CN106978432B - 敲除衣藻内源基因和表达外源基因的载体构建方法及应用 - Google Patents

敲除衣藻内源基因和表达外源基因的载体构建方法及应用 Download PDF

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    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease

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Abstract

本发明提出了一种敲除衣藻内源基因和表达外源基因的载体构建方法及应用，该载体包含一个潮霉素抗性标记基因，标记基因两端都有一个来自RubisCO基因的splicing donor序列(TCCATTTGCAG/GATGTTCGA)，三个串联重复的终止密码子，以及一个转录终止子。该载体用Spel Ⅰ和Cla Ⅰ双酶切后产生的1.9kb片段电击转化莱茵衣藻细胞，即使载体插入衣藻基因内含子中插入载体也成为mRNA一部分，基因转录在三个串联重复终止密码子和转录终止子处停止。与没有SIS的2.6kb AphVⅢ插入载体相比，新构建的载体提高了突变体转录终止效率。

Description

敲除衣藻内源基因和表达外源基因的载体构建方法及应用
技术领域
本发明涉及一种敲除衣藻内源基因和表达外源基因的载体构建方法及应用。
背景技术
莱茵衣藻是一种研究植物光合作用，鞭毛纤毛以及压力反应的模式生物，被称为“生物酵母”和生产抗体等药物的“生物工厂”。与其他模式生物一样，正向和反向遗传学技术都广泛应用于衣藻研究，最近的CRISPR/Cas9基因编辑技术由于效率太低并没有得到广泛应用。因此构建大规模的衣藻突变体库提供了一种获得衣藻特定基因突变体的方法。
将某一外源片段电转化衣藻细胞，外源片段会随机插入衣藻基因组中，通过分子生物学的方式可以筛选到插入目的基因的突变体或特定表型突变体。但是如果插入位点位于基因内含子，该基因的转录可能不受影响，进而不会影响基因表达。为了提高基因敲除效率和降低基因表达水平，我们构建了新的载体以提高其对插入基因的影响。
发明内容
本发明提出一种敲除衣藻内源基因和表达外源基因的载体构建方法及应用，该载体能够高效干扰插入基因的转录进而影响其功能。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种敲除衣藻内源基因和表达外源基因的载体构建方法，包括以下步骤：
S11、AphVⅡ基因克隆：从质粒pHyg3中克隆，有效片段包括β2-Tublin启动子，rbcS2 3′UTR，rbcS2基因的第一个内含子(rbcS2intron1)，AphVⅡ基因，其中rbcS2intron1位于AphVⅡ基因中；
S12、splicing donor的合成：包括正向splicing donor(FSD)和反向splicingdonor(RSD)；FSD由F-Spe-F,F-Spe-R,F-Hind-F,F-Hind-R四个引物退火合成，RSD由R-Nco-F,R-Nco-R,R-Cla-F,R-Cla-R四个引物退火合成；
每四个引物在一个反应体系中进行，反应体系包括：四个引物浓度为10μM，各1μl；Takara LA Taq，0.2μl；10xLA PCR buffer，2μl；ddH2O，13.8μl；退火程序如下：94℃5min，90℃5min，80℃10min，70℃10min，60℃10min，50℃10min，40℃10min，30℃10min；合成的双链DNA片段用2％的琼脂糖凝胶电泳分离，天根纯化试剂盒纯化，纯化后的FSD和RSD序列分别用SpeI/HindIII，NcoI/ClaI酶切；
S13、酶切后的FSD：RSD片段连接到AphVII的5′，3′端形成FSD::AphVII::RSD大片段，经1％琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，天根试剂盒纯化回收；
S14、pHK415载体的构建：pBluescript II KS质粒用SpeI/ClaI双酶切，FSD::AphVII::RSD片段连接到酶切后的pBluescript II KS上形成pHK415质粒载体；
S15、pHK415载体验证：pHK415质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，提取阳性质粒，用SpeI/ClaI双酶切，经经1％琼脂糖凝胶电泳分离1.9kb目的片段，天根试剂盒纯化回收后测序验证。
该载体经SpeI/ClaI双酶切后电转化莱茵衣藻细胞，与AphVⅢ插入载体相比可以提高衣藻基因转录终止效率，高效敲除衣藻内源基因。
本发明产生的有益效果为：质粒pHK415经SpeI/ClaI双酶切后产生的1.9kb片段与没有SIS片段的AphVⅢ载体片段电转化莱茵衣藻细胞，在相同条件下相比，产生了两倍的鞭毛运动缺失突变体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pHK415载体图。
图2为pHK415经SpeI/ClaI双酶切后回收的1.9kb有效片段。
图3为AphVⅢ插入载体。
图4为两个载体电转化莱茵衣藻细胞产生的鞭毛运动缺失突变体对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
两种电转载体转化效率的比较
试剂准备：
20％淀粉：50ml离心管中称取4g淀粉，无水乙醇清洗一次，1000rpm/min离心2min。倒掉上清，超纯水清洗两次，离心。70％乙醇重悬定容到20ml。室温放置。
淀粉工作液：上述20％的淀粉颠倒混匀，1000rpm/min离心1min，TAP+60mMSorbitol洗4次，1000rpm/min离心1min，重悬到相应体积的TAP+60mM Sorbitol+0.4％PEG6000
10XTAP+60mM Sorbitol：称取10.95g D-Sorbitol，加到未灭菌的100ml TAPmedium中，在超净台用0.22μm滤膜过滤除菌即为10XTAP+60mM Sorbitol储液，每次使用时用TAP稀释。
10μg/ml潮霉素抗性平板和巴龙霉素抗性平板。
插入载体片段：
载体pMJ013b(5μg)，30μl；MlyⅠ(NEB)，2μl；10x CutSmart Buffer，5μl；ddH2O，13μl，37℃水浴1h。
载体pHK415(5μg)，5μl；SpeI，1.25μl；ClaI，1.25μl；10x Buffer，5μl；ddH2O，37.5μl，37℃水浴1h。
pMJ013b和pHK415的酶切片段用0.8％琼脂糖凝胶分离酶切产物，各自回收2.6kb和1.9kb的单一片段。
操作步骤
HS211藻细胞摇瓶培养：200ml液体TAP培养藻株HS211至约6x106cell/ml。
收集细胞：于50ml灭菌离心管中2500rpm/min，3min。去上清，加入一定体积的TAP+60mM Sorbitol，使细胞终浓度为2x108cell/ml。
电击：每个电击杯加入250μl上述衣藻细胞和30ng载体DNA，其他条件一致开始电击。
过夜恢复：将电击后的细胞转移到预先加入10ml(TAP+60mM Soritol)的50ml灭菌离心管中，封口，摇床上60rpm/min慢摇，弱光过夜恢复14h。
涂板，倒置培养：离心管2500rpm/min离心3min，少量TAP重悬。每个抗性平板表面加1ml 20％淀粉和相应体积的藻液。轻轻摇匀，使细胞和淀粉均匀铺满平板。在超净台避光吹干平板上的液体，封口，倒置光周期培养4-6天。
挑取单克隆：按照无菌操作要求对超净台灭菌，将需要挑取的单克隆，提前分装好的装有TAP液体培养基的96孔板，灭菌牙签，9cm TAP固体平板都拿进操作台。
点燃酒精灯，用牙签依次将克隆划线到9cm平板，划线后将有克隆的一头插入96孔对应空位，轻轻涮洗后丢入回收牙签器皿内。全部转接结束后，用封口膜将TAP平板和96孔板封口，藻房光下培养。
Motility表型观察：挑进96孔板的藻株在藻房培养1-2天后达到最佳生长状态，利用Nikon SMZ1500显微镜初步观察。
打开显微镜防尘罩，打开显微镜底座最右边的光源开关。
将显微镜左上角的显微倍数调节至1，观察载物台上的96孔板(切勿打开板盖)，找到第一个孔。
将显微镜的放大倍数调节至5-6倍，观察孔内的藻株游动情况，并利用手迅速移动96孔板至下一个孔。平均每个96孔板有1-2个孔内看不到游动的藻细胞。用黑色Marker笔在孔板盖子对应位置做好标记。
观察完后关闭光源，盖好防尘罩。
用Nikon ECLISE Ti荧光显微镜进一步观察标记不动突变株。
打开显微镜开关，在10倍放大倍数下(Dic)寻找已标记的阳性孔。
调节光源及粗细螺旋焦距使视野清晰，观察藻株游动状况，做好标记。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院水生生物研究所 武汉净宇微藻科技有限公司
<120> 敲除衣藻内源基因和表达外源基因的载体构建方法及应用
<130> 2017
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 4792
<212> DNA
<213> pHK415质粒载体
<400> 1
cacctaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag 60
ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 120
cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 180
ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc 240
accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg 300
gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa 360
gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac 420
caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tcccattcgc cattcaggct 480
gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 540
agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 600
ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660
ccgcggtggc ggccgctcta gaactagttc catttgcagg atgttcgata attagctgat 720
aaaaagcgga ggagttttgc aattttgttg gttgtaacga tctgtcgcca acggtgagct 780
tgaagcttct ttcttgcgct atgacacttc cagcaaaagg tagggcgggc tgcgagacgg 840
cttcccggcg ctgcatgcaa caccgatgat gcttcgaccc cccgaagctc cttcggggct 900
gcatgggcgc tccgatgccg ctccagggcg agcgctgttt aaatagccag gcccccgatt 960
gcaaagacat tatagcgagc taccaaagcc atattcaaac acctagatca ctaccacttc 1020
tacacaggcc actcgagctt gtgatcgcac tccgctaagg gggcgcctct tcctcttcgt 1080
ttcagtcaca acccgcaaac atgacacaag aatccctgtt acttctcgac cgtattgatt 1140
cggatgattc ctacgcgagc ctgcggaacg accaggaatt ctgggaggtg agtcgacgag 1200
caagcccggc ggatcaggca gcgtgcttgc agatttgact tgcaacgccc gcattgtgtc 1260
gacgaaggct tttggctcct ctgtcgctgt ctcaagcagc atctaaccct gcgtcgccgt 1320
ttccatttgc agccgctggc ccgccgagcc ctggaggagc tcgggctgcc ggtgccgccg 1380
gtgctgcggg tgcccggcga gagcaccaac cccgtactgg tcggcgagcc cggcccggtg 1440
atcaagctgt tcggcgagca ctggtgcggt ccggagagcc tcgcgtcgga gtcggaggcg 1500
tacgcggtcc tggcggacgc cccggtgccg gtgccccgcc tcctcggccg cggcgagctg 1560
cggcccggca ccggagcctg gccgtggccc tacctggtga tgagccggat gaccggcacc 1620
acctggcggt ccgcgatgga cggcacgacc gaccggaacg cgctgctcgc cctggcccgc 1680
gaactcggcc gggtgctcgg ccggctgcac agggtgccgc tgaccgggaa caccgtgctc 1740
accccccatt ccgaggtctt cccggaactg ctgcgggaac gccgcgcggc gaccgtcgag 1800
gaccaccgcg ggtggggcta cctctcgccc cggctgctgg accgcctgga ggactggctg 1860
ccggacgtgg acacgctgct ggccggccgc gaaccccggt tcgtccacgg cgacctgcac 1920
gggaccaaca tcttcgtgga cctggccgcg accgacctca ccgggatcgt cgacttcacc 1980
gacgtctatg cgggagactc ccgctacagc ctggtgcaac tgcatctcaa cgccttccgg 2040
ggcgaccgcg agatcctggc cgcgctgctc gacggggcgc agtggaagcg gaccgaggac 2100
ttcgcccgcg aactgctcgc cttcaccttc ctgcacgact tcgaggtgtt cgaggagacc 2160
ccgctggatc tctccggctt caccgatccg gaggaactgg cgcagttcct ctgggggccg 2220
ccggacaccg cccccggcgc ctgataagga tccccgctcc gtgtaaatgg aggcgctcgt 2280
tgatctgagc cttgccccct gacgaacggc ggtggatgga agatactgct ctcaagtgct 2340
gaagcggtag cttagctccc cgtttcgtgc tgatcagtct ttttcaacac gtaaaaagcg 2400
gaggagtttt gcaattttgt tggttgtaac gatcctccgt tgattttggc ctctttctcc 2460
atggcaagct caccgttggc gacagatcgt tacaaccaac aaaattgcaa aactcctccg 2520
ctttttatca gctaattatc gaacatcctg caaatggaat cgataccgtc gacctcgagg 2580
gggggcccgg tacccagctt ttgttccctt tagtgagggt taatttcgag cttggcgtaa 2640
tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 2700
cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta 2760
attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 2820
tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg 2880
ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 2940
gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 3000
ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 3060
cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 3120
ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 3180
accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 3240
catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 3300
gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 3360
tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 3420
agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 3480
actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 3540
gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 3600
aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 3660
gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 3720
aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 3780
atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 3840
gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 3900
atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 3960
ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 4020
cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 4080
agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 4140
cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 4200
tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 4260
agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 4320
gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 4380
gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 4440
ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 4500
tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 4560
tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 4620
gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 4680
caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 4740
atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gc 4792
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> F-Spe-F
<400> 2
ctagttccat ttgcaggatg ttcgataatt agctgataaa aagcggagga gttttgcaa 59
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> F-Spe-R
<400> 3
cgctttttat cagctaatta tcgaacatcc tgcaaatgga a 41
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> F-Hind-F
<400> 4
ttttgttggt tgtaacgatc tgtcgccaac ggtgagcttg a 41
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> F-Hind-R
<400> 5
agcttcaagc tcaccgttgg cgacagatcg ttacaaccaa caaaattgca aaactcctc 59
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> R-Nco-F
<400> 6
tttgttggtt gtaacgatct gtcgccaacg gtgagcttgc 40
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> R-Nco-R
<400> 7
catggcaagc tcaccgttgg cgacagatcg ttacaaccaa caaaattgca aaactcctc 59
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> R-Cla-F
<400> 8
cgattccatt tgcaggatgt tcgataatta gctgataaaa agcggaggag ttttgcaat 59
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> R-Cla-R
<400> 9
cgctttttat cagctaatta tcgaacatcc tgcaaatgga at 42

Claims (2)

1.一种敲除衣藻内源基因和表达外源基因的载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11、AphVⅡ基因克隆：从质粒pHyg3中克隆，有效片段包括β2-Tublin启动子，rbcS23′UTR，rbcS2基因的第一个内含子rbcS2intron1，AphVⅡ基因，其中rbcS2intron1位于AphVⅡ基因中；
S12、splicingdonor的合成：包括正向splicingdonor FSD和反向splicing donorRSD；FSD由F-Spe-F，F-Spe-R，F-Hind-F，F-Hind-R四个引物退火合成，RSD由R-Nco-F，R-Nco-R，R-Cla-F，R-Cla-R四个引物退火合成；
引物的序列为：
F-Spe-F：
5’-CTAGTTCCATTTGCAGGATGTTCGATAATTAGCTGATAAAAAGCGGAGGAGTTTTGCAA-3’
F-Spe-R：
5’-CGCTTTTTATCAGCTAATTATCGAACATCCTGCAAATGGAA-3’
F-Hind-F：
5’-TTTTGTTGGTTGTAACGATCTGTCGCCAACGGTGAGCTTGA-3’
F-Hind-R：
5’-AGCTTCAAGCTCACCGTTGGCGACAGATCGTTACAACCAACAAAATTGCAAAACTCCTC-3’
R-Nco-F：
5’-TTTGTTGGTTGTAACGATCTGTCGCCAACGGTGAGCTTGC-3’
R-Nco-R：
5’-CATGGCAAGCTCACCGTTGGCGACAGATCGTTACAACCAACAAAATTGCAAAACTCCTC-3’
R-Cla-F：
5’-CGATTCCATTTGCAGGATGTTCGATAATTAGCTGATAAAAAGCGGAGGAGTTTTGCAAT-3’
R-Cla-R：
5’-CGCTTTTTATCAGCTAATTATCGAACATCCTGCAAATGGAAT-3’
每四个引物在一个反应体系中进行，反应体系包括：四个引物浓度为10μM，各1μl；TakaraLATaq，0.2μl；10xLAPCRbuffer，2μl；ddH2O，13.8μl；退火程序如下：94℃5min，90℃5min，80℃10min，70℃10min，60℃10min，50℃10min，40℃10min，30℃10min；合成的双链DNA片段用2％的琼脂糖凝胶电泳分离，天根纯化试剂盒纯化，纯化后的FSD和RSD序列分别用SpeI/HindIII，NcoI/ClaI酶切；
S13、酶切后的FSD：RSD片段连接到AphVII的5′，3′端形成FSD::AphVII::RSD大片段，经1％琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，天根试剂盒纯化回收；
S14、pHK415载体的构建：pBluescriptIIKS质粒用SpeI/ClaI双酶切，FSD::AphVII::RSD片段连接到酶切后的pBluescriptIIKS上形成pHK415质粒载体；
S15、pHK415载体验证：pHK415质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，提取阳性质粒，用SpeI/ClaI双酶切，经经1％琼脂糖凝胶电泳分离1.9kb目的片段，天根试剂盒纯化回收后测序验证。
2.如权利要求1中所述的一种敲除衣藻内源基因和表达外源基因的载体的应用，其特征在于，该载体经SpeI/ClaI双酶切后电转化莱茵衣藻细胞，与AphVⅢ插入载体相比可以提高衣藻基因转录终止效率，高效敲除衣藻内源基因。
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