化后，测定其抗体的含量。结果表明，用pSBT-MH2ID载体所得的五个阳性克隆，它们抗体表达产量和不含SB转座子序列的pMH2ID载体所得的五个阳性克隆的表达产量相比，前者大约是后者的2.5倍左右，达到了大约1.6mg/ml，并且远远高于传统的质粒pH2ID感染细胞的蛋白产率(见图13和图10，采用与质粒相同的转染及筛选方法，经过7-10天后，转座子载体所得到的CHO细胞克隆数大约是质粒转染的20倍)。

转座子载体介导的抗体长期稳定表达：我们随机抽取pSBT-MH2ID和传统的不含MAR元件和SB转座子的对照pH2ID的细胞系各2株连续传代(60小时/代)，表达的抗体，经纯化后，样品走非变性-PAGE胶，随后用考马斯亮蓝染色。我们发现，与传统的表达载体转染的细胞系相比的蛋白表达量相比，虽然两者的瞬时转染抗体表达量相当，但pSBT-MH2ID(含MAR元件)所得的细胞株，在连续传代50代后依然保持很高的蛋白表达量，而传统质粒转染的细胞系的抗体表达量则远远低于初始的瞬时蛋白表达量，证明了结合MAR元件和SB转座子极大地提高了细胞抗体表达的稳定性和持续性(见图14，随机抽取pSBT-MH2ID(抗体表达的转座子载体)和pH2ID(抗体表达的质粒)筛选的稳定细胞株各两株，经连续传代。纯化的抗体以非变性的PAGE胶分离，然后以考马斯蓝染色)。

用细胞结合试验验证表达纯化的抗体：乳腺肿瘤细胞系HCC1954细胞膜表面表达HER2蛋白分子。稳定表达红色荧光蛋白的HCC1954细胞系，是爱博环球生物技术有限公司(HCC1954-RFP)，通过慢病毒感染及流式筛选等方法建立。此细胞系培养在含10％FBS的RPMI1640培养基。细胞结合实验(Cellularbindingassay)的具体过程如下：稳定表达红色荧光蛋白的HCC1954细胞系培养在Poly-L赖氨酸预处理的细胞玻片上(ChamberSlides),经乙醇固定后，用纯化的抗Her2抗体与细胞孵育1小时，经3次PBS漂洗后，用dye-488标记的抗人Fc抗体作为二抗。DAPI标记细胞核作为负染。从结果看出，经纯化过的抗体可特异性结合胞膜的HER2蛋白(见图15，表达HER2蛋白分子的乳腺肿瘤细胞系HCC1954经固定后，与纯化的抗体孵育，并用dye-488标记的抗人Fc抗体作为二抗)。

实施例6:高效表达载体系统的进一步优化：快速便捷的基因表达元件的克隆

结合了MAR元件和SB转座子的表达载体pSBT-MH2ID极大地提高了HER2抗体在哺乳细胞表达的稳定性和持续性，而且大大缩短了筛选稳定克隆的时间。为了快速并系统化克隆表达更多种类的单克隆抗体和各种分泌蛋白，我们将在抗体表达框的两端加上合适的酶切位点。方法上，利用反向PCR(InversePCR)的方法，将含有IL2信号肽，HER2抗体的重链和轻链基因(用IRES相连)的DNA插入片段从pSBT-MH2ID移除。具体来说，以pSBT-MH2ID为模板，5’和3’的引物分别位于上述插入片段的两端，用Phusion(NEB)进行扩增，PCR产物经纯化后，加T4连接酶4℃过夜，转入大肠杆菌，以标准流程培养，提取质粒，以酶切合测序鉴定。所得质粒命名为pSBT-MID(见图16和SEQIDNO.6)，加入合适的限制性内切酶位点，为多个医用蛋白质药物基因的表达提供了迅速便捷的克隆策略)含有MAR2元件和DHFR基因。而且，在CMV下游有多酶切位点(multiplecloningsites),这样就极大地简化克隆过程，从而便于快速并系统化克隆表达更多种类的单克隆抗体和各种分泌蛋白。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

Claims (10)

1.一种用于真核细胞系的提高蛋白表达水平的MAR转录调控元件，其特征在于，所述MAR转录调控元件为具有增强转录的功能的DNA顺式作用元件，MAR转录调控元件为MAR1，MAR2，MAR3.MAR4，MAR5中的任意一种，MAR1的核苷酸序列为SEQIDNO.1,MAR2的核苷酸序列为SEQIDNO.2,MAR3的核苷酸序列为SEQIDNO.3,MAR4的核苷酸序列为SEQIDNO.4和MAR5的核苷酸序列为SEQIDNO.5。

2.根据权利要求1所述的用于真核细胞系的提高蛋白表达水平的MAR转录调控元件，其特征在于，所述MAR转录调控元件提取于中国仓鼠卵巢细胞系CHO。

3.含有如权利要求1所述MAR转录调控元件的医用重组抗体的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，包括：1)使得基因高效表达的DNA顺式作用元件MAR，2)睡美人转座子载体表达抗体基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；3)筛选标记基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；4)IRES序列SEQIDNO.8。

4.根据权利要求2所述的医用重组抗体的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述睡美人转座子载体，含有可被转座酶识别的反向重复序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。

5.根据权利要求2所述的医用重组抗体的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述筛选基因为二氢叶酸还原酶基因DHFR，所述IRES元件为基因合成的FMDVIRES序列。

6.根据权利要求3-5任一项所述的医用重组抗体的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述MAR转录调控元件为MAR2。

7.一种高效稳定表达重组抗体的稳定细胞株的筛选方法，其特征在于，利用权利要求3-5任一项所述的哺乳动物细胞表达载体，将目标基因转染到哺乳动物宿主细胞，筛选获得高表达目标基因的稳定细胞株。

8.根据权利要求7所述的的高效稳定表达重组抗体的稳定细胞株的筛选方法，其特征在于，所述哺乳动物宿主细胞是中华仓鼠卵巢细胞CHO和人胚肾上皮细胞HEK293。

9.根据权利要求7所述的的高效稳定表达重组抗体的稳定细胞株的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括针对筛选标记的抗生素筛选和针对扩增标记基因的药物加压筛选。

10.利用权利要求7-9任一项所述的高效稳定表达重组抗体的稳定细胞株的筛选方法获得的高效稳定表达的细胞株。