BRPI0610988A2 - microorganismos termofìlicos com gene de lactato desidrogenase inativado (ldh) para produção de etanol - Google Patents

Abstract

Um microorganismo termofílico modificado é preparado, com uma modificação para inativar o gene de lactato desidrogenase de um microorganismo do tipo selvagem. O microorganismo modificado é utillizado na produção de etanol, utilizando açúcaras C3, C5 ou C6 como o substrato.

Description

MICROORGANISMOS TERMOFÍLICOS COM GENE DE LACTATODE SIDROGENASE INATIVADO (LDH) PARA PRODUÇÃO DE ETANOL

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se à produção deetanol como um produto de fermentação bacteriana. Emparticular, a invenção refere-se à produção de etanol porbactérias termofilicas.

Antecedentes da Invenção

Metabolismo bacteriano pode ocorrer através devários mecanismos diferentes dependendo da espéciebacteriana e condições ambientais. Bactériasheterotróficas, que incluem todos os patógenos, obtêmenergia a partir da oxidação de compostos orgânicos, comcarboidratos (particularmente glicose), lipideos eproteínas sendo os compostos mais comumente oxidados. Aoxidação biológica desses compostos orgânicos por bactériasresulta em síntese de ATP como a fonte de energia química.

O processo também permite a geração de compostos orgânicosmais simples (moléculas precursoras) que são exigidos pelacélula bacteriana para reações biossintéticas. O processogeral pelo qual as bactérias metabolizam substratosapropriados é a glicólise, que é uma seqüência de reaçõesque converge glicose em piruvato com a geração de ATP. Odestino de piruvato na geração de energia metabólica variadependendo do microorganismo e das condições ambientais. Hátrês reações principais de piruvato.

Primeiramente, sob condições aeróbicas, muitosmicroorganismos gerarão energia utilizando o ciclo de ácidocítrico e a conversão de piruvato em acetil coenzima A,catalisada por piruvato desidrogenase (PDH).

Em segundo lugar, sob condições anaeróbicas,certos organismos etanologênicos podem realizar afermentação alcoólica pela descarboxilação de piruvato emacetaldeido, catalisado por piruvato descarboxilase (PDC) ea redução subseqüente de acetaldeido em etanol por NADH,catalisado por álcool desidrogenase (ADH).

Um terceiro processo é a conversão de piruvato emlactato que ocorre através da catálise por lactatodesidrogenase (LDH).

Tem havido muito interesse no uso demicroorganismos para a produção de etanol utilizandomicroorganismos que são submetidos à fermentação anaeróbicanaturalmente ou através do uso de microorganismosrecombinantes que incorporam os genes de álcooldesidrogenase e piruvato descarboxilase. Embora tenhahavido algum sucesso na produção de etanol pelo uso dessesmicroorganismos, a fermentação é freqüentementecomprometida pela concentração aumentada do etanol, emespecial onde o microorganismo tem um nivel baixo detolerância a etanol.

Bactérias termofilicas foram propostas para aprodução de etanol, e seu uso tem a vantagem de que afermentação pode ser realizada em temperaturas elevadas quepermite que o etanol produzido seja removido como vapor emtemperaturas acima de 50°C; isso também permite que afermentação seja realizada utilizando elevadasconcentrações de açúcar. Entretanto, a descoberta debactérias termofilicas apropriadas que podem produziretanol eficientemente é problemática.

O WO 01/49865 revela uma bactéria gram-positivaque foi transformada com um gene heterólogo codificandopiruvato descarboxilase e que tem função de álcooldesidrogenase nativo, para a produção de etanol. A bactériaé um Bacillus termofilico e a bactéria pode ser modificadapela inativação do gene de lactato desidrogenase utilizandoinserção de transposon. As bactérias reveladas no WOOl-49865 são todas derivadas de Bacillus Cepa LLD-R, uma cepadeficiente em esporulação que se originou espontaneamenteda cultura, e na qual o gene Idh foi inativado por mutaçãoespontânea ou por mutagênese química. As cepas LN e TN sãoreveladas como derivados aperfeiçoados da cepa LLD-R.

Entretanto, todas as cepas contêm um sistema de restriçãodo tipo Hae III que impede a transformação de plasmídeo e,portanto, evita a transformação em DNA não metilado.

0 WO 01/85966 revela microorganismos que sãopreparados por metilação in vivo para superar os problemasde restrição. Isso requer a transformação com metiltransferase Hae III de Haemophilus aegyptius em cepas LLD-R, LN e TN. Entretanto, as cepas LLD-R, LN e TN sãomutantes instáveis e espontaneamente revertem-se em cepasdo tipo selvagem produtoras de lactato, particularmente empH baixo e em elevadas concentrações de açúcar. Issoresulta em alterações de produto de fermentação de etanolpara lactato, tornando as cepas inadequadas para produçãode etanol.

0 WO 02/29030 revela que a cepa LLD-R e seusderivados incluem um elemento de inserção de ocorrêncianatural (IE) na região de codificação do gene Idh. Atransposição desse para dentro (e para fora) do gene IdH einativação subseqüente de gene é instável, resultando emreversão. A solução proposta para isso foi integrar o DNAde plasmídeo na seqüência IE.

Portanto, na técnica, a produção demicroorganismos para a produção de etanol se baseia namodificação de microorganismos de Bacillus quimicamentemodificados produzidos em laboratório, tratando esses comprocedimentos de metilação in vivo e modificandoadicionalmente os microorganismos para integrar DNA deplasmídeo na seqüência ΙΕ. 0 procedimento é complexo,incerto e há também questões reguladoras sobre como ascepas podem ser utilizadas.

Há, portanto, necessidade de microorganismosaperfeiçoados para a produção de etanol.

Sumário da Invenção

De acordo com um primeiro aspecto da presenteinvenção, um microorganismo termofilico é modificado parapermitir a produção aumentada de etanol, a modificaçãosendo a inativação do gene de lactato desidrogenase de ummicroorganismo termofilico do tipo selvagem.

De acordo com um segundo aspecto da presenteinvenção, um microorganismo é aquele depositado como n° deacesso NCIMB 41275.

De acordo com um terceiro aspecto da presenteinvenção, um método para a produção de etanol compreendecultivar um microorganismo de acordo com a definiçãofornecida acima sob condições apropriadas na presença de umaçúcar C3, C5 ou C6.

De acordo com um quarto aspecto da presenteinvenção, um plasmideo é aquele definido aqui como pUB190-Idh (depositado como No. de acesso NCIMB 41276).

De acordo com um quinto aspecto da presenteinvenção, um microorganismo termofilico compreende oplasmideo definido aqui como pUB190 (figura 4).

Descrição dos Desenhos

A presente invenção é descrita com referência àsfiguras em anexo, onde:

A figura 1 é um gráfico mostrando a produção deetanol de um microorganismo da invenção (Idh 35) comdiferentes substratos;

A figura 2 é um gráfico mostrando a produção deetanol de um microorganismo da invenção (Idh 58) comdiferentes substratos;A figura 3 é um gráfico mostrando a produção deetanol por um mutante nocaute LDH de 11955;

As figuras 4 e 5 são representações esquemáticasdos plasmideos pUB utilizados na invenção; a figura 4 é omutante Idh de acordo com a invenção; e

A figura 6 é um gráfico mostrando a estabilidadedo mutante nocaute LDH sob diferentes condições de cultura.

Descrição da Invenção

A presente invenção se baseia na modificação deum microorganismo termofilico do tipo selvagem para rompera expressão do gene da lactato desidrogenase.

A inativação do gene da lactato desidrogenaseajuda a evitar a ruptura de piruvato em lactato e,portanto, promove (sob condições apropriadas) a ruptura depiruvato em etanol utilizando piruvato descarboxilase eálcool desidrogenase. Isto é preferido caso o gene delactato desidrogenase seja rompido por uma deleção dentrodo ou no gene.

O microorganismo do tipo selvagem pode serqualquer microorganismo termofilico, porém prefere-se que omicroorganismo seja o Bacillus spp. Em particular, prefere-se que o microorganismo seja da espécie GeoBacillus, emparticular GeoBacillus thermoglucosidasius.

Diz-se que os microorganismos selecionados paramodificação são do "tipo selvagem", isto é, não sãomutantes produzidos em laboratório. Os microorganismospodem ser isolados a partir de amostras ambientais que seespera contenham termófilos. Microorganismos do tiposelvagem isolados terão a capacidade de produzir etanolporém lactato não modificado provavelmente é o principalproduto de fermentação. Os isolados são também selecionadosem relação a sua capacidade de crescer em açúcares hexosee/ou pentose, e oligômeros dos mesmos, em temperaturastermofílicas.

É preferível que o microorganismo da invençãotenha certas características desejáveis que permitam que omicroorganismo seja utilizado em um processo defermentação. 0 microorganismo preferivelmente não deve tersistema de restrição, desse modo evitando a necessidade demetilação in vivo. Além disso, o microorganismo deve serestável a pelo menos 3% de etanol e deve ter a capacidadede utilizar açúcares C3, C5 e Ce (ou seus oligômeros) comosubstrato, incluindo celobiose e amido. É preferível que omicroorganismo seja transformável em uma freqüênciaelevada. Além disso, o microorganismo deve ter uma taxa decrescimento em cultura contínua para suportar taxas dediluição de 0,3 h_1 e acima (tipicamente 0,3 OD6oo) ·

O microorganismo será um termófilo e crescerá nafaixa de temperatura de 40°C - 85°C. Preferivelmente, omicroorganismo crescerá na faixa de temperatura de 50°C -70°C. Além disso, é desejável que o microorganismo cresçaem condições de pH 7,2 ou abaixo, em particular pH 6,9 - pH 4,5.

O microorganismo pode ser um formador de esporoou pode não esporular. 0 sucesso do processo de fermentaçãonão depende necessariamente da capacidade do microorganismode esporular, embora em certas circunstâncias possa serpreferível ter um esporulador, quando é desejável utilizaros microorganismos como uma matéria-prima animal ao términodo processo de fermentação. Isso é devido à capacidade dosesporuladores de fornecer uma boa estimulação imune quandoutilizado como matéria-prima animal. Microorganismos deformação de esporos têm também a capacidade de assentardurante fermentação e, portanto, podem ser isolados sem anecessidade de centrifugação. Por conseguinte, osmicroorganismos podem ser utilizados em uma matéria-primaanimal sem a necessidade de procedimentos de separaçãocomplicados ou caros.

A seqüência de ácido nucléico para lactatodesidrogenase é conhecida agora. Utilizando essa seqüência,é possível que a pessoa versada alveje o gene de lactatodesidrogenase para obter inativação do gene através dediferentes mecanismos. Prefere-se que o gene de lactatodesidrogenase seja inativado pela inserção de um transposonou, preferivelmente, pela deleção da seqüência de gene ouuma porção da seqüência de gene. A deleção é preferidavisto que isso evita a dificuldade de reativação daseqüência de gene que é freqüentemente experimentada quandoa inativação de transposon é utilizada. Em uma modalidadepreferida, o gene de lactato desidrogenase é inativado pelaintegração de um plasmídeo sensível à temperatura(plasmídeo pUBl90-Idh), que obtém recombinação homóloganatural ou integração entre o plasmídeo e o cromossomo demicroorganismo. Integrantes cromossômicos podem serselecionados com base em sua resistência a um agenteantibacteriano (por exemplo, canamicina). A integração nogene de lactato desidrogenase pode ocorrer por um evento derecombinação de cruzamento único ou por um evento derecombinação de cruzamento duplo (ou mais).

Em uma modalidade preferida, o microorganismocompreende um gene de álcool desidrogenase heterólogo e umgene de piruvato descarboxilase heterólogo. A expressãodesses genes heterólogos resulta na produção de enzimas queredirecionam o metabolismo de modo que o etanol seja oprincipal produto de fermentação. Esses genes podem serobtidos de microorganismos que são submetidos tipicamente àfermentação anaeróbia, incluindo espécie zymomonas,incluindo zymomonas mobilis.Os métodos para a preparação e incorporaçãodesses genes em microorganismos são conhecidos, porexemplo, em Ingram e outros, Biotech & BioEng., 1998; 58(2 + 3) : 204-214 e US 5916787, o teor de cada um sendoincorporado aqui a titulo de referência. Os genes podem serintroduzidos em um plasmideo ou integrados no cromossomo,como será reconhecido pela pessoa versada.

Os microorganismos da invenção podem sercultivados sob condições de cultura convencionais,dependendo do microorganismo termofilico escolhido. Aescolha de substratos, temperatura, pH e outras condiçõesde crescimento, pode ser feita com base em exigências deculturas conhecidas, por exemplo vide WO01/49865 eWOOl/85966, o teor de cada uma sendo incorporado aqui atitulo de referência.

A presente invenção será descrita agora, somentecomo exemplo, com referência aos desenhos em anexo, nosseguintes exemplos.

Inativação do gene LDH

Exemplo 1 - mutação de cruzamento única

Desenvolvimento do vetor nocaute LDH

Um fragmento de gene Idh parcial deaproximadamente 800 bp foi subclonado no vetor defornecimento sensível à temperatura pUB190 (SEQ ID NO. 1)utilizando HindIII e XbalI resultando em um plasmideo de7,7 kb pUB190-Idh (figura 4 e SEQ ID NO. 2). 0 plasmideopUB190 foi depositado com NCIMB como indicado abaixo. Deztransformantes JM109 E.coli putativos (pUB190-Idh) foramverificados por análise de restrição e duas culturasutilizadas para produzir DNA de plasmideo para atransformação. A digestão de pUB190-Idh com HindIII e XbaIlibera o fragmento idh esperado.Transformação de GeoBacillus thermoglucosidasius11955 com pUB190-Idh

Transformantes foram obtidos com todos os trêsplasmideos testados após 24 - 48 h a 54°C com seleção decanamicina. Os transformantes de idh foram purificados deGeoBacillus thermoglucosidasius (Gt) 11955 e verificadospor análise de restrição utilizando HindIII e XbaI.

Gene nocaute LDH

O gene nocaute foi executado por integração de umplasmídeo sensível á temperatura no gene Idh no cromossomo.

O plasmídeo pUB190-Idh replica em 54°C em Gtll955porém não em 65°C. A seleção foi mantida com canamicina(kan) (12μg/ml). A temperatura de crescimento foi entãoaumentada para 65°C (o plasmídeo não mais é replicativo). Arecombinação natural ou integração ocorre entre o plasmídeoe cromossomo. Integrantes cromossômicos foram selecionadospor sua resistência à canamicina. A integração foi dirigidaao gene Idh uma vez que uma seqüência homóloga reside noplasmídeo. A integração alvejada no gene Idh ocorreu por umprocesso conhecido como recombinação de cruzamento único. Oplasmídeo se torna incorporado no gene Idh resultando em umgene Idh inativo. Repetições tandem podem ocorrer se váriascópias do plasmídeo se integram.

Metodologia e resultados

Dois métodos diferentes foram tentados paraintegração:

Método 1: 4 χ 50 ml de culturas TGP (kan) foramcultivadas em 54 0C por 12 - 18 horas. As células forampeletizadas por centrifugação e suspensas novamente em 1 mlde TGP. A nova suspensão foi semeada (5 χ 200 ml) em placasTGP (kan) e incubada durante a noite a 68°C. Os integrantesforam coletados e revestidos sobre uma grade de 50quadrados em placas TGP (kan) novas e incubadas durante anoite a 68°C.

Método 2: 1 χ 50 ml de culturas TGP (kan) foramcultivadas em 54°C por 12 - 18 horas. 1 ml da cultura foiutilizada para inocular 50 ml de culturas TGP (kan) novasque foram cultivadas a 68°C por 12 - 18 horas. Essa foisub-cult ivada no dia seguinte em 50 ml de culturas TGP(kan) novas e cultivadas a 68°C por um período adicional de12 - 18 horas. A cultura foi semeada em placas TGP (kan) eincubada a 68° durante a noite. O crescimento confluentefoi obtido nas placas. Colônias únicas foram semeadassobre uma grade de 50 quadrados em placas TGP (kan) novas eincubadas durante a noite a 68°C.

Seleção

Os integrantes putativos foram selecionados emrelação ao gene nocaute Idh utilizando o seguinte:

1) Uma seleção de placa

O revestimento de réplica de várias centenas deintegrantes sobre placas SAM2 (com kan) a 68°C. Célulasnegativas de lactato produzem menos ácido e podem ter umavantagem de crescimento em relação ao tipo selvagem emmeios de fermentação sem tampões.

2) Uma seleção de PCR

PCR em colônia foi utilizado para determinar se oplasmídeo integrou o gene Idh. Pela escolha de iniciadoresque flanqueiam o sítio de integração, foi possíveldeterminar se a integração de gene Idh ocorreu (nenhumfragmento de PCR foi amplificado por inserções).

3) Ensaio de lactato

Esse ensaio determina se os integrantes produzemlactato quando cultivados durante a noite em SAM2 (kan) a68°C. O sobrenadante de cultura foi testado em relação àconcentração de lactato com o reagente de lactato Sigmapara determinação de lactato. Integrantes negativos delactato foram adicionalmente caracterizados por PCR eavaliados em um fermentador em relação à estabilidade.

Protocolo_de_eletroporação_para_GeoBacillusthermoglucosidasius NCIMB 11955

Um estoque congelado de NCIMB 11955 foi feitocultivando uma cultura durante a noite em meio TGP (250 rpma 55°C, 50 ml de volume em um frasco cônico de 250 ml,OD60o) , adicionando um volume igual de glicerol a 20% edividindo em alíquotas de 1 ml e armazenando em criotubos a-80°C. 1 ml desse estoque foi utilizado para inocular 50 mlde TGP em um frasco cônico de 250 ml, incubado a 55°C, 250rpm, até que a cultura atinja Οϋεοο 1/4.

0 frasco foi resfriado em gelo por 10 minutos, aseguir a cultura centrifugada por 20 minutos a 4000 rpm a4 °C. O pélete foi suspensa novamente em 50 ml de meio deeletroporação gelado e centrifugada a 4.000 rpm por 20minutos. Três lavagens adicionais foram realizadas, 1 χ 25ml e 2 χ 10 ml, e então o pélete foi suspensa novamente em1,5 ml de meio de eletroporação gelado e dividida emalíquotas de 60 μΐ.

Para a eletroporação, 1 - 2 μΐ de DNA foiadicionado a 60 μΐ de células eletrocompetentes em um tuboEppendorf mantido em gelo, e suavemente misturado. Essasuspensão foi transferida para uma cubeta de eletroporaçãopré-resfriada (1 mm de abertura) e eletroporada em 2500V,10μΓ de capacitância e 600Ω de resistência.

Imediatamente após o pulso, 1 ml TGP foiadicionado, misturado, e a suspensão transferida para umtubo de topo de rosca e incubada a 520C por 1 hora em umbanho de água de agitação. Após incubação a suspensão foicolocada diretamente (por exemplo, 2 χ 0,5 ml) oucentrifugada em 4.000 rpm por 20 minutos, suspensanovamente em 200 μΐ- 500μ1 de TGP, e semeada em agar TGPcontendo o antibiótico apropriado.

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Inativação do gene LDH.

Mutação cruzada dupla

Iniciadores foram projetados com base naseqüência LDH 11955 disponível. A estratégia nocaute foibaseada na geração de deleções internas no gene LDH porduas abordagens.

Na estratégia 1, dois sítios de restriçãoexclusivos existentes próximos ao meio das seqüências decodificação ODH foram explorados para gerar uma deleção. Umproduto per grande, único, foi gerado a partir de DNAgenômico cobrindo grande parte da seqüência LDH disponível,e clonado no sítio Smal no sítio de clonagem múltipla depUC19. 0 clone pUC19 foi então digerido seqüencialmente comBstEII e BsrGl e religado após digestão Klenow, para geraruma deleção interna no gene LDH entre BstEII e BsrGI.

Na estratégia 2 (vide o exemplo 2) o gene LDH foiclonado como 2 produtos PCR, introduzindo sítios NotI nosoligo iniciadores para permitir que os 2 produtos PCR sejamligados juntos em pUC19, com a geração de uma deleção nomeio da seqüência LDH. Os dois genes LDH com as deleçõesinternas foram subclonados em três sistemas de fornecimentoem potencial para GeoBacillus.<table>table see original document page 14</column></row><table>

Os vetores de fornecimento foram transformados em 11955 por eletroporação.

Informação de estratégia genética: desenvolvimento desistemas de fornecimento para recombinação homóloga

Para gerar nocautes, um sistema eficiente énecessário para fornecer um gene modificado para oorganismo alvo e selecionar para integração no genoma porrecombinação homóloga com o alvo de gene do "tiposelvagem". Em principio, isso poderia ser obtido porintrodução do DNA em um vetor de E.coli sem um repliconGram-positivo porém que carrega um marcador selecionávelGram-positivo. Isso requer uma elevada eficiência detransformação. 0 método de eletroporação desenvolvido paraGeoBacillus 11955 gera 3xl04 transformantes por ug de DNAcom pNW33N. O replicon Gram-positivo é derivado de pBCl nocatálogo BGSC, e a partir de pTHT15 no banco de dados de seqüência.

O gene cat em pNW33N é utilizado para seleçãotanto de E. coli como GeoBacillus. Mutantes sensíveis àtemperatura de pMW33N foram gerados pela passagem doplasmídeo através da cepa de mudança Stratagene XLlr ed.

Exemplo 1

Geração de um mutante LDH por substituição de gene

Uma estratégia adicional foi projetada para geraruma mutação estável do gene LDH em GeoBacillusthermoglucosidasius NClMB 11955 por substituição de gene.Essa estratégia envolveu a geração de uma deleção de 42bppróximo ao meio da seqüência de codificação, e a inserçãonessa posição de 7bp introduzindo um novo sitio derestrição Notl. Essa seqüência inserida foi destinada acausar uma mutação localizada a jusante.

A estratégia envolveu gerar a deleção utilizando2 fragmentos PCR utilizando oligo iniciadores introduzindoo sitio Notl novo. Iniciadores foram projetados com base naseqüência parcial da região de codificação LDH a partir de19955. A seqüência dos iniciadores utilizados é mostradaabaixo.

Fragmento 1:

Iniciador 1 (frente):GGAATTCCCTTATGAACCAAGGAATAGCA (SEQ ID NO. 3; seqüênciasublinhada indica bases introduzidas para gerar um sitioEcoRI novo)

Iniciador 2 (reverso):GCGGCCGCACCCGCTCTTTCGGTAACCCGCT (SEQ ID NO. 4/ seqüênciasublinhada indica bases introduzidas para gerar um sitioNotI novo).

Fragmento 2:

Iniciador 3 (frente);GCGGCCGCTTGCTAAGTGAATATTTTCAAGT (SEQ ID NO: 5; seqüênciasublinhada indica bases introduzidas para gerar um sitioNotI novo).

Iniciador 4 (reverso):CTGCAGCGTCAATTCCATCACTTCACGA (SEQ ID NO. 6; seqüênciasublinhada indica bases introduzidas para gerar um sitioPstI novo).

Preparação de DNA genômico

DNA genômico foi preparado a partir de 11955 paraservir como modelo para PCR. Células a partir de umacultura de 20 ml de 11955, cultivadas durante a noite emmeio TGP a 52°C, foram coletadas por centrifugação a 4.000rpm por 20 min. O pélete de célula foi resuspenso em 5 mlde tampão STE sacarose 0,3 M, Tris HCl 25 mM e EDTA 25 mM,ajustado para pH 8,0 contendo 2,5 mg de lisozima e 50 μΐ dede ribonuclease A 1 mg/ml. Essa foi incubada por 1 hora a30°C, a seguir 5 mg de proteinase K foi adicionada e 50 μΐde SDS a 10% seguido por incubação a 37°C por 1 hora. Acultura lisada foi então extraída següencialmente comvolumes iguais de fenol/clorofórmio seguido porclorofórmio, antes da precipitação com isopropanol. Apóslavar duas vezes com etanol a 70% gelado, o pélete de DNAfoi redissolvido em 0,5 ml de tampão TE.

Geração de construto de deleção de LDH

PCR foi realizado utilizando um GradienteRobocycler 96 (Stratagene) e as condições de reação foramcomo a seguir: ciclo 1; desnaturação a 95°C por 5 min.,anelamento a 47°C por 1 min., extensão a 72°C por 2 min., euma incubação adicional a 72°C por 5 min. As enzimasutilizadas foram uma mistura igual de Pfu polymerase(Promega) e Taq polymerase (New England Biolabs, NEB) . 0tampão e composição de dNTPs e concentração utilizada foramàquelas recomendadas para Pfu pelos fornecedores. Osprodutos PCR obtidos utilizando DNA genômico a partir deNCIMB 11955 como modelo foram purificados por eletroforesede gel agarose e eluídos a partir em gel de agaroseutilizando o Kit de extração QlAquick Gel (Qiagen) . Osprodutos de PCR purificados foram ligados a pUC19 (NewEngland Biolabs) previamente digeridos com Smal e a misturade ligação foi utilizada para transformar Escherichia coliDHlOB (Invitrogen). Colônias resistentes à ampicilina foramselecionadas e os plasmídeos contidos foram isolados ecaracterizados por análise de restrição, e a orientação dasinserções foi estabelecida.

Um plasmideo (pTM002) com fragmento 2 inserido empUC19 (com o sitio Pstl novo introduzido no Iniciador 4mais próximo ao sitio Pstl no sitio de clonagem múltipla(mcs) de pUC19) foi digerido com NotI e PstI. O fragmentoresultante (aproximadamente 0,4 kb) foi ligado em umplasmideo pUC19 (pTMOOl) contendo o fragmento 1 (com ositio EcoRI novo introduzido no Iniciador 1 mais próximo aositio EcoRI no mcs de pUC19) digerido com NotI e PstI paralinearizar o plasmideo. A mistura de ligação foi utilizadapara transformar E.coli DH10B. Colônias resistentes àampicilina foram selecionadas e os plasmideos contidosforam isolados e caracterizados por análise de restrição.

Um plasmideo (pTM003) com o padrão de restrição esperadopara a construção desejada (a região de codificação LDHcarregando a deleção e sitio NotI introduzido) foi xidentificado e verificado pelo seqüenciamento utilizandoiniciadores M13mpl8 de frente e reverso.

O gene LDH modificado foi cortado a partir depTM003 por digestão com HindIII e EcoRI e purificado poreletroforese em gel de agarose seguido por elução a partido gel de agarose utilizando o Kit de extração de GelQIAquick (como um fragmento de aproximadamente 0,8 kb) .

Esse fragmento foi tratado com polimerase Klenow (NEB, deacordo com as instruções do fabricante) para gerarextremidades cegas e introduzido no vetor pUB190. Isso foiobtido por ligação de extremidade cega com pUB190linearizado por digestão com XbaI e então tratado comKlenow seguido por purificação de gel como anteriormente. Amistura de ligação foi utilizada para transformar E.coliSCSllO (Stratagene). As colônias resistentes à ampicilinaforam selecionadas e os plasmideos contidos foram isoladose caracterizados por análise de restrição. Um plasmideo(pTM014) com o padrão de restrição esperado para aconstrução desejada foi identificado e utilizado paratransformar NCIMB 11955 por eletroporação utilizando oprotocolo de eletroporação como descrito no Exemplo 1.

Geração e caracterização de um mutante LDH de substituiçãode gene por cruzamento duplo

Um integrante primário provável de pTM014 obtidodesse modo (cepa TM15) foi utilizado para obterrecombinantes duplos (substituição de gene). Isso foiobtido por sub-cultura serial de TM15 em meio TGP semcanamicina. Cinco culturas agitadas sucessivas foramutilizadas, alternando entre 8 horas a 54°C e 16 horas a52°C, utilizando 5 ml TGP em tubos de 50 ml (Falcon) a 250rpm, 1% de transferência em cada estágio. Após essas 5passagens, a cultura resultante foi diluída em série em TGPe amostras de 100 μΐ semeadas em placas de agar TGP paraincubação a 54°C. 0 revestimento por réplica das colôniasresultantes sobre agar TGP contendo 12 μg/ml de canamicinafoi utilizado para identificar colônias sensíveis àcanamicina. Após riscar colônias únicas em agar parapurificar, esses derivados sensíveis à canamicina foramtestados em relação à produção de lactato, e como esperado,provaram uma mistura de LDH+ e LDH-. Um derivado de LDH-,TM89, foi adicionalmente caracterizado por PCR e Southernblots.

DNA genômico foi preparado a partir de TM15(integrante primário) e TM89 (LDH- recombinante duploprovável), e utilizado como modelo para PCR utilizandoIniciadores 1 e 4, utilizando as condições descritas acima.DNA genômico a partir de 11955 foi utilizado como controle.

Os produtos de PCR (faixas de aproximadamente 0,8 kb foramobtidas a partir de todos os 3 modelos) foram purificadospor eletroforese em gel de agarose e eluidos a partir degel de agarose utilizando o Kit de Extração de GelQIAquick. As amostras foram digeridas com NotI e passadasem agarose gel a 0,7% para visualizar os produtos. 0produto PCR de 11955 não mostrou evidência de digestãoNotI, como esperado, ao passo que o produto PCR de TM89forneceu 2 faixas em torno de 0,4 kb, indicando asubstituição do gene do tipo selvagem com o alelomodificado. A digestão de NotI do produto PCR de TM15, ointegrante primário, forneceu predominantemente as 2 faixasvistas com TM89, com um traço da faixa não cortada (0,8kb). Isso pode ser explicado pelo resultado obtido comSouthern blotting do DNA genômico TM15.

O DNA genômico de 11955, TM15 e TM89 foi digeridocom NotI, PstI e NotI, e HindIII e NotI, e submetido aeletroforese em gel de agarose. 0 DNA foi transferido parasobre uma membrana de náilon positivamente carregada(Roche) e hibridizado com uma sonda rotulada DIG gerada porPCR do gene LDH 11955 utilizando Iniciadores 1 e 4 comdNTps rotulado DIG, seguindo as instruções do fornecedor(manual de aplicação de DIG da Roche MolecularBiochemicals). As faixas de hibridização foram visualizadasutilizando o kit de detecção fornecido (Roche). 0 Southernblot mostrou evidência de uma faixa muito amplificada deaproximadamente 7,5 kb na digestão NotI de TM15, com faixassimilarmente amplificadas de aproximadamente 7 e 0,4 kb nasdigestões HindIII/Notl e PstI/Notl de TM15, indicandointegração de múltiplas cópias de tandem de pTM014integradas no local LDH nesse integrante primário. Comtodos as 3 digestões de restrição, TM89 mostrou evidênciade um padrão de restrição diferente mostrando uma faixa dehibridização extra comparada com 11955, compatível com asubstituição de gene. TM89 foi depositado sob o n° deacesso NCIMB 41275 como indicado abaixo.

Exemplo 3

Produção de etanol pelo termófilo do tipo selvagem

A formação de produto e crescimento reprodutivelfoi obtida em batelada alimentada e culturas continuas parao termófilo do tipo selvagem. As Tabelas 1, 2 e 3 mostramas condições utilizadas no processo de fermentação.

Tabela 1

<table>table see original document page 20</column></row><table>

Tabela 2

Solução de estoque de elementos residuais de sulfato

<table>table see original document page 20</column></row><table><table>table see original document page 21</column></row><table>

Tabela 3

Condições do fermentador

<table>table see original document page 21</column></row><table>

Tabela 4

Sumário de aperfeiçoamentos em crescimento de Baclllus do tipo selvagem em cultura de batelada <table>table see original document page 21</column></row><table><table>table see original document page 22</column></row><table>

Exemplo 4

Aumento de produção de etanol por termófilos

Para obter os rendimentos de etanol alvo eprodutividade a partir do termófilo, a produção de ácidoláctico foi minimizada através do nocaute de atividade deLactato desidrogenase-L (LDH) por inativação do gene Idh.Houve duas abordagens tomadas para inativar o gene Idh: umaúnica recombinação cruzada de DNA marcador na região Idh docromossomo, evitando sua transcrição, ou uma recombinaçãodupla de regiões homólogas de DNA para o gene Idh a fim decriar uma mutação dentro da região de gene, tornando amesma não funcional.

A abordagem cruzada única gerou rapidamentemutantes LDH-negativos que mostraram um aumento em produçãode etanol quando comparados com a cepa do tipo selvagem(NCIMB 11955).

Aperfeiçoamentos em produção de etanol pelos mutantes LDH

Os mutantes LDH-negativos foram cultivados emculturas de batelada alimentada, nos meios mínimosestabilizados para medir o aumento em produção de etanolque resulta do nocaute de atividade LDH. A alteração nosperfis de metabólito dos mutantes LDH é mostrada na Tabela5, em comparação com a produção ótima de etanol a partir dacepa do tipo selvagem. Os perfis de produção de metabólitode dois dos mutantes LDH são mostrados nas figuras 1 e 2. ATabela 6 mostra o aumento de produção de etanol causadopelo nocaute de atividade LDH.<table>table see original document page 23</column></row><table>Os mutantes LDH produziram rendimentossignificativamente mais elevados de etanol do que otermófilo do tipo selvagem, demonstrando o redirecionamentobem sucedido do metabolismo desses termófilos. A otimizaçãoadicional de condições e cultura e constituintes de meiospara as cepas de mutante LDH resultará em rendimentosaumentados de etanol.

Produção de etanol pelos mutantes LDH em cultura continua

0 mais estável dos mutantes de lactato decruzamento único foi cultivado em cultura continua paradeterminar sua estabilidade a longo prazo como produtor deetanol. A cepa foi cultivada em meios mínimos com glicosecomo fonte de carbono. A cultura de estado constante foiobservada por aproximadamente 2900 horas antes daocorrência da reversão para produção de lactato.

Exemplo 5

O mutante de cruzamento duplo TM8 9 (Exemplo 2)foi testado para produção de etanol como exposto no Exemplo4. Os resultados são mostrados na Tabela 8 e mostram que omutante obteve níveis significativos de produção de etanol(maior do que 200 mM) . 0 mutante também foi testado paraprodução de etanol utilizando glicose ou xilose como afonte de carbono. Os resultados são mostrados na Tabela 7.<table>table see original document page 25</column></row><table>Glicose foi mostrada como sendo a melhor fonte decarbono, porém os resultados mostram claramente que osorganismos são capazes de fermentar xilose sem modificaçãoadicional.

Ά estabilidade do mutante negativo de lactatodesidrogenase foi também testada sob uma variedade decondições em cultura continua durante um período de 1500horas. Os resultados são mostrados na figura 6, edemonstram que o fenótipo negativo de lactato desidrogenasepermanece estável, apesar de desafios significativos para acultura, e não se baseia em seleção de antibiótico parapermanecer. Durante esse curso continuo a taxa de diluiçãovariou entre 0,1 h_1 e 0,5 h"1 e a cultura foi mudada entrecondições óxica (ar ligado) e anóxica (N2 ligado) semalteração na concentração de lactato. Maissignificativamente o pH da cultura foi variado e caiu parapH 4,4, que está fora da faixa normal de pH paracrescimento do organismo do tipo selvagem. Entretanto, acultura rapidamente se recuperou sem alteração em fenótipo,a saber a concentração de lactato não mudou.

0 microorganismo definido aqui como TM89 e oplasmídeo pUB 190-Idh foram depositados sob Números deacesso NCIMB 41275 e 41276, respectivamente. O depositárioé: NCIMB Ltd., Ferguson Building, Craibstone Estate,Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Reino Unido.<table>table see original document page 27</column></row><table>LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> TMO Biotec Limited

<120> Microorganismos Termofilicos para Produção de Etanol

<130> JWJ01150WO

<150> GB0511603.3

<151> 2005-06-07

<150> GB0509068.3

<15I> 2005-05-04

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 6744

<212> DNA

<213> GeobaciXius thermoglucosidasius

<400> 1

gaattcçtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgasat tgttatccgc tcacaattcc 60acacaacata cgagccggaa acataaaatg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 120sctcscatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcçggaaacc t gt cgtgcca 180gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 240cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 300tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 360çtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 420ccataçgctc cgcccccctg acgagcat ca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 480aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 540tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 600çgcgctttct cataoctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 660gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcaccttat ccggtaacta 720tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 780caggattagc agagcgaggt atgtaggcag tgctacagag ttcttgaagt ggtgqcctaa 840ctacgoctac actaaaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 900cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 960ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagasg atcctttgat 1020cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaogga ttttggtcat 1080gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat tsaaaatgaa gttttaaatc 1140satctsaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaçgc 1200acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 1260gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 1320cccacactca ccqgctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 1380cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 14 4 0taçagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacagacat 1500cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 1560gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 1620cgttgtcaga agtaagttga ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcaa cactgcataa 1680ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 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3420acctttsaga CCtttCtttt ttttacgaga aaaaagaaac aaaaaaacct gccctctgcc 34 80acctcagcaa aggggggttt tgctctcgtg ctcgtttaaa aatcagcaag ggacaagtag 3540tattttttga gaagatcact caaaaaatct ccacctttaa acccttgcca atttttattt 3600tgtccgtttt gtctagctta ccgaaagcca gactcagcaa gaataaaatt tttattgtct 3660ttcggttttc tagtgtaacg gacaaaacca ctcaaaataa aaaagataca agagaggtct 3720ctcgtatctt ttattcagca atcacgccca attgctgaac agattaataa tagattttag 3780ctttttattt gttgasasaa gctaatcaaa ttgttgtcgg gatcaattac tgcaaagtct 3840cgttcatcec accactgatc ttttaatgat gtattggggt çcaaaatgcc caaaggctta 3900atatgttaat ataattcatc aattccctct acttcaatgc ggcaactagc agtaccagca 3960ataaacgact ccccacctgt ecaaaccggt gaatcattac tacgagagcg ccagccttca 4 020tcacttgcct cccatagatg aatccgaacc tcattacaca ttagaactgc gaatccatct 4 080tcatggtgaa ccaaagtgaa acctagttta tcgcaataaa aacctatact ctttttaata 4140tccccgactg gcsatgccgç gatagactgt aacattctca cgcataaaat cccctttcat 4200tttctaatgt aaatctatta ccttattatt aattcaattc gctcatsatt aatccttttt 4260cttattacgc aaaatggccc gatttaagca caccctttat tccgttaatg cgccatgaca 4320gccatgataa ttactaatac taggagaagt taataaatac gtaaccaaca tgattaacaa 4380ttattagagg tcatcgttca aaatggtatg cgttttgaca catccsctat atatccgtgt 4440cgttctgtcc actcctgaat cccattccag aaattctcta gcgattccaa aaatttctca 4500gagtcggaaa gttgaccaga cattacgaac tggcacagat ggtcataacc tgaaggaaga 4560tctgattgct taactacttc agttaagacc gaagcgctcg tcgtataaca gatgcçatga 4620tgcagaccaa tcaacatgoc acctgccatt gctacctgta cagtcaagga tggtagaaat 4660gttgtcgqtc cttgcacacg aatattacgc catttçcctg catattcaaa caactcttct 4740acgataagog cacaaatcgc atcgtggaac gtttgggctt ctaccgattt agcagtttga 4800tacactttct ctaagtatcc acctgsatca taaatcggca aaatagaqaa aaattgacca 4850

tgtgtaaacç gccaatctga ttceacctga gatgcataat ctagtagaat ctcttcgcta 4 920

tcaaaattca cttccacctt ccactcaccg gttgtccatt catggctgaa ctctgcttcc 4 980

tctgttgaca tgacacacat catctcaata tccgaatagg gcccatcagt ctgacgacca 5040

agagagccat aaacaccaat agccttaaca tcatccccat atttatccaa tattcgttcc 5100

ttaatttcat gaacaatctt cattctttct tctctagtca ttattattgg tccattcact 5160

attctcattc ccttttcaga taattttaga tttgcttttc taaataagaa tatttggaga 5220

gcaccgttct tattcagcta ttaataactc gtcttcctaa gcatccttca atccttttaa 5280

taacaattat agcatctaat cttcaacaaa ctggcccgtt tgttçaacta ctctttaata 5340

aaataatttt tccgttccca attccacatt gcaataatag aaaatccatc ttcatcgact 5400

ttttcgtcat catctgtatg aatcaaatcg ccttcttctg tgtcatcaag gtttaatttt 5460

ttatgtattt cttttaacaa accaccatag gagattaacc ttttacggtg taaaccttcc 5520

tccaaatcag acaaacgttt caaattcttt tcttcatcat cggtcataaa atccgtatcc 5580

tttacaggat attttgcagt ttcgtcaatt gccgattgts tatccgattt atatttattt 5640

ttcggtcgaa tcatttgaac ttttacattt ggatcatagt ctaatttcat tgcctttttc 5700

caaaattgaa tccattgttt ttgattcacg tagttttctg tattcttaaa ataagttggt 5760

tccacacata ccaatacatg catgtgctga ttatsagaat tatctttatt atttattgtc 5820

ecttccgttg cacgcataaa accaacaaga tttttattaa tttttttata ttgcatcatt 5880

cggcgaaatc cttgagccat atctgacaaa ctcttattta attcttcgcc atcataaaca 5940

tttttaactg ttsatgtgag aaacaaccaa cgaactgttg gcttttgttt aataacttca 6000

gcaacaacct tttgtgactg aatgccatgt ttcattgctc tcctccagtt gcacattgga 6060

caaagcctgg atttacaaaa ccacactcga tacsactttc tttcgcctgt ttcacgattt 6120

tgtttatact ctaatatttc agcacaatct tttactcttt cagccttttt aaattcaaga 6180

atatgcagaa gttcaaagta atcaacatta gcgattttct tttctctcca tggtctcact 6240

tttCCa cttt ttgtcttgtc cactaaaacc cttgattttt catctgaata aatgctacta 6300

ttaggacaca taatattaaa agaaaccccc stctatttag ttatttgttt agtcacttst 6360

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ctatatgtat caagataaga aagaacsagt tcaaaaccat caaaaaaaga caccttttca 6540

ggtgcttttt ttattttata sactcattcc ctgatctcga cttcgttctt tttttacctc 6600tcggctatga gttagttcaa attcgttctt tttaggttct aaatcgtgtt tttcttggaa 6660

ttgtgctgtt ttatccttta ccttgtctac saacccctta aaaacgtttt taaaggcttt 6720

taagccgtct gtacgttcct taag 67 4 4

<210> 2<211> 7673<212> DNA

<213> Geobacillus theriüoglucosidasius<400> 2

gaattcçtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtatgaaat tgttatccgc tcacaattcc 60

acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 120

actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccaçj tcçagaaacc tgtcgtgcca 180

gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 240

cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc gqtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 300

tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 360

gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 420

ccataggctc cgccccc.ctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 480

aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 540

tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt caagaagcgt 600

ggcqctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 660

gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc t.gcgccttat ccggtaacta 720

tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 780

caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 840

ctacggctac actagaagga cagtatttog tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 900

cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 960

ttfctqtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 1020

cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 1080

gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 1140

aatctaaagt atatatgaat aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcsgtgaggc 1200

acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 1260

gataactacg stacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctocaatga taccgcgags 1320

cccacgctca ccggctccao atttatcagc aataaaccsg ccagccggaa gggccgagcg 1380

cagaactggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaaac 1440tagagtaagt agttcgccag ttaatsgttt gcgcaacgtt gttgceattg ctacaggcat 1500cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcegc tccggttccc aacgatcaag 1560gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcgçtt agctccttcg gtcctccgat 1620cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatgacag cactgcataa 1680ttctcttact gtcatgccst ccgtaagatg cttttctgtg actggtcagt actcaaccaa 1740gtcattctga gaatagtota tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 1800taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcgga 1860gcgsaaactc tcaaggatct taccgctatt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 1920acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcatt tctgggtgag caaaaacagg 1980aaggcasaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 2040cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 2100atttgaatgt arttagsaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 2160qccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat 2220cacgaggccc 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Claims (20)

1. Microorganismo termofílico modificado parapermitir a produção aumentada de etanol, em que amodificação é a inativação do gene lactato desidrogenase deum microorganismo termofilico do tipo selvagem, onde o genede lactato desidrogenase nativo ou uma porção do mesmo foideletada.

2. Microorganismo, de acordo com a reivindicação-1, em que o microorganismo não compreende um sistema derestrição.

3. Microorganismo, de acordo com a reivindicação-1 ou 2, em que o microorganismo é da espécie geobacillus.

4. Microorganismo, de acordo com qualquerreivindicação anterior, em que o microorganismo égeobacillus thermoglucosidasius.

5. Microorganismo, de acordo com qualquerreivindicação anterior, em que o microorganismo é umformador de esporo.

6. Microorganismo, de acordo com qualquerreivindicação anterior, em que o microorganismo é estávelem um meio de cultura compreendendo até 30% (p/v) deetanol.

7. Microorganismo, de acordo com qualquerreivindicação anterior, em que o microorganismo podemetabolizar celobiose e/ou amido ou oligômero do mesmo.

8. Microorganismo, de acordo com qualquerreivindicação anterior, em que o microorganismo étransformável em freqüência elevada.

9. Microorganismo, de acordo com qualquerreivindicação anterior, em que o microorganismo cresce emuma temperatura de 40°C - 85°C, preferivelmente 50°C - 70°C.

10. Microorganismo, de acordo com qualquerreivindicação anterior, em que o microorganismo compreendeum gene pdc não nativo.

11. Microorganismo, de acordo com qualquerreivindicação anterior, em que o microorganismo compreendeum gene adh não nativo.

12. Microorganismo, de acordo com qualquerreivindicação anterior, em que o microorganismo nãocompreende um elemento de integração no gene de lactatodesidrogenase.

13. Microorganismo depositado como Número deacesso NCIMB 41275.

14. Método para a produção de etanolcompreendendo cultivar um microorganismo de acordo comqualquer reivindicação anterior sob condições apropriadasna presença de um açúcar C3, C5 ou Cê ou oligômero do mesmo.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, emque o método é realizado em uma temperatura entre 40°C - 70°C.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, emque a temperatura é de 52°C - 65°C.

17. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 14 a 16, em que o microorganismo é mantidoem uma cultura em um pH entre 4 e 7,5.

18. Plasmideo definido como pUB 190-Idh.

19. Microorganismo termofilico compreendendo oplasmideo de acordo com a reivindicação 18.

20. Alimento de animal, compreendendomicroorganismo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 13.