CN113862298A - 一种重组表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种可同时插入编码抗体轻链和重链核苷酸序列的表达载体，及插入抗体轻链和重链核苷酸序列后形成的包含编码抗体轻链和重链核苷酸序列的双基因表达载体，包含所述双基因表达载体的哺乳动物宿主细胞，和提高哺乳动物宿主细胞中重组抗体产量的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种可同时插入编码抗体轻链和重链核苷酸序列的表达载体，及插入抗体轻链和重链核苷酸序列后形成的包含编码抗体轻链和重链核苷酸序列的双基因表达载体，包含所述双基因表达载体的哺乳动物宿主细胞，和提高哺乳动物宿主细胞中重组抗体产量的方法。
背景技术
目前，全球累计批准上市90多款抗体药物，其中绝大多数上市抗体采用中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)细胞表达系统，少数上市的抗体片段采用大肠杆菌表达系统，还有极少数采用酵母表达系统。其中广泛应用的CHO细胞表达系统属于哺乳动物细胞表达系统。由于哺乳动物细胞内有蛋白折叠形成正确立体空间构象所需要的分子伴侣，表达的糖基化蛋白药物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子，因此哺乳动物细胞表达体系仍是制备抗体类药物的主流。哺乳动物细胞表达体系主要由宿主细胞和表达载体两部分组成，表达细胞以CHO表达体系最具代表性。
表达载体系统是获得高效表达细胞株的关键，在确定宿主细胞后，蛋白药物的表达量很大程度上由其表达载体的各表达调控元件及组成方式决定。一般来讲，表达载体包括以下几种基本元件：骨架序列、选择性标志基因、表达盒以及一些调控序列。
近年来，通过优化培养基组分、生物反应器设计和细胞培养参数，CHO细胞内重组抗体的产量已经大大提高。Akbarzadeh-Sharbaf,S.等(Avicenna J Med Biotechnol,2013,5(2):87-95.)通过将曲妥珠轻重链分别克隆到两个表达载体上，共转染CHO DG44，其轻重链比例为1:1时表达量最高，在固定培养基上的培养的产量达50～60mg/L/天。Joshi,Sharvari等(International Journal of Pharmaceutical Sciences and DrugResearch,11(2019):393-398.)通过曲妥珠轻重链密码子优化表达量最高达到了1.4g/L。然而，尽管基因表达技术有所改进，但仍存在未满足的抗体需求，抗体表达量仍存在提高空间。
根据Bentley等(Hybridoma,17(1998),559-567)的研究,各抗体以特有的效率表达，该效率由各种因素的组合决定，其中包括轻链合成水平以及重链和轻链的“相容性”。根据Strutzenberger等(J.Biotechnol.，69(1999),215-226)的研究，轻链表达率高有益于提高完整抗体的分泌率。核基质结合区序列(matrix attachment region,MAR)是限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列。研究表明，MAR序列能提高CHO表达系统中转基因表达水平，同时降低转化住转基因表达水平差异。
本发明构建了一种可插入编码抗体轻链和重链核苷酸序列的表达载体，及插入抗体轻链和重链核苷酸序列后形成的同时包含编码抗体轻链和重链核苷酸序列的双基因表达载体，该表达载体能够提高重组抗体的产量，同时便于抗体的筛选，操作简便。
发明内容
本发明提供了一种可同时插入编码抗体轻链和重链核苷酸序列的表达载体，包括第一表达盒元件、第二表达盒元件、第三表达盒元件、第四表达盒元件以及抗性基因和ColE1复制子，其中，第一表达盒元件包括可插入抗体的轻链核苷酸序列的多克隆位点；第二表达盒元件包括可插入抗体的重链核苷酸序列的多克隆位点；第三表达盒元件为MAR元件，第四表达盒元件包括弱化的SV40启动子和谷氨酰胺合成酶基因。
本发明中，第三表达盒元件MAR元件序列选自MAR1、MAR2、MAR3、MAR4、MAR5、MAR6、MAR7、MAR8、MAR9、MAR10，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14所示。优选地，所述MAR元件序列为SEQ ID NO：9所示。
本发明中，第四表达盒元件中弱化的SV40启动子序列优选如SEQ ID NO：15所示，谷氨酰胺合成酶基因序列优选如SEQ ID NO：16所示。
优选地，第一表达盒元件和第二表达盒元件均包括CMV增强子、CMV启动子、多克隆位点和SV40多聚A信号。
更优选地，所述CMV增强子序列如SEQ ID NO：2所示，所述CMV启动子序列如SEQ IDNO：3所示，所述SV40多聚A信号序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明中，第一表达盒元件中多克隆位点优选为HindIII-SmaI-EcoRI，序列为aagctttcgcgacgtacgttcgaacccgggcacgtgcggaccgaattc，第二表达盒元件中多克隆位点优选为AscI-XbaI-PmeI-XhoI，序列为ggcgcgcctctagagtttaaacctcgag。。
优选地，所述抗性基因为氨苄青霉素β内酰胺酶水解基因，序列如SEQ ID NO：17所示。
本发明中，所述ColE1复制子序列优选如SEQ ID NO：18所示。
更优选地，所述表达载体序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供插入抗体轻链和重链核苷酸序列后形成的双基因表达载体。
优选地，所述抗体为曲妥珠单抗
本发明还提供包括以上表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞优选为CHO细胞，更优选地，所述宿主细胞为CHOK1细胞。
本发明还提供了一种提高抗体表达量的方法，所述方法包括以下步骤：
1)用本发明所述的双基因表达载体转染哺乳动物宿主细胞，
2)在适当条件下培养该宿主细胞以使细胞增殖和表达并在细胞内装配轻链和重链，并分泌形成抗体，和
3)收获形成的抗体。
本发明还提供了所述表达载体用于表达重组蛋白的用途。
附图说明
图1，pDM1.0表达载体结构示意图
图2，Herceptin抗体还原(泳道1)和非还原(泳道2)SDS-PAGE电泳图
实施例
实施例1pDM1.0表达载体全基因合成及功能元件
委托生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成pDM1.0表达载体全基因，7855bp，其载体结构示意图如图1所示，序列如SEQ ID NO：1所示，包括：
1、第一表达盒元件
(1)CMV增强子(4161-4540bp)，如SEQ ID NO：2所示。
(2)CMV启动子(4541-4744bp)，如SEQ ID NO：3所示。
(3)多克隆位点1(5632-5679bp)：HindIII-SmaI-EcoRI，序列为aagctttcgcgacgtacgttcgaacccgggcacgtgcggaccgaattc
(4)SV40多聚A信号1(5789-5910bp)，如SEQ ID NO：4所示。
2、第二表达盒元件
(1)CMV增强子(6269-6648bp)，如SEQ ID NO：2所示。
(2)CMV启动子(6649-6852bp)，如SEQ ID NO：3所示。
(3)多克隆位点2(7834-7855bp)：AscI-XbaI-PmeI-XhoI，序列为ggcgcgcctctagagtttaaacctcgag
(4)SV40多聚A信号2(115-236bp)，如SEQ ID NO：4所示。
3、MAR元件(5938-6250bp)，如SEQ ID NO：9所示。
4、谷氨酰胺合成酶表达盒
(1)弱化的SV40启动子(2320-2543bp)，如SEQ ID NO：15所示。
(2)谷氨酰胺合成酶基因(2583-3704bp)，如SEQ ID NO：16所示。
5、氨苄青霉素β内酰胺酶水解基因(1027-1887bp)，如SEQ ID NO：17所示。
6、ColE1复制子(268-856bp)，如SEQ ID NO：18所示。
实施例2含Herceptin轻链和重链基因的双基因载体pDM1.0-Herceptin的构建
根据曲妥珠单抗的轻链和重链的氨基酸序列设计出其对应的DNA序列。委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，并分别连接入pUC57载体，以pUC57-AH2-LC和pUC57-AH2-HC的形式提供
在轻链和重链DNA序列的5’端加上酶切位点Kozak序列(GCCACC)、信号肽序列，在3’端依次加上终止密码子和酶切位点。其中，轻链基因所用酶切位点为HindIII和EcoRI；重链所用酶切位点为AscI和PmeI。信号肽序列为5’-ATGAAGTACCTGCTGCCCACCGCTGCTGCTGGCCTGCTGCTGCTGGCTGCT CA GCCCGCTATGGCT-3’。含轻链载体pUC57-AH2-LC经HindIII和EcoRI双酶切后回收相应片段，与同样经过HindIII和EcoRI双酶切的pDM1.0载体片段经T4 DNA连接酶连接，构建成功的载体为pDM1.0-LC。含重链载体pUC57-AH2-HC经AscI和PmeI双酶切后回收相应片段，与同样经过AscI和PmeI双酶切的pDM1.0-LC载体片段经T4 DNA连接酶连接，构建成功的载体为pDM1.0-Herceptin。
实施例3Herceptin抗体高表达细胞株的筛选
4mm电转杯4℃预冷，1.5ml CHOK1细胞(ATCC)液中加入22.5μg实施例2所构建的双基因载体DNA(6μg/106个细胞)，混匀后冰浴10min，取出500ul混合液加入电转杯，280V电击10ms(BTX，EMC2001 cat.450018)，电击后将细胞加入T25瓶中，电击完毕后T25瓶用CDFortiCHO补至6ml体系，37℃开始静置培养。细胞转染后在6孔板中复苏48h，做瞬转产量评估，挑表达量高的细胞池(要求活率大于95％)铺96孔板(加10～20％的条件培养基)，3000～5000cells/well，25uM MSX加压；
3～4周后，检测细胞池的表达水平(约1μg/ml)。挑选表达量最高的细胞池到24孔，进行表达确认，再挑选表达量高的细胞池到6孔板，再次进行表达确认。最后进行摇瓶确认(Fed-batch 0.5g/L)，挑选表达量前3名的细胞池进行单克隆的筛选(有限稀释，0.4个细胞/well)。
实施例4Herceptin抗体的表达和初步纯化
将高表达Herceptin的表达量最高的细胞池置无血清的CD FortiCHO中摇瓶培养，一定时间后收集培养上清。用pH7.4的PBS溶液平衡HiTrapMabSelectSuRe1ml柱(GEHealthcare Life Sciences产品，Cat.No：11-0034-93)10个柱体积，流速为0.5ml/min；培养上清液用0.45μm滤膜过滤上样，流速为0.5ml/min。用pH7.4的PBS溶液再洗5-10个柱体积，流速为0.5ml/min；用100mM柠檬酸缓冲液(pH3.6)洗脱，流速为0.5ml/min，收集洗脱峰。
经ELISA和protein A-HPLC检测抗体在上清中的表达量，结果为2g/L。
纯化Herceptin非还原SDS-PAGE电泳和还原SDS-PAGE电泳见图2，非还原电泳蛋白表观分子量大约220kDa；还原SDS-PAGE电泳重链约50kDa，轻链约25kDa，Herceptin理论分子量约150kDa，实测值均与理论预期一致。
应该理解，本发明描述的具体实例和方案仅仅是为了例证目的作为示例给出，不视为对本发明的限制，包括在本申请的精神和范围内的各种进一步修改或变化均视为涵盖在本发明的公开范围内。
序列表
<110> 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司
<120> 一种重组表达载体
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7855
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 1
ctcgagttga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac 60
ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg 120
tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa 180
gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat 240
gtctgctcgg gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 300
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 360
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 420
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 480
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 540
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 600
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 660
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 720
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 780
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 840
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 900
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 960
ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 1020
tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 1080
atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 1140
tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 1200
aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 1260
catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 1320
gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 1380
ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 1440
aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 1500
atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 1560
cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 1620
gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 1680
agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 1740
gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 1800
caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 1860
ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 1920
tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 1980
aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat 2040
catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tgatggctct ttgcggcacc 2100
catcgttcgt aatgttccgt ggcaccgagg acaaccctca agagaaaatg taatcacact 2160
ggctcacctt cgggtgggcc tttctgcgtt tataaggaga cactttatgt ttaagaaggt 2220
tggtaaattc cttgcggctt tggcagccaa gctagatccg gctgtggaat gtgtgtcagt 2280
tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccac catcgatggg caggcagaag tatgcaaagc 2340
atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta 2400
actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca 2460
gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga 2520
ggcctaggct tttgcaaaaa gctggatcca gcttggggcc accgctcaga gcaccttcca 2580
ccatggccac ctcagcaagt tcccacttga acaaaaacat caagcaaatg tacttgtgcc 2640
tgccccaggg tgagaaagtc caagccatgt atatctgggt tgatggtact ggagaaggac 2700
tgcgctgcaa aacccgcacc ctggactgtg agcccaagtg tgtagaagag ttacctgagt 2760
ggaattttga tggctctagt acctttcagt ctgagggctc caacagtgac atgtatctca 2820
gccctgttgc catgtttcgg gaccccttcc gcagagatcc caacaagctg gtgttctgtg 2880
aagttttcaa gtacaaccgg aagcctgcag agaccaattt aaggcactcg tgtaaacgga 2940
taatggacat ggtgagcaac cagcacccct ggtttggaat ggaacaggag tatactctga 3000
tgggaacaga tgggcaccct tttggttggc cttccaatgg ctttcctggg ccccaaggtc 3060
cgtattactg tggtgtgggc gcagacaaag cctatggcag ggatatcgtg gaggctcact 3120
accgcgcctg cttgtatgct ggggtcaaga ttacaggaac aaatgctgag gtcatgcctg 3180
cccagtggga gttccaaata ggaccctgtg aaggaatccg catgggagat catctctggg 3240
tggcccgttt catcttgcat cgagtatgtg aagactttgg ggtaatagca acctttgacc 3300
ccaagcccat tcctgggaac tggaatggtg caggctgcca taccaacttt agcaccaagg 3360
ccatgcggga ggagaatggt ctgaagcaca tcgaggaggc catcgagaaa ctaagcaagc 3420
ggcaccggta ccacattcga gcctacgatc ccaagggggg cctggacaat gcccgtcgtc 3480
tgactgggtt ccacgaaacg tccaacatca acgacttttc tgctggtgtc gccaatcgca 3540
gtgccagcat ccgcattccc cggactgtcg gccaggagaa gaaaggttac tttgaagacc 3600
gccgcccctc tgccaattgt gacccctttg cagtgacaga agccatcgtc cgcacatgcc 3660
ttctcaatga gactggcgac gagcccttcc aatacaaaaa ctaagtcgac taatcagcca 3720
taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct 3780
gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta 3840
caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag 3900
ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatctagc ttcgtgtcaa 3960
ggacggtgac tgcagtgaat aataaaatgt gtgtttgtcc gaaatagatc tctatacatt 4020
gaatcaatat tggccattag ccatattatt cattggttat atagcataaa tcaatattgg 4080
ctattggcca ttgcatacgt tgtatccata tcataatatg tacatttata ttggctcatg 4140
tccaacatta ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac 4200
ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg 4260
cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc 4320
catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac 4380
tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa 4440
tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac 4500
ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta 4560
catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga 4620
cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa 4680
ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag 4740
agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca 4800
tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg gaacgcggat 4860
tccccgtgcc aagagtgacg taagtaccgc ctatagagtc tataggccca cccccttggc 4920
ttcttatgca tgctatactg tttttggctt ggggtctata cacccccgct tcctcatgtt 4980
ataggtgatg gtatagctta gcctataggt gtgggttatt gaccattatt gaccactccc 5040
ctattggtga cgatactttc cattactaat ccataacatg gctctttgcc acaactctct 5100
ttattggcta tatgccaata cactgtcctt cagagactga cacggactct gtatttttac 5160
aggatggggt ctcatttatt atttacaaat tcacatatac aacaccaccg tccccagtgc 5220
ccgcagtttt tattaaacat aacgtgggat ctccacgcga atctcgggta cgtgttccgg 5280
acatgggctc ttctccggta gcggcggagc ttctacatcc gagccctgct cccatgcctc 5340
cagcgactca tggtcgctcg gcagctcctt gctcctaaca gtggaggcca gacttaggca 5400
cagcacgatg cccaccacca ccagtgtgcc gcacaaggcc gtggcggtag ggtatgtgtc 5460
tgaaaatgag ctcggggagc gggcttgcac cgctgacgca tttggaagac ttaaggcagc 5520
ggcagaagaa gatgcaggca gctgagttgt tgtgttctga taagagtcag aggtaactcc 5580
cgttgcggtg ctgttaacgg tggagggcag tgtagtctga gcagtactcg taagctttcg 5640
cgacgtacgt tcgaacccgg gcacgtgcgg accgaattca ttgatcataa tcagccatac 5700
cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa 5760
acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 5820
ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 5880
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg cttaattaag cggccgctgg 5940
gggtgtaaaa ggttccaaaa aaggaacctt aataataaaa tacggccaca tgaatttatt 6000
tatgtttggg aaatttttaa tatatttttt taatgagata ataaggctcc acttatttta 6060
ttcccttttg gtgtgttttg ggaaaaaaat ccccatgttc attttataaa taaacaaaaa 6120
aaattttttt cgatactttt tataagtaat gttgacgata ccgatacaag aggagaatat 6180
atttctcctc ctcttggccc caatgccttt gcaggtgtcc ttaccatgcg catatcatat 6240
ttatgtttag gcggccgccg gctagccgga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa 6300
tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 6360
gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 6420
tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 6480
cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 6540
gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 6600
tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 6660
tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 6720
cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt 6780
cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat 6840
ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt 6900
gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgcg gccgggaacg gtgcattgga 6960
acgcggattc cccgtgccaa gagtgacgta agtaccgcct atagagtcta taggcccacc 7020
cccttggctt cttatgcatg ctatactgtt tttggcttgg ggtctataca cccccgcttc 7080
ctcatgttat aggtgatggt atagcttagc ctataggtgt gggttattga ccattattga 7140
ccactcccct attggtgacg atactttcca ttactaatcc ataacatggc tctttgccac 7200
aactctcttt attggctata tgccaataca ctgtccttca gagactgaca cggactctgt 7260
atttttacag gatggggtct catttattat ttacaaattc acatatacaa caccaccgtc 7320
cccagtgccc gcagttttta ttaaacataa cgtgggatct ccacgcgaat ctcgggtacg 7380
tgttccggac atgggctctt ctccggtagc ggcggagctt ctacatccga gccctgctcc 7440
catgcctcca gcgactcatg gtcgctcggc agctccttgc tcctaacagt ggaggccaga 7500
cttaggcaca gcacgatgcc caccaccacc agtgtgccgc acaaggccgt ggcggtaggg 7560
tatgtgtctg aaaatgagct cggggagcgg gcttgcaccg ctgacgcatt tggaagactt 7620
aaggcagcgg cagaagaaga tgcaggcagc tgagttgttg tgttctgata agagtcagag 7680
gtaactcccg ttgcggtgct gttaacggtg gagggcagtg tagtctgagc agtactcgtt 7740
gctgccgcgc gcgccaccag acataatagc tgacagacta acagactgtt cctttccatg 7800
ggtcttttct gcagtcaccg tccttgacac gaaggcgcgc ctctagagtt taaac 7855
<210> 2
<211> 380
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 2
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg 380
<210> 3
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180
tgggaggtct atataagcag agct 204
<210> 4
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 4
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
ta 122
<210> 5
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 5
ttccagatct cgatatcttt aatttctaat atatttagaa ggggtttaga tttatatatg 60
acgtccatga aaaaaaattt taaaacgata ggccagctcc aaagaatata tttccctgga 120
gctggtaaat attaattagt cctctccctt ctaatatatt tttcgatatt tttgattcct 180
ttttaagatt atatagctcc atgccaacct gacttcctaa tatattttat gaagtcagca 240
aaatttttaa aaaccacact tcacttggta tatatttata aatgtttaaa cttaatttca 300
cttgtaaaac tcttccacga tccgtgc 327
<210> 6
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 6
ttccagatct tgggggtgta aaaggttcca aaaaaggaac cttgtcaaca ttcatgaggg 60
ccacatgaat ttatttatcg atatttaata tatttcgata ggctccactt attttattcc 120
cttttggtgt gttttcatgc aggttcccga taaataaaca aaaaaaattt ttttcgatac 180
gatacgatac aagaggagaa tatatttctc ctcttggccc caatgccttt gcaggtgtcc 240
ttaccatgcg catatcatat ttatgtttag gatccgtgc 279
<210> 7
<211> 320
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 7
ttccagatct ttattattta tgacgtccat gatttatgtt taaaaaattt aggcccattt 60
ggaaccattt cacttgtaaa acatgttggt acacttattt tatttggggg tgtaaaaccc 120
tataaaaagt atagattcat atgggttttt tttgcaggtg tccttgctat gacgtccatg 180
aataaataaa cgataggaaa cccgataaaa gcacctttat tttattggct tttgagaact 240
ttttgtgaat attcatccaa ggtgtgccaa gattatatac caatttattt attgacgtcc 300
atgaaaaaaa ggatccgtgc 320
<210> 8
<211> 353
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 8
gtttgggaaa tttctttaat ttctaatata tttagaaggg aataataaaa tactgacgtc 60
catgaaaaaa aattttaaaa catgttcatt ttggaataaa yaaaccagct ccaaagaata 120
tatttttata tttttccctg gagctgggta aatattaatt agtcctctcc ctttttataa 180
gtaatgttga ttctaatata tttttcgata ttttgattcc tttttaagat tatatagctc 240
catgccaagc tgacttccta atatatttta tgaagtcagc aaaattttta aaaagcacac 300
ttgacttggg gaaaaaaatt gtttaaactt aatttcactt gtaaactctt gca 353
<210> 9
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 9
tgggggtgta aaaggttcca aaaaaggaac cttaataata aaatacggcc acatgaattt 60
atttatgttt gggaaatttt taatatattt ttttaatgag ataataaggc tccacttatt 120
ttattccctt ttggtgtgtt ttgggaaaaa aatccccatg ttcattttat aaataaacaa 180
aaaaaatttt tttcgatact ttttataagt aatgttgacg ataccgatac aagaggagaa 240
tatatttctc ctcctcttgg ccccaatgcc tttgcaggtg tccttaccat gcgcatatca 300
tatttatgtt tag 313
<210> 10
<211> 344
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 10
ttattattta tgacgtccat gatttatgtt taaaaaattt aggcccattt tttttataag 60
taatgttgac gaaccatttc acttgtaaaa aataataaaa tacacttatt ttatttgggg 120
gtgtaaaacc ctataaaaag tatagattca tatgggtttt ttttgcaggt gtccttgcta 180
tgacgtccat gcatgttcat tttaataaat aaagtttggg aaattggaaa ccgtttggga 240
aattaaaggc acctttattt tattggcttt tgagaacttt tgggaaaaaa ataggtgtgc 300
caagattata taccaattta tttattgacg tccatgaaaa aaaa 344
<210> 11
<211> 350
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 11
agccaggcat gtgatgtaca cctgtagtcc cagctactca ggaggccgaa gccaggtgtg 60
gtggcatgtg cctgtagtcc tacctactcg ggaggctgag gctggacgtg gtggcacgtg 120
cctgtagtcc cagctactcg ggaggctgag gctgggcgtg gtggtgcctg cctgtaatcc 180
cagctactca gaaggctcag agcaggtggg ggcacttctc cctctaacac tctcccctgt 240
tgaagctctt gctgggcatg gtggcacacg cctataatcc cagctactca ggaggctgag 300
ggtgtgggtg gagagaaccg cttgtgagct tgtctctgcg gccagctgag 350
<210> 12
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 12
ggaaactgga gaaactggga ggagtatcca gatgtcctgt ccctgtaagg gaatgtggga 60
ggtggaggtt gcagtgacct gagatcgtgc cactgcactc gaacccagga ggtggaggtt 120
gcagtgagct gagatcgcgc cactgcactc aaatagtgca gcaatgaaca tgagagtgca 180
actatctctt caatgtactg gaaccaggga gtcggtggct agagtgagcc gagattgcat 240
cactgcactc tattcaggta ggtgtagggt ggggggtgtt gaggtttaag taagcaaagt 300
aagccaagga ggaggagggg ggtgaggtga aagatgagct ggaggaccgc gaatccggga 360
ggcagaggtc acagtgagcc aagatcacgc cactgtactc gactcctggg cgtggagcct 420
accctggggt atggttgata aacacagtgt gaaaacggca gttgggcact gcactgcccg 480
gtgatggtgc cacggtggct 500
<210> 13
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 13
gatattatcc tggacaacat agcaagacct cgtctctact taaaaaaaaa aagaccagcc 60
tgatcaacat ggtgaaaccc tgtctctact aaaaatacaa gagaccatcc tgaccaatat 120
ggtgaaaccc catctctact aaagatacaa aagaccagcc tggccaacat ggtgaaatcc 180
cgtctctatt aaaaatacaa aacacaggcc tcaccaagca ggaaaagcca cctctgccct 240
<210> 14
<211> 1078
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 14
agccaggcat gtgatgtaca cctgtagtcc cagctactca ggaggccgaa ggaaactgga 60
gaaactggga ggagtatcca gatgtcctgt ccctgtaagg gatattatcc tggacaacat 120
agcaagacct cgtctctact taaaaaaaaa gccaggtgtg gtggcatgtg cctgtagtcc 180
tacctactcg ggaggctgag gaatgtggga ggtggaggtt gcagtgacct gagatcgtgc 240
cactgcactc aagaccagcc tgatcaacat ggtgaaaccc tgtctctact aaaaatacaa 300
gctggacgtg gtggcacgtg cctgtagtcc cagctactcg ggaggctgag gaacccagga 360
ggtggaggtt gcagtgagct gagatcgcgc cactgcactc gagaccatcc tgaccaatat 420
ggtgaaaccc catctctact aaagatacaa aaatagtgca gcaatgaaca tgagagtgca 480
actatctctt caatgtactg ggtgtgggtg gagagaaccg cttgtgagct tgtctctgcg 540
gccagctgag aacacaggcc tcaccaagca ggaaaagcca cctctgccct aaaagtaaga 600
gactcctggg cgtggagcct accctggggt atggttgata aacacagtgt gaaaacggca 660
gttgggcact gcactgcccg gtgatggtgc cacggtggct gctgggcgtg gtggtgcctg 720
cctgtaatcc cagctactca gaaggctcag gaaccaggga gtcggtggct agagtgagcc 780
gagattgcat cactgcactc tattcaggta ggtgtagggt ggggggtgtt gaggtttaag 840
taagcaaagt agcaggtggg ggcacttctc cctctaacac tctcccctgt tgaagctctt 900
aagccaagga ggaggagggg ggtgaggtga aagatgagct ggaggaccgc gctgggcatg 960
gtggcacacg cctataatcc cagctactca ggaggctgag gaatccggga ggcagaggtc 1020
acagtgagcc aagatcacgc cactgtactc aagaccagcc tggccaacat ggtgaaat 1078
<210> 15
<211> 224
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 15
gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta 60
actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga 120
ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct attccagaag 180
tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agct 224
<210> 16
<211> 1122
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 16
atggccacct cagcaagttc ccacttgaac aaaaacatca agcaaatgta cttgtgcctg 60
ccccagggtg agaaagtcca agccatgtat atctgggttg atggtactgg agaaggactg 120
cgctgcaaaa cccgcaccct ggactgtgag cccaagtgtg tagaagagtt acctgagtgg 180
aattttgatg gctctagtac ctttcagtct gagggctcca acagtgacat gtatctcagc 240
cctgttgcca tgtttcggga ccccttccgc agagatccca acaagctggt gttctgtgaa 300
gttttcaagt acaaccggaa gcctgcagag accaatttaa ggcactcgtg taaacggata 360
atggacatgg tgagcaacca gcacccctgg tttggaatgg aacaggagta tactctgatg 420
ggaacagatg ggcacccttt tggttggcct tccaatggct ttcctgggcc ccaaggtccg 480
tattactgtg gtgtgggcgc agacaaagcc tatggcaggg atatcgtgga ggctcactac 540
cgcgcctgct tgtatgctgg ggtcaagatt acaggaacaa atgctgaggt catgcctgcc 600
cagtgggagt tccaaatagg accctgtgaa ggaatccgca tgggagatca tctctgggtg 660
gcccgtttca tcttgcatcg agtatgtgaa gactttgggg taatagcaac ctttgacccc 720
aagcccattc ctgggaactg gaatggtgca ggctgccata ccaactttag caccaaggcc 780
atgcgggagg agaatggtct gaagcacatc gaggaggcca tcgagaaact aagcaagcgg 840
caccggtacc acattcgagc ctacgatccc aaggggggcc tggacaatgc ccgtcgtctg 900
actgggttcc acgaaacgtc caacatcaac gacttttctg ctggtgtcgc caatcgcagt 960
gccagcatcc gcattccccg gactgtcggc caggagaaga aaggttactt tgaagaccgc 1020
cgcccctctg ccaattgtga cccctttgca gtgacagaag ccatcgtccg cacatgcctt 1080
ctcaatgaga ctggcgacga gcccttccaa tacaaaaact aa 1122
<210> 17
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 17
ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 60
agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 120
cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 180
ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 240
gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 300
cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 360
cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 420
ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 480
catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 540
tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 600
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cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 840
acggaaatgt tgaatactca t 861
<210> 18
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 18
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 60
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 120
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 180
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 240
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 300
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 360
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 420
taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 480
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 540
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaa 589
Claims (12)
1.一种可同时插入编码抗体轻链和重链核苷酸序列的表达载体，包括第一表达盒元件、第二表达盒元件、第三表达盒元件、第四表达盒元件以及抗性基因和ColE1复制子，其中，第一表达盒元件包括可插入抗体的轻链核苷酸序列的多克隆位点；第二表达盒元件包括可插入抗体的重链核苷酸序列的多克隆位点；第三表达盒元件为MAR元件，第四表达盒元件包括弱化的SV40启动子和谷氨酰胺合成酶基因。
2.权利要求1所述的表达载体，其特征在于，第三表达盒元件MAR元件序列选自MAR1、MAR2、MAR3、MAR4、MAR5、MAR6、MAR7、MAR8、MAR9、MAR10，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14所示，优选地，所述MAR元件序列如SEQ ID NO：9所示。
3.权利要求1-2任一项所述的表达载体，其特征在于，第四表达盒元件中弱化的SV40启动子序列优选如SEQ ID NO：15所示，谷氨酰胺合成酶基因序列优选如SEQ ID NO：16所示。
4.权利要求1-3任一项所述的表达载体，其特征在于，第一表达盒元件和第二表达盒元件均包括CMV增强子、CMV启动子、多克隆位点和SV40多聚A信号，优选地，所述CMV增强子序列如SEQ ID NO：2所示，所述CMV启动子序列如SEQ ID NO：3所示，所述SV40多聚A信号序列如SEQ ID NO：4所示。
5.权利要求1-4任一项所述的表达载体，其特征在于，第一表达盒元件中多克隆位点优选为HindIII-SmaI-EcoRI，第二表达盒元件中多克隆位点优选为AscI-XbaI-PmeI-XhoI。
6.权利要求1-5任一项所述的表达载体，其特征在于，所述抗性基因为氨苄青霉素β内酰胺酶水解基因，序列如SEQ ID NO：17所示。
7.权利要求1-6任一项所述的表达载体，其特征在于，所述ColE1复制子序列优选如SEQID NO：18所示。
8.权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体序列如SEQ ID NO：1所示。
9.一种双基因表达载体，其特征在于，其包括分别在权利要求1-8任一项所述的表达载体第一表达盒元件中插入的抗体轻链核苷酸序列和第二表达盒元件中插入的抗体重链核苷酸序列，优选地，所述抗体为曲妥珠单抗。
10.包含权利要求9所述的双基因表达载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞为CHO细胞，更优选地，所述宿主细胞为CHOK1细胞。
11.一种提高抗体表达量的方法，所述方法包括以下步骤：
1)用权利要求9所述的双基因表达载体转染哺乳动物宿主细胞，
2)在适当条件下培养该宿主细胞以使细胞增殖和表达并在细胞内装配轻链和重链，并分泌形成抗体，和
3)收获形成的抗体。
12.权利要求1-9任一项所述的表达载体和权利要求10所述的宿主细胞在用于表达重组蛋白中的用途。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104946687A (zh) * | 2015-06-09 | 2015-09-30 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法 |
| CN105255895A (zh) * | 2015-11-06 | 2016-01-20 | 爱博环球生物技术有限公司 | 用于真核细胞系的提高蛋白表达水平的mar转录调控元件及其表达系统 |
| CN105695494A (zh) * | 2016-04-27 | 2016-06-22 | 新乡医学院 | 一种三顺反子表达载体、制备方法及应用 |
| WO2016151599A1 (en) * | 2015-03-25 | 2016-09-29 | Biogenomics Limited | A bigenic mammalian expression vector |
| CN107868781A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-04-03 | 新乡医学院 | 人工合成mar片段、表达载体、表达系统及其应用 |
-
2020
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016151599A1 (en) * | 2015-03-25 | 2016-09-29 | Biogenomics Limited | A bigenic mammalian expression vector |
| CN104946687A (zh) * | 2015-06-09 | 2015-09-30 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法 |
| CN105255895A (zh) * | 2015-11-06 | 2016-01-20 | 爱博环球生物技术有限公司 | 用于真核细胞系的提高蛋白表达水平的mar转录调控元件及其表达系统 |
| CN105695494A (zh) * | 2016-04-27 | 2016-06-22 | 新乡医学院 | 一种三顺反子表达载体、制备方法及应用 |
| CN107868781A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-04-03 | 新乡医学院 | 人工合成mar片段、表达载体、表达系统及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李浩强等: "治疗性抗体高表达CHO 细胞株构建策略", 中国医药生物技术, vol. 8, no. 3, pages 220 - 224 * |
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