CN115074385A - 一种降低新冠病毒受体ace2表达量的表观遗传载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可用于指示新冠病毒受体ACE2表达量的载体、细胞株及其制备方法与应用，通过表观遗传基因编辑载体CRISPRoff‑v2.1中的蓝色荧光蛋白TagBFP替换为绿色荧光蛋白EGFP的编码序列、导入抗生素筛选标记基因和荧光标记基因，同时加入能切割ACE2启动子基因组的sgRNA，获得表观遗传修饰载体，并最终得到能够降低ACE2表达量的细胞株。本发明构建的载体和细胞能特异性地降低新冠病毒受体ACE2的表达，为治疗新冠提供了另一种具有可能性的技术手段和临床思路。

Description

一种降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传载体

技术领域

本发明属于基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种可用于降低新冠病毒受体ACE2 表达量的表观遗传修饰载体，本发明还包括相应的制备方法、应用、细胞株和试剂盒。

背景技术

2019年底，由一种冠状病毒新毒株(2019-nCoV，即2019新型冠状病毒)引起的疫情迅速蔓延到全国和全世界。截止到2020年8月中旬，新型冠状病毒感染的肺炎(Novelcoronavirus pneumonia，NCP)在世界范围内已造成接近2000万例感染，并造成接近80万例死亡，给全世界社会、经济、政治、生活都造成了严重影响。

有研究表明：冠状病毒是通过S蛋白与宿主的受体结合，从而感染宿主细胞。冠状病毒 S蛋白的多样性高、机制复杂，β属冠状病毒的S蛋白大小以及在细胞表面与其结合的受体都各不相同。2003年给我国造成重大损失的SARS病毒也属于冠状病毒类。经研究证实，SARS-Cov是通过细胞膜表面ACE2受体进入细胞。而我国病毒所石正丽研究团队通过实验证明2019-nCoV可以通过细胞膜表面ACE2受体进入细胞，这与SARS-CoV进入细胞的途径是一样的。这些都提示ACE2可能是新型冠状病毒的潜在治疗靶点。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated) 系统是原核生物所拥有的一种针对外源性遗传物质的免疫系统。CRISPR/Cas系统具有操作简单、成本低廉和作用高效的特点，是目前已经被广泛用于基础研究的基因编辑新技术。 CRISPR/Cas系统是进行基因编辑的强大工具，可以对大部分物种的基因组进行精确编辑。当将含有Cas9蛋白编码基因和sgRNA表达序列的质粒转染某个细胞时，sgRNA可以靶向目标序列，Cas9蛋白则会使相应的DNA双链发生断裂。

最新的研究表明：当对Cas9关键位点进行突变，形成的dcas9不会造成DNA双链的断裂，对于临床应用具有更高的价值。而当对Cas9系统加上转录抑制因子(如KRAB)，就能抑制转录的发生，降低靶基因的表达量。2021年，国际顶级杂志《cell》在线发表了JonathanS.Weissman的研究成果，展示了一个可以通过表观修饰调控基因表达的载体CRISPRoff-v2.1 (含有dCas9、KRAB和TagBFP)。

发明内容

本发明旨在提供一种新的技术手段，对于临床治疗抗新冠病毒提供一种新的途径。

本发明提出一种可用于降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体，并且通过 CRISPR/Cas技术构建可用于降低新冠病毒受体ACE2表达量的基因工程细胞株。

一方面，本发明提供了一种降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体，将表观遗传基因编辑载体CRISPRoff-v2.1中的蓝色荧光蛋白TagBFP替换为绿色荧光蛋白EGFP 的编码序列，并加上抗性基因；同时，该表观遗传修饰载体中含有能切割ACE2启动子基因组的sgRNA。

本发明中，表观遗传基因编辑载体即CRISPRoff-v2.1，也是通过修饰获得的表观遗传基因编辑载体，其中TagBFP是蓝色荧光蛋白，均可参见《cell》在线2021年发表了Jonathan S. Weissman的文章。

本发明中，ACE2是新型冠状病毒的受体，也包括与新冠病毒受体ACE2具有相同序列，或者与新冠病毒受体ACE2高度同源并且具有相似功能的基因或者其表达产物。

本发明的载体中可以使用各种常见的抗性基因，或者专门用于基因编辑领域的抗性基因。优选的，所述的抗性基因是嘌呤霉素抗性基因puroR。

优选的，所述的sgRNA的序列选自以下序列中一个或者多个：

sg1：5`-ATGACTACTCTCCACTCCAC-3`，

sg2：5`-TGCCCAAGTAGAGAGTTTCT-3`，

sg3：5`-AGTTTTGAATAGGTAAGTGA-3`，

sg4：5`-GGCAAAGTCATGTATTTGGA-3`。

也可以将上述一个或者多个sgRNA串联成成对的形式，插入CRISPRoff-v2.1中TagBFP 替换为EGFP后得到将表观遗传基因编辑载体。

相应的，本发明提供了一种用于降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体的制备方法，包括以下步骤：

将表观遗传基因编辑载体CRISPRoff-v2.1中的蓝色荧光蛋白TagBFP替换为绿色荧光蛋白EGFP的编码序列；

在表观遗传基因编辑载体CRISPRoff-v2.1中加入抗性基因；

将能切割ACE2启动子基因组的sgRNA加入表观遗传基因编辑载体CRISPRoff-v2.1中；

所述的sgRNA的序列选自以下序列中一个或者多个：

sg1：5`-ATGACTACTCTCCACTCCAC-3`，

sg2：5`-TGCCCAAGTAGAGAGTTTCT-3`，

sg3：5`-AGTTTTGAATAGGTAAGTGA-3`，

sg4：5`-GGCAAAGTCATGTATTTGGA-3`。

优选的，本发明的载体制备方法包括以下步骤：

S1、设计能高效切割ACE2启动子基因组的两条sgRNA；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

S2、将表观遗传基因编辑载体CRISPRoff-v2.1中非常规使用的蓝色荧光蛋白TagBFP替换为常规的绿色荧光蛋白EGFP，并加上嘌呤霉素抗性基因puroR，命名为CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP；替换的序列是指替换TagBFP的序列，也就是EGFP+puroR的序列，如SEQ ID NO.3所示；

S3、将S1所述两条sgRNA串联成成对的形式(pair-gRNA，pgRNA，序列见SEQ IDNO.4)，插入S2构建的载体中，获得的载体命名为ACE2-CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP。

优选的，本发明的载体制备方法中，最终获得的用于降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的表观遗传修饰载体可用于降低受体蛋白ACE2的表达量。

另一方面，本发明还提出一种使用上述载体制备得到的细胞株。所述的细胞株含有上述的降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体。

根据本发明的第一方面提供的用于降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体，提供了一种可用于降低新冠病毒受体ACE2表达量的细胞株的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计并验证能高效切割ACE2启动子基因组的两条sgRNA；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

(2)将表观遗传基因编辑载体CRISPRoff-v2.1中非常规使用的蓝色荧光蛋白TagBFP替换为常规的绿色荧光蛋白EGFP，并加上嘌呤霉素抗性基因puroR，命名为CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP。替换的序列如SEQ ID NO.3所示；

(3)将步骤(1)所述两条sgRNA串联成成对的形式(pair-gRNA，pgRNA，序列见SEQID NO.4)，插入步骤(2)构建的载体中，获得的载体命名为ACE2-CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP。最终获得的可用于降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体序列如SEQ IDNO.5 所示；

(4)将步骤(3)中获得的载体转染细胞系，通过puro霉素筛选及绿色荧光蛋白EGFP筛选阳性细胞，并经分子生物学技术鉴定即得。

所述的细胞系可以是原代细胞或者经过培养的细胞，优选的可以采用各种永生化细胞，例如ATCC或者中科院细胞库中保存或者出售的各种正常或者肿瘤细胞。在本发明的一个优选例中，使用了A549细胞。

根据本发明的一些实施例，所述可用于降低新冠病毒受体ACE2表达量的细胞株同时导入抗生素筛选标记基因和绿色荧光标记基因。其中，抗生素筛选标记基因为嘌呤霉素抗性基因。

根据本发明的一些实施例，所述的能高效靶向ACE2启动子的sgRNA串联形成pgRNA，能更高效地降低ACE2的表达量。

本发明还提供了相应的试剂盒，所述的试剂盒含有上述的降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体或者含有该载体的细胞。

本发明的载体、细胞或者试剂盒能够有效降低新冠病毒受体ACE2的表达，用于制备预防或者治疗新冠病毒的药物或者试剂。

本发明至少具有如下有益效果：

1.本发明对CRISPRoff-v2.1进行了优化改造，将非常规使用的TagBFP替换成常规使用的EGFP，加上了筛选标记puRO，使得本发明的载体能具有更广泛的实用性。

2.本发明描述的载体创造性地加入针对新冠病毒受体ACE2启动子的双sgRNA，使之能特异性地降低新冠病毒受体ACE2的表达，为治疗新冠提供了另一种具有可能性的技术手段和临床思路。

附图说明

图1为本发明实施例中不同sgRNA靶位点切割效果图。

图2为本发明实施例中构建的CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP载体图谱。

图3为本发明实施例中构建的ACE2-CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP载体图谱。

图4为本发明实施例中构建的遗传修饰载体ACE2-CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP转染A549效果图。左图是荧光，右图是白光。

图5为筛选后获得的A549细胞图。左图是荧光，右图是白光。

图6为QPCR验证本发明实施例中ACE2-CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP降低ACE2基因表达的效果。

图7为WB验证本发明实施例中ACE2-CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP降低ACE2蛋白表达的效果。

图8为新型冠状病毒的电镜照片，源自中国疾病预防控制中心。

具体实施方式

本发明对CRISPRoff-v2.1进行了优化改造，将非常规使用的TagBFP替换成常规使用的 EGFP，加上了筛选标记puRO，使得本发明的载体能具有更广泛的实用性。另外，本发明描述的载体创造性地加入针对新冠病毒受体ACE2启动子的双sgRNA，使之能特异性地降低新冠病毒受体ACE2的表达，为治疗新冠提供了另一种具有可能性的技术手段和临床思路。因此，本发明在创新性和实用性上都具有一定的科研价值和实际意义。

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。若未特别指明，实施例中所用的材料、生物化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员熟知常规手段。

实施例1筛选合适的sgRNA靶序列片段

1.1挑选sgRNA靶位点

根据NCBI网站上给出的人源基因ACE2基因组启动子序列，选择多个靶位点进行测试，以下仅记载其中部分靶位点的测试情况。测试序列如下：

sg1：5`-ATGACTACTCTCCACTCCAC-3`(SEQ ID NO 1)；

sg2：5`-TGCCCAAGTAGAGAGTTTCT-3`(SEQ ID NO 6)；

sg3：5`-AGTTTTGAATAGGTAAGTGA-3`(SEQ ID NO 7)；

sg4：5`-GGCAAAGTCATGTATTTGGA-3`(SEQ ID NO 2)。

1.2sgRNA靶位点筛选

使用gRNA活性荧光检测试剂盒(购买自北京合生基因，货号HS-SR-0001A)，按照产品说明书操作步骤构建检测载体，并进行细胞实验。实验结果如图1所示(1号和4号靶点荧光比例较高，2号和3号靶点荧光比例较低)。对4条sgRNA转染后的荧光图进行了荧光强度分析，结果显示sgRNA1和sgRNA4平均荧光强度明显高于sgRNA2和sgRNA3的。根据使用的gRNA活性荧光检测试剂盒的检测原理，荧光比例越高，说明靶序列被切割的细胞比例越高(靶序列被Cas9蛋白切割，随后进行同源重组，细胞才会表达荧光)，因此靶序列越容易被Cas9蛋白切割。

根据实验筛选结果，本发明选择sgRNA1和sgRNA4用于后续实验。

实施例2构建CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP

2.1提取共表达载体原始质粒

使用质粒小提试剂盒(购买自康为世纪，货号CW0511C)，按照产品说明书的实验步骤小量提取原始质粒CRISPRoff-v2.1(购买自淼灵生物，货号P31178)。

2.2扩增puro-EGFP片段

设计引物，从常规载体中扩增puro-EGFP，大小为1408bp(片段序列见SEQ IDNO.3)。

扩增引物序列如下：

2.1-puro-EGFP-F:5`-AACGGCAGCAGCGGATCCATGACCGAGTACAAGCCC-3`(SEQ ID NO8)；

2.1-puro-EGFP-F:5`-CCATCCCTCCGCCACCGCCttacttgtacagctcgtcc-3`(SEQ IDNO 9)；

2.3重组

将2.2扩增获得的片段通过同源重组，连接到CRISPRoff-v2.1载体，获得载体CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP(载体图谱见图2)。

实施例3构建ACE2-CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP

3.1提取共表达载体原始质粒

使用质粒小提试剂盒(购买自康为世纪，货号CW0511C)，按照产品说明书的实验步骤小量提取质粒CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP。

3.2合成pgRNA片段

交合成公司合成pgNRA片段，序列838bp(片段序列见SEQ ID NO.4)。

3.3重组

将3.2合成获得的片段通过同源重组，连接到CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP载体，获得载体ACE2-CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP(载体图谱见图3，载体序列见SEQ ID NO.5)。

实施例4获得能降低新冠病毒受体ACE2表达的A549细胞株

4.1培养A549细胞

复苏并培养A549细胞。细胞培养基的配方如下表1所示：

表1.Huh-7细胞完全培养基成分表

4.2细胞转染

本发明采用汉恒生物的转染试剂(货号：HB-TRLF-1000)，按照产品说明书步骤进行转染。

转染后第三天(72小时后)，观察带绿色荧光的细胞比例，显微镜视野中，绿色荧光比例呈阳性的细胞越多，绿色荧光越强，标明转染效率越高，实验结果如图4所示。

4.3嘌呤霉素筛选阳性细胞

使用经4.2细胞转染后的细胞，在正常的A549细胞完全培养基(见表1)中加入嘌呤霉素，进行细胞筛选。本发明使用的嘌呤霉素筛选浓度为2μg/ml，筛选时间为3天。筛选3天后传代，并换成正常的A549细胞完全培养基，4天后收样用于后续检测。通过嘌呤霉素筛选，能富集到同时转染成功ACE2-CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP的细胞。实验结果如图5所示(命名为A549-1W)。

4.4阳性细胞持续培养与收样检测

为了检测本发明获得的表观遗传修饰的ACE2表达降低的A549细胞株中ACE2能较长时间维持表观遗传修饰的效果，将转染并筛选成功的A549持续培养1个月，并收样用于后续检测(细胞样本命名为A549-4W)。未转染ACE2-CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP的A549细胞用于对照(命名A549-con)。

实施例5QPCR验证ACE2基因表达降低的效果

5.1样品前期处理

向细胞样本中加入500μl Trizol。

5.2RNA提取

(1)向加有Trizol的1.5ml EP管中加入100μl氯仿，震荡混匀后，静置5min，在12000 rpm，4度离心10min。

(2)从离心机中取出1.5ml EP管，再将上层无色透明的水相层吸入到另一干净的1.5mlEP 管中。(样品会分为三层：下层有机相层，中间层和上层的水相层，RNA位于上层水相中。) 加入等体积的异丙醇，上下轻轻颠倒混匀之后，静置10min，再12000rpm，4度离心10min。

(3)离心之后可在EP管壁或管底看到胶状沉淀出现，沉淀就是要提取的RNA。小心弃去上清，不要将沉淀倒掉了。

(4)用1ml 75℅乙醇对RNA沉淀进行洗涤。然后于4℃7000rpm离心5分钟，将上清尽量去除干净。

(5)室温静置干燥，大约干燥5～10分钟即可。(不要真空离心干燥，过于干燥会导致 RNA的溶解性大大降低)。所有EP管中加入25μl的DEPC H2O，用枪头吹打几次，使 RNA充分溶解，-80℃保存。

(6)RNA浓度检测：使用核酸蛋白检测仪检测RNA浓度。

5.3RNA浓度及纯度测定：

5.4逆转录PCR

5.4.1.按以下组份分别配制逆转录反应液：

5.4.2cDNA立刻进行实验或者置于4℃保存。

5.5实时荧光定量PCR反应

1.反应体系的配置

2.反应条件设置：

扩增程序：

对于mRNA

熔解程序：

QPCR用到的检测ACE2的引物如下：(SEQ ID NO 10-13)

检测结果如图6所示。A549转染ACE2-CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP后，ACE2的基因表达显著降低。且4W的表达量比1W更低。说明A549转染ACE2-CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP后，ACE2能较长时间维持低表达的状态。

实施例6WB验证ACE2基因表达降低的效果

6.1蛋白提取

6.1.1样本的收集：用1ml生理盐水对离心下来的细胞进行洗涤，同时将其转移至1.5ml 的离心管中。

6.1.2按1ml裂解液加10μl PMSF(100mM)，摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。)

6.1.3根据细胞量的多少，每管细胞加100-500μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min。

6.1.44℃下12000rpm离心10min。离心后的上清分装转移至1.5ml的离心管中，用于蛋白定量检测。若不能及时定量蛋白浓度，请置于－80℃保存。

6.2蛋白定量及处理(BCA法)

6.2.1使用时将BCA试剂盒中SolutionA摇晃混匀，根据样品数量，按50体积SolutionA 加1体积Solution B(50:1)配置适量BCA工作液，充分混匀后即成淡绿色的工作液。BCA工作液室温24h内稳定。

6.2.2将标准品(1mg/ml BSA)按0、1、2、4、6、8、10μl的量分别加入96孔板中，再加入去离子水将所有标准品补足到10μl。

6.2.3加1μl的样品到96孔板中，加去离子水补足到10μl。

6.2.4各孔加入200μl BCA工作液，轻轻用移液器吹打混匀(注意不要产生气泡以免影响读数)，37℃孵育30min。

6.2.5冷却到室温后，用酶标仪测定A562的吸光度值。

6.2.6根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

6.2.7蛋白变性处理：蛋白溶液与5×loading buffer按照体积比4：1混匀(此时蛋白浓度变成实际检测浓度的0.8倍)，置于沸水中煮10min，冷却后进行SDS-PAGE电泳，或储存于 -80℃，避免反复冻融。

6.2.8蛋白浓度的计算公式

举例标曲为：Y＝aX+b(Y为OD值，X为测定浓度)

样品蛋白浓度＝[(Y-b)/a]×稀释倍数

6.3Western Blot

6.3.1配制分离胶和浓缩胶：根据目的蛋白分子量大小，配分离胶和浓缩胶；

6.3.2上样：计算含20μg蛋白的溶液体积，即为上样量。用1×loading buffer补至每个加样孔的总体积一致；

6.3.3电泳：浓缩胶电压为80V，40min，分离胶电压120V，30-50min。溴酚蓝跑至胶底即可终止电泳，进行转膜；

6.3.4转膜：恒压100V，0.45μm PVDF膜；

6.3.5封闭：将PVDF膜完全浸没在5％milk-PBST或5％BSA-PBST中，室温轻摇60min或4℃过夜；

6.3.6一抗孵育：用5％BSA-PBST稀释一抗，4℃孵育过夜；

6.3.7洗膜：次日取出PVDF膜，PBST洗膜5次，每次6min；

6.3.8二抗孵育：PBST稀释二抗，室温孵育60min；

6.3.9洗膜：PBST洗膜5次，每次6min；

6.3.10显影：ECLA和B液按体积1:1混合后均匀滴加在膜上，按需求设置曝光时间及曝光类型，开始曝光，曝光结束后保存图片并导出图片。

6.4图像分析

用图像分析软件Image J对图像进行灰度分析。

结果如图7所示：A549转染ACE2-CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP后，ACE2的蛋白表达显著降低。且4W的表达量比1W更低。说明A549转染ACE2-CRISPRoff-v2.1-puro-EGFP后，ACE2 能较长时间维持低表达的状态。

综上所述，本发明结合CRISPR/Cas9技术和表观遗传修饰技术，使用不具有断裂基因组 DNA的dCas9版本，结合转录抑制因子KRAB,能在不造成DNA断裂的前提下抑制基因的转录表达。为了将对基因突变造成的影响降至最低，本发明将ACE2的靶点选择在启动子区域，能更有效地避开CDS区，进一步减少对基因突变造成的影响。为了提高Weissman博士发表的CRISPRoff-v2.1的实用性，本发明将非常规使用的TagBFP替换成常规使用的EGFP，加上了筛选标记puRO，使得转染后的细胞能够进一步筛选以及适用于常规荧光显微镜观察。经过试验证实，使用本发明提供的可用于降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体的制备方法所获得的载体能有效转染A549细胞，并获得ACE2表达量显著降低的细胞株，用于后续研究。由于ACE2是新冠病毒的主要受体，低表达的ACE2预实着新冠病毒的低感染风险。因此，本发明获得的ACE2低表达细胞株具有一定的科研价值。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本专利的保护范围内。

本发明涉及的序列如下：

SEQ ID NO.1：5`-ATGACTACTCTCCACTCCAC-3`。

SEQ ID NO.2：5`-GGCAAAGTCATGTATTTGGA-3`。

SEQ ID NO.3：

ATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCG GGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCG GACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCC GAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGC CTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGAGTCTCGCCCGACC ACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGG TGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTC ACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCgaggg cagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctatggtgtctaagggcgaagagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctg gacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagct gcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgc ccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatc gagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaa gaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggcccc gtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgcc gggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa。

SEQ ID NO.4：

gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtg acgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgt ggaaaggacgaaacaccATGACTACTCTCCACTCCACGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTA AATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCCCGCTCTAGAG GTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTA GAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTAC CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGCAAAGT CATGTATTTGGAgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTTGTTT TAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCGACATTGATTATTGA。

SEQ ID NO.5：

GGTCGACATTGATTATTGAgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgta aacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccATGACTACTCTCCACTCCACGTTTAAGAGCTATGCTGGA AACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT TTTTTTCCCGCTCTAGAGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAG TACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAAT GGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGA CGAAACACCGGCAAAGTCATGTATTTGGAgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGT GCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGT CATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGAC CGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACT TTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCAT ATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATG ACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGA GCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTT TAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGNCGCGCGCCRGGSGGGGSGGGGSGGG GSGRGGGGSGGGGSGGGGSGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAA AGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGG AGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGC GCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGC CCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGC GGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGT GTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAA AGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCA ACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACG GGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGC GGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCT GTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCC TTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGG GCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGC CGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGG GCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCC TTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAA TTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGAACCATGACCAGGAATT TGACCCCCCAAAGGTTTACCCACCTGTGCCAGCTGAGAAGAGGAAGCCCATCCGCGTGCTGTCTCTC TTTGATGGGATTGCTACAGGGCTCCTGGTGCTGAAGGACCTGGGCATCCAAGTGGACCGCTACATTGC CTCCGAGGTGTGTGAGGACTCCATCACGGTGGGCATGGTGCGGCACCAGGGAAAGATCATGTACGTC GGGGACGTCCGCAGCGTCACACAGAAGCATATCCAGGAGTGGGGCCCATTCGACCTGGTGATTGGAG GCAGTCCCTGCAATGACCTCTCCATTGTCAACCCTGCCCGCAAGGGACTTTATGAGGGTACTGGCCGC CTCTTCTTTGAGTTCTACCGCCTCCTGCATGATGCGCGGCCCAAGGAGGGAGATGATCGCCCCTTCTT CTGGCTCTTTGAGAATGTGGTGGCCATGGGCGTTAGTGACAAGAGGGACATCTCGCGATTTCTTGAGT CTAACCCCGTGATGATTGACGCCAAAGAAGTGTCTGCTGCACACAGGGCCCGTTACTTCTGGGGTAA CCTTCCTGGCATGAACAGGCCTTTGGCATCCACTGTGAATGATAAGCTGGAGCTGCAAGAGTGTCTGG AGCACGGCAGAATAGCCAAGTTCAGCAAAGTGAGGACCATTACCACCAGGTCAAACTCTATAAAGCA GGGCAAAGACCAGCATTTCCCCGTCTTCATGAACGAGAAGGAGGACATCCTGTGGTGCACTGAAATG GAAAGGGTGTTTGGCTTCCCCGTCCACTACACAGACGTCTCCAACATGAGCCGCTTGGCGAGGCAGA GACTGCTGGGCCGATCGTGGAGCGTGCCGGTCATCCGCCACCTCTTCGCTCCGCTGAAGGAATATTTT GCTTGTGTGTCTAGCGGCAATAGTAACGCTAACAGCCGCGGGCCGAGCTTCAGCAGCGGCCTGGTGC CGTTAAGCTTGCGCGGCAGCCATATGGGCCCTATGGAGATATACAAGACAGTGTCTGCATGGAAGAGA CAGCCAGTGCGGGTACTGAGCCTCTTCAGAAACATCGACAAGGTACTAAAGAGTTTGGGCTTCTTGG AAAGCGGTTCTGGTTCTGGGGGAGGAACGCTGAAGTACGTGGAAGATGTCACAAATGTCGTGAGGA GAGACGTGGAGAAATGGGGCCCCTTTGACCTGGTGTACGGCTCGACGCAGCCCCTAGGCAGCTCTTG TGATCGCTGTCCCGGCTGGTACATGTTCCAGTTCCACCGGATCCTGCAGTATGCGCTGCCTCGCCAGG AGAGTCAGCGGCCCTTCTTCTGGATATTCATGGACAATCTGCTGCTGACTGAGGATGACCAAGAGACA ACTACCCGCTTCCTTCAGACAGAGGCTGTGACCCTCCAGGATGTCCGTGGCAGAGACTACCAGAATG CTATGCGGGTGTGGAGCAACATTCCAGGGCTGAAGAGCAAGCATGCGCCCCTGACCCCAAAGGAAGAAGAGTATCTGCAAGCCCAAGTCAGAAGCAGGAGCAAGCTGGACGCCCCGAAAGTTGACCTCCTGG TGAAGAACTGCCTTCTCCCGCTGAGAGAGTACTTCAAGTATTTTTCTCAAAACTCACTTCCTCTTGGA GGGCCGAGCTCTGGCGCACCCCCACCAAGTGGAGGGTCTCCTGCCGGGTCCCCAACATCTACTGAAG AAGGCACCAGCGAATCCGCAACGCCCGAGTCAGGCCCTGGTACCTCCACAGAACCATCTGAAGGTAG TGCGCCTGGTTCCCCAGCTGGAAGCCCTACTTCCACCGAAGAAGGCACGTCAACCGAACCAAGTGA AGGATCTGCCCCTGGGACCAGCACTGAACCATCTGAGATGGACAAGAAGTATTCTATCGGACTGGCCA TCGGGACTAATAGCGTCGGGTGGGCCGTGATCACTGACGAGTACAAGGTGCCCTCTAAGAAGTTCAA GGTGCTCGGGAACACCGACCGGCATTCCATCAAGAAAAATCTGATCGGAGCTCTCCTCTTTGATTCAG GGGAGACCGCTGAAGCAACCCGCCTCAAGCGGACTGCTAGACGGCGGTACACCAGGAGGAAGAACC GGATTTGTTACCTTCAAGAGATATTCTCCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCATAGG CTGGAAGAATCATTCCTCGTGGAAGAGGATAAGAAGCATGAACGGCATCCCATCTTCGGTAATATCGT CGACGAGGTGGCCTATCACGAGAAATACCCAACCATCTACCATCTTCGCAAAAAGCTGGTGGACTCA ACCGACAAGGCAGACCTCCGGCTTATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCAGAGGCCACTT CCTGATCGAGGGCGACCTCAATCCTGACAATAGCGATGTGGATAAACTGTTCATCCAGCTGGTGCAGA CTTACAACCAGCTCTTTGAAGAGAACCCCATCAATGCAAGCGGAGTCGATGCCAAGGCCATTCTGTC AGCCCGGCTGTCAAAGAGCCGCAGACTTGAGAATCTTATCGCTCAGCTGCCGGGTGAAAAGAAAAAT GGACTGTTCGGGAACCTGATTGCTCTTTCACTTGGGCTGACTCCCAATTTCAAGTCTAATTTCGACCTG GCAGAGGATGCCAAGCTGCAACTGTCCAAGGACACCTATGATGACGATCTCGACAACCTCCTGGCCC AGATCGGTGACCAATACGCCGACCTTTTCCTTGCTGCTAAGAATCTTTCTGACGCCATCCTGCTGTCTG ACATTCTCCGCGTGAACACTGAAATCACCAAGGCCCCTCTTTCAGCTTCAATGATTAAGCGGTATGATGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTTAAGGCACTCGTCCGGCAGCAGCTTCCGGAGAAGTACAAG GAAATCTTCTTTGACCAGTCAAAGAATGGATACGCCGGCTACATCGACGGAGGTGCCTCCCAAGAGG AATTTTATAAGTTTATCAAACCTATCCTTGAGAAGATGGACGGCACCGAAGAGCTCCTCGTGAAACTG AATCGGGAGGATCTGCTGCGGAAGCAGCGCACTTTCGACAATGGGAGCATTCCCCACCAGATCCATC TTGGGGAGCTTCACGCCATCCTTCGGCGCCAAGAGGACTTCTACCCCTTTCTTAAGGACAACAGGGA GAAGATTGAGAAAATTCTCACTTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGACCCCTCGCCAGAGGAAATAGCC GGTTTGCTTGGATGACCAGAAAGTCAGAAGAAACTATCACTCCCTGGAACTTCGAAGAGGTGGTGGA CAAGGGAGCCAGCGCTCAGTCATTCATCGAACGGATGACTAACTTCGATAAGAACCTCCCCAATGAG AAGGTCCTGCCGAAACATTCCCTGCTCTACGAGTACTTTACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGA AATATGTCACCGAAGGGATGAGGAAGCCCGCATTCCTGTCAGGCGAACAAAAGAAGGCAATTGTGGA CCTTCTGTTCAAGACCAATAGAAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTATTTCAAGAAAATT GAATGCTTCGACTCTGTGGAGATTAGCGGGGTCGAAGATCGGTTCAACGCAAGCCTGGGTACCTACCA TGATCTGCTTAAGATCATCAAGGACAAGGATTTTCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACATCCTTGAG GACATTGTCCTGACTCTCACTCTGTTCGAGGACCGGGAAATGATCGAGGAGAGGCTTAAGACCTACG CCCATCTGTTCGACGATAAAGTGATGAAGCAACTTAAACGGAGAAGATATACCGGATGGGGACGCCTT AGCCGCAAACTCATCAACGGAATCCGGGACAAACAGAGCGGAAAGACCATTCTTGATTTCCTTAAGA GCGACGGATTCGCTAATCGCAACTTCATGCAACTTATCCATGATGATTCCCTGACCTTTAAGGAGGACA TCCAGAAGGCCCAAGTGTCTGGACAAGGTGACTCACTGCACGAGCATATCGCAAATCTGGCTGGTTC ACCCGCTATTAAGAAGGGTATTCTCCAGACCGTGAAAGTCGTGGACGAGCTGGTCAAGGTGATGGGT CGCCATAAACCAGAGAACATTGTCATCGAGATGGCCAGGGAAAACCAGACTACCCAGAAGGGACAG AAGAACAGCAGGGAGCGGATGAAAAGAATTGAGGAAGGGATTAAGGAGCTCGGGTCACAGATCCTT AAAGAGCACCCGGTGGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTATCTGTACTACCTTCAAAATG GACGCGATATGTATGTGGACCAAGAGCTTGATATCAACAGGCTCTCAGACTACGACGTGGACGCCATC GTCCCTCAGAGCTTCCTCAAAGACGACTCAATTGACAATAAGGTGCTGACTCGCTCAGACAAGAACC GGGGAAAGTCAGATAACGTGCCCTCAGAGGAAGTCGTGAAAAAGATGAAGAACTATTGGCGCCAGC TTCTGAACGCAAAGCTGATCACTCAGCGGAAGTTCGACAATCTCACTAAGGCTGAGAGGGGCGGACT GAGCGAACTGGACAAAGCAGGATTCATTAAACGGCAACTTGTGGAGACTCGGCAGATTACTAAACAT GTCGCCCAAATCCTTGACTCACGCATGAATACCAAGTACGACGAAAACGACAAACTTATCCGCGAGG TGAAGGTGATTACCCTGAAGTCCAAGCTGGTCAGCGATTTCAGAAAGGACTTTCAATTCTACAAAGT GCGGGAGATCAATAACTATCATCATGCTCATGACGCATATCTGAATGCCGTGGTGGGAACCGCCCTGAT CAAGAAGTACCCAAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTGCGCAA GATGATTGCCAAATCTGAGCAGGAGATCGGAAAGGCCACCGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATC ATGAATTTCTTCAAGACCGAAATCACCCTTGCAAACGGTGAGATCCGGAAGAGGCCGCTCATCGAGA CTAATGGGGAGACTGGCGAAATCGTGTGGGACAAGGGCAGAGATTTCGCTACCGTGCGCAAAGTGCT TTCTATGCCTCAAGTGAACATCGTGAAGAAAACCGAGGTGCAAACCGGAGGCTTTTCTAAGGAATCA ATCCTCCCCAAGCGCAACTCCGACAAGCTCATTGCAAGGAAGAAGGATTGGGACCCTAAGAAGTACG GCGGATTCGATTCACCAACTGTGGCTTATTCTGTCCTGGTCGTGGCTAAGGTGGAAAAAGGAAAGTCT AAGAAGCTCAAGAGCGTGAAGGAACTGCTGGGTATCACCATTATGGAGCGCAGCTCCTTCGAGAAGA ACCCAATTGACTTTCTCGAAGCCAAAGGTTACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTTATCATCAAGCTCCC AAAGTATAGCCTGTTCGAACTGGAGAATGGGCGGAAGCGGATGCTCGCCTCCGCTGGCGAACTTCAG AAGGGTAATGAGCTGGCTCTCCCCTCCAAGTACGTGAATTTCCTCTACCTTGCAAGCCATTACGAGAA GCTGAAGGGGAGCCCCGAGGACAACGAGCAAAAGCAACTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATCT GGACGAGATCATTGAGCAGATTTCCGAGTTTTCTAAACGCGTCATTCTCGCTGATGCCAACCTCGATA AAGTCCTTAGCGCATACAATAAGCACAGAGACAAACCAATTCGGGAGCAGGCTGAGAATATCATCCA CCTGTTCACCCTCACCAATCTTGGTGCCCCTGCCGCATTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGA AACGCTATACCTCCACCAAAGAAGTGCTGGACGCCACCCTCATCCACCAGAGCATCACCGGACTTTAC GAAACTCGGATTGACCTCTCACAGCTCGGAGGGGATGCCTATCCCTATGACGTGCCCGATTATGCCAG CCTGGGCAGCGGCTCCCCCAAGAAAAAACGCAAGGTGGAAGATCCTAAGAAAAAGCGGAAAGTGG ACGGCATTGGTAGTGGGAGCAACGGCAGCAGCGGATCCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCT CGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCC ACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCA CGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGA CCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGA GCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGC CCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGAGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCG TCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGC CCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcc cggccctatggtgtctaagggcgaagagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcga gggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacgg cgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacg acggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctg gggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgag gacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccct gagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaGGCGG TGGCGGAGGGATGGATGCTAAGTCACTAACTGCCTGGTCCCGGACACTGGTGACCTTCAAGGATGTAT TTGTGGACTTCACCAGGGAGGAGTGGAAGCTGCTGGACACTGCTCAGCAGATCGTGTACAGAAATGT GATGCTGGAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCAGCTTACTAAGCCAGATGTGATCCTCCG GTTGGAGAAGGGAGAAGAGCCCTAGTAAGCGGCCGCACTCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAG GTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAA TTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGC AATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACA TCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTG GCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTT GACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTA TGGAGATCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATT GTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAA TGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTG CCAGCGGATCCGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTA ACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAG GCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAA AAAGCTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAAT AAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGA TCCGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTT CCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGC GGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAA AAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGC ATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTT TCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTT TCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGT TCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACT ATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATT AGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTA GAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCT TGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCA GAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAA ATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGT GAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATA ACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACC GGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACT TTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGT TTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTC AGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTC CTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACT GCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTC ATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGC CACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGAT CTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTAC TTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGC GACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGT CTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCC CGAAAAGTGCCACCTG。

SEQ ID NO.6：5`-TGCCCAAGTAGAGAGTTTCT-3`。

SEQ ID NO.7：5`-AGTTTTGAATAGGTAAGTGA-3`。

SEQ ID NO.8:5`-AACGGCAGCAGCGGATCCATGACCGAGTACAAGCCC-3`。

SEQ ID NO.9:5`-CCATCCCTCCGCCACCGCCttacttgtacagctcgtcc-3`。

SEQ ID NO.10:CTGACTTCAACAGCGACACC。

SEQ ID NO.11:GTGGTCCAGGGGTCTTACTC。

SEQ ID NO.12:ggtggaccaggcctgggat。

SEQ ID NO.13:cctgggtccgttagcatgg。

序列表

<110> 湖南丰晖生物科技有限公司

<120> 一种降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传载体

<141> 2022-06-24

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgactactc tccactccac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggcaaagtca tgtatttgga 20

<210> 3

<211> 1371

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta 60

cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac 120

cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac 180

atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag 240

agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt 300

tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag 360

cccgcgtggt tcctggccac cgtcggagtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc 420

agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg 480

gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc 540

gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgccgag 600

ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac gtggaggaga atcccggccc tatggtgtct 660

aagggcgaag agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta 720

aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg 780

accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc 840

accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac 900

ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac 960

gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc 1020

atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag 1080

tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag 1140

gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac 1200

cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc 1260

acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag 1320

ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta a 1371

<210> 4

<211> 838

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacacca tgactactct ccactccacg tttaagagct atgctggaaa cagcatagca 300

agtttaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt 360

ttcccgctct agaggtacca aggtcgggca ggaagagggc ctatttccca tgattccttc 420

atatttgcat atacgataca aggctgttag agagataatt agaattaatt tgactgtaaa 480

cacaaagata ttagtacaaa atacgtgacg tagaaagtaa taatttcttg ggtagtttgc 540

agttttaaaa ttatgtttta aaatggacta tcatatgctt accgtaactt gaaagtattt 600

cgatttcttg gctttatata tcttgtggaa aggacgaaac accggcaaag tcatgtattt 660

ggagttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa 720

agtggcaccg agtcggtgct tttttgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 780

tagtccgttt ttagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggcgacattg attattga 838

<210> 5

<211> 13398

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ggtcgacatt gattattgag agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg 60

atacaaggct gttagagaga taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt 120

acaaaatacg tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg 180

ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt 240

atatatcttg tggaaaggac gaaacaccat gactactctc cactccacgt ttaagagcta 300

tgctggaaac agcatagcaa gtttaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg 360

caccgagtcg gtgctttttt tcccgctcta gaggtaccaa ggtcgggcag gaagagggcc 420

tatttcccat gattccttca tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga gagataatta 480

gaattaattt gactgtaaac acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat 540

aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat tatgttttaa aatggactat catatgctta 600

ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca 660

ccggcaaagt catgtatttg gagttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag 720

tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt ttttgtttta gagctagaaa 780

tagcaagtta aaataaggct agtccgtttt tagcgcgtgc gccaattctg cagacaaatg 840

gcgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 900

cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 960

caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 1020

gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 1080

tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 1140

ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 1200

attagtcatc gctattacca tggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat 1260

ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc 1320

gatgggggcg gggggggggg gggncgcgcg ccrggsgggg sggggsgggg sgrggggsgg 1380

ggsggggsga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt 1440

ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 1500

ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 1560

ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 1620

ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 1680

agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc 1740

gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc 1800

tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg 1860

ggcggtgccc cgcggtgcgg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg 1920

tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac 1980

ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt 2040

ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg 2100

gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc 2160

ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg 2220

cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc 2280

ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag 2340

ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg 2400

cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg 2460

accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc 2520

ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct catcattttg gcaaagaatt ctgcagtcga 2580

cggtaccgcg ggcccgggat ccaccggtcg ccaccatgaa ccatgaccag gaatttgacc 2640

ccccaaaggt ttacccacct gtgccagctg agaagaggaa gcccatccgc gtgctgtctc 2700

tctttgatgg gattgctaca gggctcctgg tgctgaagga cctgggcatc caagtggacc 2760

gctacattgc ctccgaggtg tgtgaggact ccatcacggt gggcatggtg cggcaccagg 2820

gaaagatcat gtacgtcggg gacgtccgca gcgtcacaca gaagcatatc caggagtggg 2880

gcccattcga cctggtgatt ggaggcagtc cctgcaatga cctctccatt gtcaaccctg 2940

cccgcaaggg actttatgag ggtactggcc gcctcttctt tgagttctac cgcctcctgc 3000

atgatgcgcg gcccaaggag ggagatgatc gccccttctt ctggctcttt gagaatgtgg 3060

tggccatggg cgttagtgac aagagggaca tctcgcgatt tcttgagtct aaccccgtga 3120

tgattgacgc caaagaagtg tctgctgcac acagggcccg ttacttctgg ggtaaccttc 3180

ctggcatgaa caggcctttg gcatccactg tgaatgataa gctggagctg caagagtgtc 3240

tggagcacgg cagaatagcc aagttcagca aagtgaggac cattaccacc aggtcaaact 3300

ctataaagca gggcaaagac cagcatttcc ccgtcttcat gaacgagaag gaggacatcc 3360

tgtggtgcac tgaaatggaa agggtgtttg gcttccccgt ccactacaca gacgtctcca 3420

acatgagccg cttggcgagg cagagactgc tgggccgatc gtggagcgtg ccggtcatcc 3480

gccacctctt cgctccgctg aaggaatatt ttgcttgtgt gtctagcggc aatagtaacg 3540

ctaacagccg cgggccgagc ttcagcagcg gcctggtgcc gttaagcttg cgcggcagcc 3600

atatgggccc tatggagata tacaagacag tgtctgcatg gaagagacag ccagtgcggg 3660

tactgagcct cttcagaaac atcgacaagg tactaaagag tttgggcttc ttggaaagcg 3720

gttctggttc tgggggagga acgctgaagt acgtggaaga tgtcacaaat gtcgtgagga 3780

gagacgtgga gaaatggggc ccctttgacc tggtgtacgg ctcgacgcag cccctaggca 3840

gctcttgtga tcgctgtccc ggctggtaca tgttccagtt ccaccggatc ctgcagtatg 3900

cgctgcctcg ccaggagagt cagcggccct tcttctggat attcatggac aatctgctgc 3960

tgactgagga tgaccaagag acaactaccc gcttccttca gacagaggct gtgaccctcc 4020

aggatgtccg tggcagagac taccagaatg ctatgcgggt gtggagcaac attccagggc 4080

tgaagagcaa gcatgcgccc ctgaccccaa aggaagaaga gtatctgcaa gcccaagtca 4140

gaagcaggag caagctggac gccccgaaag ttgacctcct ggtgaagaac tgccttctcc 4200

cgctgagaga gtacttcaag tatttttctc aaaactcact tcctcttgga gggccgagct 4260

ctggcgcacc cccaccaagt ggagggtctc ctgccgggtc cccaacatct actgaagaag 4320

gcaccagcga atccgcaacg cccgagtcag gccctggtac ctccacagaa ccatctgaag 4380

gtagtgcgcc tggttcccca gctggaagcc ctacttccac cgaagaaggc acgtcaaccg 4440

aaccaagtga aggatctgcc cctgggacca gcactgaacc atctgagatg gacaagaagt 4500

attctatcgg actggccatc gggactaata gcgtcgggtg ggccgtgatc actgacgagt 4560

acaaggtgcc ctctaagaag ttcaaggtgc tcgggaacac cgaccggcat tccatcaaga 4620

aaaatctgat cggagctctc ctctttgatt caggggagac cgctgaagca acccgcctca 4680

agcggactgc tagacggcgg tacaccagga ggaagaaccg gatttgttac cttcaagaga 4740

tattctccaa cgaaatggca aaggtcgacg acagcttctt ccataggctg gaagaatcat 4800

tcctcgtgga agaggataag aagcatgaac ggcatcccat cttcggtaat atcgtcgacg 4860

aggtggccta tcacgagaaa tacccaacca tctaccatct tcgcaaaaag ctggtggact 4920

caaccgacaa ggcagacctc cggcttatct acctggccct ggcccacatg atcaagttca 4980

gaggccactt cctgatcgag ggcgacctca atcctgacaa tagcgatgtg gataaactgt 5040

tcatccagct ggtgcagact tacaaccagc tctttgaaga gaaccccatc aatgcaagcg 5100

gagtcgatgc caaggccatt ctgtcagccc ggctgtcaaa gagccgcaga cttgagaatc 5160

ttatcgctca gctgccgggt gaaaagaaaa atggactgtt cgggaacctg attgctcttt 5220

cacttgggct gactcccaat ttcaagtcta atttcgacct ggcagaggat gccaagctgc 5280

aactgtccaa ggacacctat gatgacgatc tcgacaacct cctggcccag atcggtgacc 5340

aatacgccga ccttttcctt gctgctaaga atctttctga cgccatcctg ctgtctgaca 5400

ttctccgcgt gaacactgaa atcaccaagg cccctctttc agcttcaatg attaagcggt 5460

atgatgagca ccaccaggac ctgaccctgc ttaaggcact cgtccggcag cagcttccgg 5520

agaagtacaa ggaaatcttc tttgaccagt caaagaatgg atacgccggc tacatcgacg 5580

gaggtgcctc ccaagaggaa ttttataagt ttatcaaacc tatccttgag aagatggacg 5640

gcaccgaaga gctcctcgtg aaactgaatc gggaggatct gctgcggaag cagcgcactt 5700

tcgacaatgg gagcattccc caccagatcc atcttgggga gcttcacgcc atccttcggc 5760

gccaagagga cttctacccc tttcttaagg acaacaggga gaagattgag aaaattctca 5820

ctttccgcat cccctactac gtgggacccc tcgccagagg aaatagccgg tttgcttgga 5880

tgaccagaaa gtcagaagaa actatcactc cctggaactt cgaagaggtg gtggacaagg 5940

gagccagcgc tcagtcattc atcgaacgga tgactaactt cgataagaac ctccccaatg 6000

agaaggtcct gccgaaacat tccctgctct acgagtactt taccgtgtac aacgagctga 6060

ccaaggtgaa atatgtcacc gaagggatga ggaagcccgc attcctgtca ggcgaacaaa 6120

agaaggcaat tgtggacctt ctgttcaaga ccaatagaaa ggtgaccgtg aagcagctga 6180

aggaggacta tttcaagaaa attgaatgct tcgactctgt ggagattagc ggggtcgaag 6240

atcggttcaa cgcaagcctg ggtacctacc atgatctgct taagatcatc aaggacaagg 6300

attttctgga caatgaggag aacgaggaca tccttgagga cattgtcctg actctcactc 6360

tgttcgagga ccgggaaatg atcgaggaga ggcttaagac ctacgcccat ctgttcgacg 6420

ataaagtgat gaagcaactt aaacggagaa gatataccgg atggggacgc cttagccgca 6480

aactcatcaa cggaatccgg gacaaacaga gcggaaagac cattcttgat ttccttaaga 6540

gcgacggatt cgctaatcgc aacttcatgc aacttatcca tgatgattcc ctgaccttta 6600

aggaggacat ccagaaggcc caagtgtctg gacaaggtga ctcactgcac gagcatatcg 6660

caaatctggc tggttcaccc gctattaaga agggtattct ccagaccgtg aaagtcgtgg 6720

acgagctggt caaggtgatg ggtcgccata aaccagagaa cattgtcatc gagatggcca 6780

gggaaaacca gactacccag aagggacaga agaacagcag ggagcggatg aaaagaattg 6840

aggaagggat taaggagctc gggtcacaga tccttaaaga gcacccggtg gaaaacaccc 6900

agcttcagaa tgagaagctc tatctgtact accttcaaaa tggacgcgat atgtatgtgg 6960

accaagagct tgatatcaac aggctctcag actacgacgt ggacgccatc gtccctcaga 7020

gcttcctcaa agacgactca attgacaata aggtgctgac tcgctcagac aagaaccggg 7080

gaaagtcaga taacgtgccc tcagaggaag tcgtgaaaaa gatgaagaac tattggcgcc 7140

agcttctgaa cgcaaagctg atcactcagc ggaagttcga caatctcact aaggctgaga 7200

ggggcggact gagcgaactg gacaaagcag gattcattaa acggcaactt gtggagactc 7260

ggcagattac taaacatgtc gcccaaatcc ttgactcacg catgaatacc aagtacgacg 7320

aaaacgacaa acttatccgc gaggtgaagg tgattaccct gaagtccaag ctggtcagcg 7380

atttcagaaa ggactttcaa ttctacaaag tgcgggagat caataactat catcatgctc 7440

atgacgcata tctgaatgcc gtggtgggaa ccgccctgat caagaagtac ccaaagctgg 7500

aaagcgagtt cgtgtacgga gactacaagg tctacgacgt gcgcaagatg attgccaaat 7560

ctgagcagga gatcggaaag gccaccgcaa agtacttctt ctacagcaac atcatgaatt 7620

tcttcaagac cgaaatcacc cttgcaaacg gtgagatccg gaagaggccg ctcatcgaga 7680

ctaatgggga gactggcgaa atcgtgtggg acaagggcag agatttcgct accgtgcgca 7740

aagtgctttc tatgcctcaa gtgaacatcg tgaagaaaac cgaggtgcaa accggaggct 7800

tttctaagga atcaatcctc cccaagcgca actccgacaa gctcattgca aggaagaagg 7860

attgggaccc taagaagtac ggcggattcg attcaccaac tgtggcttat tctgtcctgg 7920

tcgtggctaa ggtggaaaaa ggaaagtcta agaagctcaa gagcgtgaag gaactgctgg 7980

gtatcaccat tatggagcgc agctccttcg agaagaaccc aattgacttt ctcgaagcca 8040

aaggttacaa ggaagtcaag aaggacctta tcatcaagct cccaaagtat agcctgttcg 8100

aactggagaa tgggcggaag cggatgctcg cctccgctgg cgaacttcag aagggtaatg 8160

agctggctct cccctccaag tacgtgaatt tcctctacct tgcaagccat tacgagaagc 8220

tgaaggggag ccccgaggac aacgagcaaa agcaactgtt tgtggagcag cataagcatt 8280

atctggacga gatcattgag cagatttccg agttttctaa acgcgtcatt ctcgctgatg 8340

ccaacctcga taaagtcctt agcgcataca ataagcacag agacaaacca attcgggagc 8400

aggctgagaa tatcatccac ctgttcaccc tcaccaatct tggtgcccct gccgcattca 8460

agtacttcga caccaccatc gaccggaaac gctatacctc caccaaagaa gtgctggacg 8520

ccaccctcat ccaccagagc atcaccggac tttacgaaac tcggattgac ctctcacagc 8580

tcggagggga tgcctatccc tatgacgtgc ccgattatgc cagcctgggc agcggctccc 8640

ccaagaaaaa acgcaaggtg gaagatccta agaaaaagcg gaaagtggac ggcattggta 8700

gtgggagcaa cggcagcagc ggatccatga ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca 8760

cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg 8820

ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac 8880

tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg 8940

cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg 9000

gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc 9060

tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct ggccaccgtc ggagtctcgc 9120

ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg 9180

agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg 9240

agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt 9300

gcatgacccg caagcccggt gccgagggca gaggaagtct tctaacatgc ggtgacgtgg 9360

aggagaatcc cggccctatg gtgtctaagg gcgaagagct gttcaccggg gtggtgccca 9420

tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg 9480

agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc 9540

ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct 9600

accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc 9660

aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt 9720

tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg 9780

gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 9840

ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg 9900

gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 9960

tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga 10020

agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg 10080

acgagctgta caagtaaggc ggtggcggag ggatggatgc taagtcacta actgcctggt 10140

cccggacact ggtgaccttc aaggatgtat ttgtggactt caccagggag gagtggaagc 10200

tgctggacac tgctcagcag atcgtgtaca gaaatgtgat gctggagaac tataagaacc 10260

tggtttcctt gggttatcag cttactaagc cagatgtgat cctccggttg gagaagggag 10320

aagagcccta gtaagcggcc gcactcctca ggtgcaggct gcctatcaga aggtggtggc 10380

tggtgtggcc aatgccctgg ctcacaaata ccactgagat ctttttccct ctgccaaaaa 10440

ttatggggac atcatgaagc cccttgagca tctgacttct ggctaataaa ggaaatttat 10500

tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga catatgggag 10560

ggcaaatcat ttaaaacatc agaatgagta tttggtttag agtttggcaa catatgccca 10620

tatgctggct gccatgaaca aaggttggct ataaagaggt catcagtata tgaaacagcc 10680

ccctgctgtc cattccttat tccatagaaa agccttgact tgaggttaga ttttttttat 10740

attttgtttt gtgttatttt tttctttaac atccctaaaa ttttccttac atgttttact 10800

agccagattt ttcctcctct cctgactact cccagtcata gctgtccctc ttctcttatg 10860

gagatccctc gacctgcagc ccaagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 10920

gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 10980

cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 11040

tccagtcggg aaacctgtcg tgccagcgga tccgcatctc aattagtcag caaccatagt 11100

cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc 11160

ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct 11220

attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctaacttg 11280

tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa 11340

gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat 11400

gtctggatcc gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 11460

ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 11520

cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 11580

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 11640

tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 11700

agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 11760

tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 11820

cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 11880

ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 11940

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 12000

ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 12060

ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 12120

cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 12180

gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 12240

atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 12300

ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 12360

gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 12420

tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 12480

ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 12540

taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 12600

gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 12660

gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 12720

ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 12780

aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 12840

gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 12900

cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 12960

actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 13020

caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 13080

gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 13140

ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 13200

caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 13260

tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 13320

gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 13380

cccgaaaagt gccacctg 13398

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gtggagtgga gagtagtcat 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tgcccaagta gagagtttct 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

agttttgaat aggtaagtga 20

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

aacggcagca gcggatccat gaccgagtac aagccc 36

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

ccatccctcc gccaccgcct tacttgtaca gctcgtcc 38

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ctgacttcaa cagcgacacc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gtggtccagg ggtcttactc 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ggtggaccag gcctgggat 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

cctgggtccg ttagcatgg 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ctgacttcaa cagcgacacc 20

Claims (10)

1.一种降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体，其特征在于，将表观遗传基因编辑载体CRISPRoff-v2.1中的蓝色荧光蛋白TagBFP替换为绿色荧光蛋白EGFP的编码序列，并加上抗性基因编码序列；同时，该表观遗传修饰载体中含有能切割ACE2启动子基因组的sgRNA。

2.根据权利要求1所述的表观遗传修饰载体，其特征在于，所述的抗性基因是嘌呤霉素抗性基因puroR。

3.根据权利要求1所述的表观遗传修饰载体，其特征在于，所述的sgRNA的序列选自以下序列中一个或者多个：

sg1：5`-ATGACTACTCTCCACTCCAC-3`，

sg2：5`-TGCCCAAGTAGAGAGTTTCT-3`，

sg3：5`-AGTTTTGAATAGGTAAGTGA-3`，

sg4：5`-GGCAAAGTCATGTATTTGGA-3`；

将上述一个或者多个sgRNA串联成成对的形式插入CRISPRoff-v2.1中并将TagBFP替换为EGFP后得到的表观遗传基因编辑载体。

4.一种用于降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将表观遗传基因编辑载体CRISPRoff-v2.1中的蓝色荧光蛋白TagBFP替换为绿色荧光蛋白EGFP的编码序列；

在表观遗传基因编辑载体CRISPRoff-v2.1中加入抗性基因；

将能够切割ACE2启动子基因组的sgRNA加入表观遗传基因编辑载体CRISPRoff-v2.1中；

所述的sgRNA的序列选自以下序列中一个或者多个：

sg1：5`-ATGACTACTCTCCACTCCAC-3`，

sg2：5`-TGCCCAAGTAGAGAGTTTCT-3`，

sg3：5`-AGTTTTGAATAGGTAAGTGA-3`，

sg4：5`-GGCAAAGTCATGTATTTGGA-3`。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、设计能高效切割ACE2启动子基因组的两条sgRNA；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

S2、将表观遗传基因编辑载体CRISPRoff-v2.1中非常规使用的蓝色荧光蛋白TagBFP替换为常规的绿色荧光蛋白EGFP，并加上嘌呤霉素抗性基因puroR；

S3、将S1所述两条sgRNA串联成成对的形式插入S2构建的载体中。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，最终获得的用于降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体序列如SEQ ID NO.5所示。

7.一种细胞株，其特征在于，所述的细胞株含有权利要求1所述的降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求1所述的降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体。

9.权利要求1所述的表观遗传修饰载体的应用，其特征在于，所述的表观遗传修饰载体用于降低受体蛋白ACE2的表达量。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，使用权利要求1所述的表观遗传修饰载体制备降低新冠病毒受体ACE2表达量的细胞株，包括以下步骤：

(1)设计并验证能够高效切割ACE2启动子基因组的两条sgRNA；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

(2)将表观遗传基因编辑载体CRISPRoff-v2.1中非常规使用的蓝色荧光蛋白TagBFP替换为常规的绿色荧光蛋白EGFP，并加上嘌呤霉素抗性基因puroR；

(3)将步骤(1)所述两条sgRNA串联成成对的形式插入步骤(2)构建的载体中；

(4)将步骤(3)中获得的载体转染细胞系，通过嘌呤霉素筛选及绿色荧光蛋白EGFP筛选阳性细胞。

Images