KR101035731B1 - 덱스트란수크라제를 생성하지 않는 류코노스톡 균주 및이를 제조하는데 사용한 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 덱스트란수크라제 활성을 코딩하는 유전자의 일부 폴리뉴클레오티드를 류코노스톡 시트륨 균주의 염색체에 삽입하는데 유용한 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 류코노스톡 속 균주, 상기 균주를 선발하는 방법 및 상기 균주의 산업적인 이용에 관한 것이다.

류코노스톡 시트륨, 덱스트란수크라아제, 상동서열 재조합, 덱스트란

Description

덱스트란수크라제를 생성하지 않는 류코노스톡 균주 및 이를 제조하는데 사용한 벡터{Leuconostoc lacking dextransucrase and vector for making and using the same}

본 발명은 덱스트란수크라제 활성을 코딩하는 유전자의 일부 폴리뉴클레오티드를 류코노스톡 시트륨 균주의 염색체에 삽입하는데 유용한 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 류코노스톡 속 균주, 상기 균주를 선발하는 방법 및 상기 균주의 산업적인 이용에 관한 것이다.

류코노스톡 시트륨은 이형 발효 유산균으로서 김치와 사우어크라우트 및 오이피클과 같은 야채 발효에서 초기 발효에 관여하면서 야채발효식품의 숙성과 맛에 관여하는 중요한 미생물로 알려져 있다(Han HU, Lim CR, Park HK. Korean J. Food Sci. Technol . 22: 26- 32, 1990; Plengvidhya V, Breidt F Jr, Lu Z, Fleming HP. Appl Environ Microbiol . 73(23):7697-702, 2007). 류코노스톡 속은 발효과정에서 향기성분을 생성하고 젖산, 초산 이산화탄소, 만니톨과 같은 매우 다양한 성분을 생산하여 현재 많은 발효식품에서 스타터로 이용되고 있다. 특히 본 미생물은 설탕(sucrose) 존재시 덱스트란수크라제(EC 2.4.1.5)를 분비한다. 덱스트란수크라제 는 글루코실트란스퍼라제의 일종으로서 수크로스(sucrose)를 이용하여 과당(fructose)을 유리하고 덱스트란(dextran) 이라는 점질의 다당을 생성한다. 설탕으로부터 덱스트란을 생산하는 이외에, 다른 당을 첨가할 경우 설탕의 구성당인 포도당을 다른 당에 전달하는 반응을 촉매하여 새로운 구조의 올리고당을 생성한다. 덱스트란수크라제는 류코노스톡 속과 스트렙토코코스 속 등으로부터 생성되며 세포 외로 분비된다. 스트렙토코코스 속이 생성하는 효소는 설탕이 없는 배지에서도 생성되는 반면, 류코노스톡 속은 설탕이 효소의 유도물질로 필요하게 된다. 가장 많이 연구된 류코노스톡 메센테로이데스 NRRL B-512F가 생성하는 덱스트란수크라제의 분자량은 약 180 kDa가 보고되고 있으며, pH 5.2, 28℃에서 최대 효소활성을 가지고 pH 4 이하에서는 대부분의 활성을 잃는다.

류코노스톡은 전통적으로 과거에서부터 식품의 소재로 사용되어 GRAS(Generally recognized as safe)로 분류되어 식품에 사용될 수 있고, 혐기성과 호기성 배지에서 모두 생육이 가능하며 생육속도도 대장균만큼 빠르다. 류코노스톡은 단백질 가수분해효소(protease)를 거의 분비하지 않으므로 생성된 단백질을 안정하게 분리할 수 있어 새로운 단백질 발현 시스템으로 개발될 수 있다. 최근에 이런 유익 미생물을 이용하여 효소나 백신의 전달체로서 류코노스톡을 이용하고자 하는 연구가 많이 진행되고 있지만 대장균과 같이 아직 효율적인 효소발현 시스템이나 확실한 염색체 삽입 체계 (integration system)가 구축되어 있지 않다. 또한 류코노스톡은 dextransucrase 효소 단백질을 세포질 외부로 배출하므로 본 효소의 signal peptide와 원하는 단백질을 융합시킬 때 외부로 배출시켜 생산할 수 있으 며, 덱스트란수크라제의 수크로스 인덕션시스템은 효소발현 조절에 유용하게 이용될 것으로 기대되어진다. 이런 류코노스톡의 특성과 더불어 전 발명에서 개발한 E. coli- Leuconostoc 셔틀벡터(공개번호 10-2005-0022669, 한국)를 이용하여 류코노스톡에서의 효율적인 효소발현 및 분비 시스템과 수크로스 인덕션 발현조절 시스템 개발이 가능하게 되었다. 이런 발현시스템을 가동하기 위해서는 효율적인 류코노스톡 숙주세포를 필요로 한다. 그러나 류코노스톡을 숙주세포로 이용하고자 할 때 수크로스 존재 시 덱스트란수크라제에 의해 덱스트란이 생성되기 때문에 효소발현시스템에서 생산하고자 하는 효소와 덱스트란의 분리를 어렵게 하고 숙주세포 자체에서 수크로스에 의해 덱스트란수크라제가 인덕션되고 시그날 펩타이드(signal peptide)를 이용해 세포 밖으로 분비하기 때문에 플라스미드를 이용한 수크로스 조절시스템과 효소발현분비시스템의 효율성을 저하시킬 수 있다. 또한 류코노스톡은 김치, 사우어크라우트와 같은 야채발효식품에 스타터로 이용되어지며 이런 야채발효식품에 설탕을 감미료로 첨가하였을 시 발효과정에서 덱스트란이 생성되면서 식품의 관능적 품질을 저하시키기도 한다. 때문에 수크로스 존재 시에도 덱스트란수크라제가 인덕션되지 않고 덱스트란수크라제를 분비하지 않으며 덱스트란을 만들지 않는 류코노스톡의 개발이 필요하며 이 목적을 달성하려면 류코노스톡 염색체에 들어있는 덱스트란수크라제 유전자를 파괴하여야 한다. 따라서 덱스트란을 생성하지 않는 류코노스톡 균주를 개발함으로써 류코노스톡을 보다 유용하게 효소나 백신생산의 세포공장으로 이용할 수 있게 되고 류코노스톡을 이용한 생명공학기술의 발전을 기대할 수 있을 뿐만 아니라 발효식품에 스타터로 이용 시 식품의 관능적 품질 을 제고할 수 있다.

효소를 인코딩하는 유전자를 파괴하는 전통적인 전략으로는 상동서열 재조합에 의한 유전자 제거이다. 이때 일반적으로 두 가지 형태의 플라스미드를 이용한다. 하나는 복제가 되지 않는 플라스미드를 이용하는 것인데 불활성화시키고자 하는 유전자의 부분서열을 가지고 있는 플라스미드는 형질전환 후 복제되지 않기 때문에 상동서열 재조합으로 인해 염색체에 플라스미드가 삽입된 균주만 선택배지에서 자라게 된다. 이런 방법은 형질전환효율, 염색체 삽입이 일어날 수 있는 빈도와 상동서열의 길이에 크게 의존하기 때문에 염색체 유전자 파괴가 일어날 수 있는 확률이 매우 낮다. 또 다른 형태의 플라스미드로는 선택적으로 복제가 되는 플라스미드인데 목표유전자의 부분서열을 플라스미드에 클로닝 후 숙주세포에 형질전환하여 일정 시간 동안 적정온도에서 계대배양 하면서 상동서열에 의한 염색체 삽입이 일어날 수 있는 확률을 높여준다. 다시 계대배양한 균주를 플라스미드가 복제되지 않는 조건으로(배양온도 42℃) 옮겨서 배양하면 균주에 들어있던 플라스미드는 제거되고 상동서열 재조합에 의해 염색체 삽입이 일어난 균주만 선택배지에서 자랄 수 있다. 이런 플라스미드를 이용하면 염색체 삽입균주의 선발이 쉽게 이루어질 수 있으나 류코노스톡은 최적 배양온도가 28℃이기 때문에 42℃에서의 성장이 늦거나 멈추게 되어 류코노스톡에는 적용하기가 어렵다. 류코노스톡에 적합한 조건적 복제가 일어나는 플라스미드는 아직 개발되어 있지 않은 실정이다.

플라스미드를 이용한 염색체삽입 외에 부위 특이적 재조합 시스템(site-specific recombination systems)인 Flp-FRT, Gateway(Invitrogen), ParA-res, TnpR-res, Cre-lox와 같은 시스템도 유전자를 삽입하는데 이용된다. 그러나 이런 시스템들은 대부분 그람 음성균에서 많이 이용되어 왔고 락토바실러스 등 일부 그람 양성균에서만 극히 제한적으로 이용되고 있는 실정이다.

류코노스톡에서 외래 폴리뉴클레오티드를 염색체에 삽입한 연구는 바이러스 유래의 transposase를 이용해 류코노스톡 균주의 염색체 DNA에 마커유전자를 무작위로 삽입하여 생체표식을 하고 혼합배양 도중에 생체표식을 검출하여 스타터 균주의 균체수를 모니터링한 것이 유일하다 (특허출원번호10-2007-0095468, 한국). 만약 transposase의 염색체 DNA로의 무작위적인 삽입작용을 이용해 덱스트란수크라아제를 불활성화시키고자 한다면 그 확률은 대단히 낮을 뿐더러 불활성화된 돌연변이균주를 얻어도 덱스트란수크라아제 외에 다른 유전자에도 무작위적으로 삽입되었을 수 있다. 이때 덱스트란수크라제 외에 다른 유전자도 파괴되어 발현이 중지되는 기타 부반응적 돌연변이가 동시에 일어날 수 있는 가능성이 있기 때문에 야생주의 생리적 특성을 크게 변화시킬 위험이 있다. 따라서, 무작위적 삽입방법이 아닌 덱스트란수크라제 유전자 부위 특이적인 삽입을 통하여 덱스트란수크라아제 유전자를 파괴하는 것이 바람직하다. 때문에 본 발명에서는 덱스트란수크라제 유전자를 파괴하기 위해서 부위 특이적 삽입방법을 이용하여 덱스트란 수크라제 유전자만 파괴함으로써 덱스트란을 생성하지 않으면서도 야생 균주가 가지고 있는 생리적 특성을 크게 변화시키지 않는 균주를 개발하고자 하였다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 류코노스톡 염색체의 덱스트란수크라제를 코딩하는 유전자를 파괴하는데 필요한 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터를 이용하여 류코노스톡 염색체의 덱스트란수크라아제가 파괴된 균주를 쉽고 빠르게 선발하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법을 이용하여 류코노스톡에서 덱스트란수크라아제가 불활성화된 덱스트란을 만들지 않은 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 덱스트란을 만들지 않는 류코노스톡 균주를 이용하여 고순도의 효율적 효소발현 및 분비시스템과 수크라제인덕션시스템을 구축하고자 외래효소를 류코노스톡에서 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 덱스트란을 만들지 않는 류코노스톡 균주를 스타터로 이용하여 덱스트란을 만들지 않는 발효식품을 만드는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

a) 류코노스톡 균주로부터 추출한 염색체 DNA를 주형으로 하여 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 덱스트란수크라제 유전자의 ORF 앞부분의 절편 777bp(서열번호 3)와 ORF 중간부분을 포함한 절편 991bp (서열번호 4)을 얻는 단계;

b) 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 절편을 제한효소로 처리하는 단계;

c) 도 1에 기재된 pLC4255 벡터를 제한효소로 처리하는 단계; 및

d) 상기 제한효소 처리된 절편과 제한효소 처리된 pLC4255 벡터를 결합반응을 수행하는 단계를 포함하는 류코노스톡 염색체의 덱스트란수크라제를 코딩하는 유전자를 파괴하는데 필요한 벡터의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머 서열은 서열번호 5 내지 서열번호 8의 프라이머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에 있어서, 상기 제한효소는 모든 제한 효소가 가능하나, 본 발명의 특정 실시예에서는 EcoRI, SacI, SmaI, XhoI, SalI, Hind III, XbaI, KpnI, BamHI 또는 PstI인 것을 사용하였으나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에 있어서, 상기 a) 단계의 류코노스톡 균주는 류코노스톡 시트륨인 것이 바람직하고, Leuconostoc citreum CB2567 균주(기탁번호: KACC91348P)인 것이 더욱 바람직하다.

또한 본 발명은 상기의 제조방법에 의하여 제조된 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은

a) 상기의 벡터를 류코노스톡 균주에 형질전환하는 단계;

b)상기 형질전환된 균주를 항생제가 포함된 배지에서 계대배양하여 덱스트란수크라아제 유전자가 파괴된 변이균주를 얻는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 류코노스톡 균주는 류코노스톡 시트륨 균주인 것이 바람직하며, 상기 항생제는 클로람페니콜 또는 에리스로마이신인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기의 변이 균주를 얻는 방법에 의하여 제조된 덱스트란수크라아제 유전자가 파괴된 변이균주 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 변이 균주를 유효성분으로 하는 덱스트란 다당류를 생성하지 않는 미생물 스타터를 제공한다.

이하, 본 발명을 설명한다.

본 발명은 E. coli - Leuconostoc 셔틀벡터에 류코노스톡 염색체 덱스트란수크라아제를 코딩하는 유전자의 서열 절편을 각각 증폭하여 삽입벡터에 클로닝 후 류코노스톡에 형질전환한다. 형질전환 균주는 플라스미드에 들어있는 마커로 선별하고 선발된 형질전환 균주는 항생제가 포함되지 않은 MRS 배지에서 계대배양한다. 이때 항생제 스트레스가 없는 배지에서 배양하게 되면 한편으로는 플라스미드 복제되면서 플라스미드에 들어있는 덱스트란수크라제 유전자 서열과 염색체 유전자 서열 사이에 상동서열 재조합이 일어나면서 염색체 덱스트란수크라제가 파괴되게 되며 상동서열 재조합이 일어난 변이 균주는 더 이상 덱스트란을 만들지 않게 된다. 다른 한편으로는 플라스미드 복제 안정성이 떨어지기 때문에 항생제 스트레스가 없는 배지에서 배양 시 염색체 삽입이 이루어 지지 않은 균주는 점차 플라스미드를 잃게 되고 따라서 항생제 내성을 잃게 된다. 때문에 계대배양을 거친 류코노스톡을 설탕이 들어있는 클로람페니콜 PES 배지에 도말하였을 때 염색체 삽입이 일어나 덱스트란수크라제가 파괴된 변이균주는 덱스트란을 만들지 못하고 하얀 콜로니로 자라나게 되며 투명한 점질물을 생성하는 야생균주와 형태학적으로 선별이 가능하게 되며 따라서 덱스트란수크라제가 불활성화된 류코노스톡 변이균주를 얻게 된다. 이런 염색체 유전자를 파괴시킨 변이균주의 선발방법은 복제되지 않는 삽입벡터를 이용했을 시 형질전환 효율, 유전자재조합 발생빈도에 크게 의존하고 발생확률이 낮은 문제점을 극복할 수 있고 조건적으로 복제되는 류코노스톡 플라스미드가 개발되지 않은 현 상황에서 류코노스톡과 대장균의 셔틀벡터를 이용하여 효과적으로 류코노스톡에서 복제가 이루어지면서 형질전환 효율과 관계없이 염색체 재조합발생빈도를 높임과 동시에 쉽고 빠르게 덱스트란수크라아제가 불활성화된 균주를 선발하는 방법이다. E. coli - Leuconostoc 셔틀벡터에 베타갈락토시다제(β-galactosidase) 클로닝 후 위에서 얻은 덱스트란이 만들어지지 않는 류코노스톡 변이균주에 형질전환하여 이 변이균주에서 베타-칼락토시다제가 성공적으로 발현이 되는 것을 확인하였다. 또 이 변이균주를 스타터로 하여 설탕이 2% 첨가된 동치미를 제조했을 시 발효과정 중 점질물이 생성되지 않아 동치미의 관능적 특성을 높일 수 있었다.

본 발명을 통해 류코노스톡 염색체에서 덱스트란수크라제가 파괴된 변이균주를 제조하는 쉽고 빠른 방법을 개발하였다. 이는 류코노스톡에서 염색체 삽입에 의해 유전자를 불활성화 시킨 첫 번째 시도이며 이런 형태학적 선별방법을 통해 외래 유전자를 염색체의 덱스트란수크라제 프로모터 뒤에 삽입하여 삽입균주를 쉽게 확인 가능하며 이렇게 얻어진 변이균주는 덱스트란스트란수크라제의 프로모터를 이용하여 외래유전자를 류코노스톡에서 보다 안정적으로 발현시킬 수 있을 것으로 보인 다.

본 발명을 통해 얻어진 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567은 덱스트란수크라제가 가지고 있었던 분비시스템과 수크로스 인덕션 발현조절 시스템을 구축하고 이용하는데 효율적인 숙주세포로 간주되어지며 또 류코노스톡 속 식품용 소재 또는 의약용으로 이용되는 단백질을 안정적으로 발현시킬수 있는 효율성 높고 편리한 류코노스톡 숙주세포로 이용될 수 있다.

또한 발효식품에 덱스트란을 생성하지 않는 스타터 균주로 이용되어 발효식품의 품질제고에 기여할 것으로 기대된다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 유전형질 전환용 숙주균주 ( Leuconostoc citreum CB2567 ) 선발

본 발명에서는 위 기술을 구현하기 위하여 김치에서 분리된 류코노스톡 시트륨 CB2567(기탁번호: KACC91348P)을 숙주세포로 선발하였다(2008년 1월30일 대한민국 경기도 수원시 소재 농업생명공학연구원 기탁). 본 균주는 본 연구실에서 보유중인 30개 동일 균주에서 전기충격법(electroporation)으로 pLeuCM 셔틀벡터(대한민국 특허등록번호 10-0721140)를 이용하여 형질전환시, 일반적으로 류코노스톡 균주의 전기충격 형질전환율이 낮은 반면 (10¹ - 10²cfu/μg plasmid) 본 균주는 상대 적으로 높은 형질전환율을 보인 균주로써(10⁴ - 10⁵cfu/μg plasmid), 고효율로 손쉽게 외부 유전체를 형질도입하기에 적절한 균주로 선발되었다. 류코노스톡 시트륨 CB2567 균주의 컴피턴트 세포는 다음과 같이 제조하였다. 류코노스톡 균주를 50mL의 MRS에서 OD₆₀₀가 0.5가 될 때까지 배양한 후 4℃, 6,000rmp에서 10분간 원심분리하고, 25ml ice-cold 증류수로 2회 세척하였다. 이때 균체의 회수률이 급격히 감소하므로 신속하게 처리해야 한다. 이 회수한 균체를 5ml ice-cold EPS(EPS: 1mM K₂HPO₄ KH₂PO₄, pH7.4, 1mM MgCl₂ 및 0.5M sucrose)로 1회 세척하고, 1ml ice-cold EPS에 현탁하여 전기충격법에 쓰일 류코노스톡 컴피턴트 세포(competent cell)를 제조하여 -80℃ deep freezer에 보관하였다. 류코노스톡 컴피턴트 세포 40ul와 셔틀벡터(1ug/ul) DNA를 큐벳에 옮기고 5분간 얼음에 방치하였다. 25uF, 8kV/cm, 400ohms 조건에서 pulse를 준 후, 즉시 1ml MRS 액체배지를 첨가하고 30℃에서 1시간가량 배양하였다. 10ug/ml 클로람페니콜이 포함된 MRS배지에 도말한 후 48시간 동안 30℃에서 배양하였다. 이틀 뒤 자란 콜로니로 형질전환 된 균주를 선발하였다.

실시예 2 : E. coli - Leuconostoc 셔틀벡터 pLC4255 구축

먼저 pCB42(류코노스톡에서 유래된 신규 플라스미드 및 이를 이용하여 제조된 셔틀 벡터; 대한민국 특허출원 2007-0086052)의 mini-replicon으로 추정되는 부분을 프라이머 32-For: AATTGGTACCATGAGTTTAATGCGCA(서열번호:1)와 32-Re: AATTGGTACCGTTCCATATTTGTTCC(서열번호:2)를 이용하여 증폭하였고, 제한효소 KpnI을 처리하고, 아가로스 겔을 통해 정제함으로써 replicon으로 추정되는 유전자 [mini-replicon(32)]를 얻었다.

다음으로 pEK104 벡터도 동일한 제한효소 KpnI으로 처리하고, 상기에서 얻은 replicon으로 추정되는 유전자 [mini-replicon(32)] 합성시켜 산물을 회수한 후, 대장균(E. coli) Top10에 삽입하여 형질전환시키고, 분리과정을 거쳐 pLC4255 벡터(서열번호 15)를 얻었다.

상기에서 설명한 실험의 전반적인 내용은 도 1과 같았다.

실시예 3: 류코노스톡 시트륨 염색체내의 덱스트란수크라제 유전자 프로모터 영역 클로닝과 중간절편 클로닝

(1) 염색체 DNA 준비

염색체 DNA는 바이오니아사의 AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit의 일부를 변형하여 이용하였다. 류코노스톡 시트륨 CB2567 균은 MRS 배지에 접종하여, 하룻동안 배양하고, 그 뒤에 13,000rpm에서 2분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 모은 세포는 TES (30 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.0) 용액으로 씻어준 후, 6.7% sucrose (50mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0) 용액 100 ul를 첨가하여 현탁하였고, 37℃에서 30분간 배양하였다. 여기에 lysozyme (10 mg/ml lysozyme, 25 mM Tris, pH 8.0) 용액 100 ul을 첨가하고, 다시 37℃에서 30분간 배양하였다. 다음부터는 프로토콜의 내용대로 실험하였고, 최종 50 ul의 정제물을 얻을 수 있었다.

(2) 덱스트란수크라제 유전자의 프로모터영역과 ORF 중 중간절편 클로닝

본 실시예에서는 미국 국립생물정보센터(NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov)의 뉴클레오티드 검색을 통하여 류코노스톡 시트륨 HJ-P4의 덱스트란수크라제 프로모터 (promoter)와 ORF 유전자 서열을 얻을 수 있었고, 프로모터 영역을 포함한 ORF 앞부분의 절편777bp(서열번호 3)와 ORF 중간부분을 포함한 절편 991bp (서열번호 4)를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 다음과 같이 제작하였다.

DSUs-BamHI-F: ATGGATCCCTCACTTTAACTATTGC(서열번호:5)

DSUs-BamHI-R: ATCGGATCCAATTGTCGATAAAATG(서열번호:6)

DSDs-PstI-F: ATCTGCAGAACTACATGTCTCAAAT(서열번호:7)

DSDs-PstI-R: ATCTGCAGTAGGCATGTTGTATTGT(서열번호:8)

DSUs-BamHI-F와 DSUs-BamHI-R은 BamHI, DSDs-PstI-F와 DSDs-PstI-R에는 PstI의 인지부위를 포함하고 있다. 실시예3 (1)에서 만들어진 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR를 수행하였고, 반응 혼합물 (50 ul)은 Taq DNA 중합효소 0.5 ul, 10X buffer, 250 uM dNTPs, 프라이머로 구성되었다. PCR 조건은 변성 94℃, 5분, 표준 PCR 30 주기(94℃, 30초, 55℃, 30초, 72℃, 3분) 및 최종반응(72℃, 5분)이었다. 프라이머 DSUs-BamHI-F와 DSUs-BamHI-R을 이용해 서열번호 3의 절편 DSUs를 얻었고 DSDs-PstI-F와 DSDs-PstI-R을 이용해 서열번호 4의 절편 DSDs를 증폭하였다. PCR 후 바이오니아사의 PCR purification kit를 사용하여 정제하였고, DSUs에 BamHI 처리를, DSDs에 PstI처리를 하였다. 또한 pLC4255는 먼저 BamHI 제한효소로 처리하고, 겔 purification kit를 이용하여 정제한 후 알칼라인 포스파타제를 사용하여 탈인산화반응을 시켰다. 이렇게 준비한 벡터 DNA 1uL, 위에서 얻은 DSUs DNA 3uL, T4 DNA 라이게이즈(TaKaRa) 0.5uL, 완충용액 1uL에 증류수 5.5uL를 채워 총 부피를 10uL로 한 후 16℃에서 12시간 반응을 결합 반응을 수행하였고, 이를 대장균 MC1061에 삼브룩 등의 방법(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn, 1989)으로 형질전환시켰다. 50ug/ml 암피실린(ampicillin)이 첨가된 LB 플레이트에 도말하여 형질전환균주를 분리하고 플라스미드를 분리정제하여 pLC42DSUs를 얻었다. 이 벡터를 다시 PstI 제한효소로 처리하고, 겔 purification kit를 이용하여 정제한 후 알칼라인 포스파타제를 사용하여 탈인산화반응을 시켰다. 이렇게 준비한 벡터 DNA 1uL, 위에서 얻은 DSDs DNA(베타-갈락토시다제) 3uL, T4 DNA 라이게이즈(TaKaRa) 0.5uL, 완충용액 1uL에 증류수 5.5uL를 채워 총 부피를 10uL로 한 후 16℃에서 12시간 반응을 결합 반응을 수행하였고, 이를 대장균 MC1061에 위와 같은 방법으로 형질전환시켰다. 50ug/ml 암피실린(ampicillin)이 첨가된 LB 플레이트에 도말하여 형질전환균주를 분리하고 플라스미드를 분리정제하여 pLC42DSIT(서열번호 16)를 얻었다 (도 2).

실시예 4: 류코노스톡 시트륨 CB2567 에 형질전환

실시예 3에서 제조한 pLC42DSIT벡터를 류코노스톡 시트륨 CB2567에 형질전환 시켰다. 류코노스톡 시트륨 CB2567 균주의 컴피턴트 세포는 다음과 같이 제조하였다. 류코노스톡 균주를 50mL의 MRS에서 OD₆₀₀가 0.5가 될 때까지 배양한 후 4℃, 6,000rmp에서 10분간 원심분리하고, 25ml ice-cold 증류수로 2회 세척하였다. 이때 균체의 회수률이 급격히 감소하므로 신속하게 처리해야 한다. 이 회수한 균체를 5ml ice-cold EPS(EPS: 1mM K₂HPO₄ KH₂PO₄, pH7.4, 1mM MgCl₂ 및 0.5M sucrose)로 1회 세척하고, 1ml ice-cold EPS에 현탁하여 전기충격법에 쓰일 류코노스톡 컴피턴트 세포(competent cell)를 제조하여 -80℃ deep freezer에 보관하였다. 류코노스톡 컴피턴트 세포 40ul와 셔틀벡터(1ug/ul) DNA를 큐벳에 옮기고 5분간 얼음에 방치하였다. 25uF, 8kV/cm, 400ohms 조건에서 pulse를 준 후, 즉시 1ml MRS 액체배지를 첨가하고 30℃에서 1시간가량 배양하였다. 10ug/ml 클로람페니콜이 포함된 MRS배지에 도말한 후 48시간 동안 30℃에서 배양하였다. 이틀 뒤 자란 콜로니로 형질전환된 균주를 선발하였다.

실시예 5:. 계대배양

실시예 4에서 선발된 형질전환 균주를 항생제가 포함된 MRS broth에서 계대배양하면서 하루에 10 plate씩 10ug/ml 클로람페니콜을 포함한 PES (Penylethyl alcohol sucrose agar; tryptone 5g, yeast extract 0.5g, sucrose 20g, ammonium sulfate 2g, dipotassium phosphate 1g, magnesium sulfate 0.244g, phenylethyl alcohol 2.5ml, agar 15g/D.W. 1L)플에이트에 한 플레이트당 150~200개 콜로니가 분포하도록 도말하였다. 이 때 계대배양하는 과정에서 형질전환된 pLC42DSIT 플라스미드는 계속 복제되면서 숙주세포 염색체의 덱스트란수크라제 유전자의 상동서열과 재조합이 일어날 수 있는 확률을 높여준다. 한편 pLC42DSIT 플라스미드를 포함 한 숙주세포는 항생제 스트레스가 없는 배지에서의 계대배양과정에서 점차 플라스미드를 잃어버리게 되며 나중에 배양액을 클로람페니콜이 포함된 PES 배지에 도말하였을 때 염색체 삽입이 일어나지 않은 숙주세포는 플라스미드의 소실로 인해 살아남을 수 있는 확률이 점점 낮아진다.

실시예 6: 덱스트란수크라아제 유전자가 파괴된 변이균주의 선발

실시예 5와 같이 계대배양하는 과정에서 플라스미드 복제과정 중 플라스미드와 염색체사이의 상동서열에 의해 염색체내에서 상동서열 재조합이 일어나 플라스미드 DNA가 염색체로 삽입되면 ( 도3) 염색체상의 덱스트란수크라제 유전자는 파괴되며 덱스트란수크라제가 발현되지 않으면서 균주는 변이를 일으키게 되고 덱스트란은 더 이상 생성되지 않는다. 투명한 점질물이 생성되는 형질전환 세포에 비해 변이를 일으킨 균주는 하얀 콜로니를 형성해 형태학적으로도 변이균주인 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567을 쉽게 확인하고 선발할 수 있었다(도 4).

류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567는 2008년 7월 2일 대한민국 경기도 수원시 소재 농업생명공학연구원에 기탁번호 KACC 91388P로 기탁하였다.

실시예 7: 선발 변이균주 류코노스톡 시트륨 CBM -D 2567의 확인

(1) PCR 확인

덱스트란 수크라제가 벡터에 삽입된 것을 확인하기 위하여 플라스미드에 들어있었던 클로람페니콜 유전자와 염색체 덱스트란수크라제에 들어있던 유전자 서열을 포함한 프라이머를 아래와 같이 제작하고 변이균주의 genomic DNA를 실시예3(1) 의 방법으로 분리한 후 이를 주형으로 하여 증폭하였다.

CM-F : TTCTCGGCATAAATGCGTGGTCTA(서열번호:9)

DS-R : TTGATGGCATCAAAATAAGGGGAC(서열번호:10)

도에서 보여주듯이 변이균주 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567에서는 1.2kb 절편이 증폭되었지만 류코노스톡 시트륨 CB2567에서는 증폭되지 않은 것을 확인할 수 있었다. 이는 염색체의 덱스트란수크라제 유전자속으로 성공적으로 삽입되어 덱스트란수크라제 유전자가 성공적으로 파괴되었음을 말해준다.

(2) TLC 분석과 덱스트란 정량

배지에 들어있는 탄수화물이나 다당류의 영향을 제거하기 위해서 MRS 배지조성을 변화시킨 casamino acid 수크로스배지에서(1L에 casamino acid 25g, sucrose 20g, polysorbate 80 1g, ammonium citrate 2g, sodium acetate 5g, magnesium sulfate 0.1g, maganese sulfate 0.05g, dipotassum phosphate 2g, L-cystein.HCL 0.5g을 포함) 류코노스톡 시트륨 CB2567과 변이균주 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567을 30℃에서 30시간 이상 배양하였다. 상등액을 취해 UI-Qader의 방법에 따라 덱스트란 함량을 측정하였다( UI-Qader et al. Turk J Biochem. 31(1) : 21-26, 2005). 먼저 상등액에 에탄올을 1:1(v/v) 비율로 천천히 넣어주고 5~10분 동안 방치한다음 원심분리하고 상등액은 위의 과정을 두 번 더 반복한다음 침전물을 합쳐 건조시키고 건조량을 측정한다. 균주마다 5반복을 실시하여 측정한 결과 류코노스톡 시트륨 CB2567 균주는 배양액 1L당 7.26g의 다당을 생성하였고 변이균주 류코노 스톡 시트륨 CBM-D 2567은 배양액에 casamino acid 수크로스 배지(Blank)와 동일한 함량의 다당함량을 나타내어 덱스트란을 생성하지 않는 것으로 확인되었다.

또한 시간에 따른 수크로스 소비량과 덱스트란 생성량을 비교하기 위해 배양시간별 배양액의 TLC 분석을 실행하였다. TLC 분석은 다음과 같은 순서로 실행하였다. TLC plate(WHATMAN)에 균주배양액을 시간대별로 1ul 씩 spot하였다. 전개용매 (acetonitrile:water=85:15)에 전개시킨 후 드라이어로 건조시키는 것을 각각 4회 반복하였다. 발색시약(0.5% , 5% H₂SO₄ 을 에탄올에 용해)에 담갔다 꺼내어 드라이로 충분히 말린 후 100~110℃ 오븐에서 가열 후 검출된 것을 확인하였다. 도6에서 보여지다 싶이 류코노스톡 시트륨 CB2567 균주는 배양 12시간이 지나서 수크로스를 전부 소비하고 9시간대부터 덱스트란을 생성하는 반면 변이균주는 수크로스를 완전히 소비하지 못하고 남아있으며 배양과정 중에 덱스트란이 생성되지 않는 것을 확인할 수 있었다.

(3) 전자현미경 사진

2% 수크로스 배지에서 배양한 류코노스톡 시트륨 CB2567과 변이균주 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567을 Moonmangmee 등(Moonmangmee et al, J Biosci Bioeng . 93: 192-200, 2002)의 방법에 따라 전처리 후 scanning electron microscopy를 진행하였다. 균주배양액을 9,000×g에서 10분간 원심분리하고 침전된 세포는 50mM KPB(pH6.5)용액으로 세척하고 2.0% glutaraldehyde (TAAB Laboratories Equipment Ltd., Berks, UK)가 들어있는 같은 버퍼용액으로 맞춘 후 셀을 50~100% 에탄올로 점진 세척하고 critical point 건조 기술을 이용하여 건조 후 금으로 코팅하고 전자현미경으로 30KV로 관찰하였다. 도 7의 전자현미경 사진에서 알 수 있는 바와 같이 류코노스톡 시트륨 CB2567은 배양과정에서 생성된 다당류와 같은 무정형 물질에 의해 세포표면이 덮여있음을 관찰할 수가 있고 변이균주 류코노스톡 CBM-D 2567은 다당류에 덮여있지 않은 것을 확인할 수가 있다.

실시예 8. 변이균주의 생육특성

(1) MRS 배지와 수크로스 배지에서의 성장곡선

류코노스톡 시트륨 CB2567과 변이균주 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567을 각각 MRS와 글루코스대신 수크로스가 첨가된 MRS 배지에 접종하여 30℃에서 배양하면서 배양액을 시간별로 PES 배지에 도말하여 30℃에서 24시간 배양 후 생육균수를 계수하였다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이 MRS 배양액에서 두 균주는 비슷한 성장패턴을 나타내었으나 수크로스 배지에서는 변이균주가 긴 유도기가 필요하고 최종 성장은 야생균주에 비해 약간 감소한 것으로 나타났다.

(2) 생화학적 특성

류코노스톡 시트륨 CB2567과 변이균주에 대한 생화학적 특성을 알아보기 위하여 API kit(bioMerieux, Germany)를 이용해 49종류의 당 test를 진행하여 미생물 대사를 분석하였다. 유산균 동정에 많이 이용되는 API 50CHL kit를 이용하였다. 먼 저 두 균주를 MRS Broth에 접종하여 37℃, 48시간 혐기배양한다. 1ml 당 OD₆₆₀에서 1이 되도록 맞춘 후 원심분리 하여 pellet을 모은다. Kit의 유리앰플에 담겨 있는 CHL medium 5ml와 잘 섞는다. 피펫을 사용하여 부유액을 strip(배양 중 건조를 방지하기 위해 배양틀의 바닥에 물을 넣음)에 약 200ul 정도 넣는다. 접종이 끝난 후 무든 tube에 mineral oil을 가득 채운다. Strip의 뚜껑을 덮고 30℃에서 48시간 배양한다. 배양 후 결과 판독은 색깔이 블루에서 노랑색으로 변하면 양성(+), 아니면 음성(-)으로 표기하였다. 미생물의 당대사 분석 결과 변이균주와 야생균주 사이의 당대사 차이는 없는 것으로 나타났다.

(3) 대사산물 분석

류코노스톡 시트륨 CB2567과 변이균주를 탄소원을 제외한 MRS 배지 조성에 각각 2% 글루코스(glcMRS), 2% 수크로스(sucMRS), 1% 수크로스와 말토스(malsucMRS)를 포함한 배양액에서 배양하여 발효과정에서 생성되는 유기산과 만니톨 함량을 측정하였다. 배양액은 0.45um 필터로 여과 후 적정 농도로 희석하여 HPLC로 유기산 농도와 만니톨 함량을 측정하였다.

유기산 분석조건은 다음과 같다.

Pump: YOUNG-LIN Acme 9000 Solvent Mixer Gradient Pump

M930 Solvernt Delivery Pump (영린기기, 한국)- Isocratic Mode

Detector: YOUNG-LIN M720 Absorbance Detector (Younglin)

파장:254nm

사용칼럼:Aminex HPX-87 Ion Exclusion Column(7.8mmID×300mm, Bio-Rad, 미국)

이동용매: 0.004N H₂SO₄

유속: 0.6ml/min

만니톨 분석조건은 다음과 같다.

Pump: YOUNG-LIN M930 Solvernt Delivery Pump, 영린기기, 한국

Detector: YOUNG-LIN ACME 9000 RI Detector, 영린기기, 한국

사용칼럼: Asahipak NH2P-504E (Column size 4.6mmID×250mm, Shodex, Japan)

이동용매: Acetonitrile:Water=75:25

유속:0.6ml/min

위의 조건으로 유기산과 만니톨 함량을 분석한 결과 1차 배양과 2차 배양에서 유기산과 만니톨 함량은 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다(도 10).

실시예 9: 에리스로마이신( erythromycin ) 내성유전자를 포함한 셔틀벡터 pLeuEM 제작

에리스로마이신 항생제 내성을 가지고 있는 셔틀벡터를 구축하기 위하여 이미 제작한 셔틀벡터인 pLeuCM을 클로람페니콜 내성유전자 대신 에리스로마이신 내성유전자를 삽입하고자 하였다. pLeuCM에 XbaI과 PstI으로 반응시켜 겔 정제한 후 알칼라인 포스파타제를 사용하여 탈인산화반응을 시켰다. 에리스로마이신 내성 유 전자를 증폭하기 위하여 아래와 같이 프라이머를 제작하였다.

Em-XbaI-F: AATTTCTAGAAGCTCGTGCTATAAT(서열번호:11)

Em-PstI-R: AATTCTGCAGACACGAAAAACAAGT(서열번호:12)

위 프라이머에는 XbaI과 PstI제한효소 인식부위를 포함한다. 증폭된 유전자는 XbaI과 PstI으로 처리, 겔 정제 후 위에서 처리한 벡터 DNA와 실시예 3(2)의 방법에 따라 클로닝 하고 형질전환 균주를 선발한후 플라스미드를 정제하여 대장균과 류코노스톡에서 모두 복제가 가능하고 에리스로마이신 내성을 가진 pLeuEM 벡터를 얻었다. (도11)에 pLeuEM 제작과정을 나타내었고 벡터 크기는 5442bp이다.

실시예 10. pLeuEM 셔틀벡터에 Lactobacillus plantarum 유래 베터-갈락토시다제 유전자의 클로닝 및 변이균주에서의 발현

실시예 9에서 만든 셔틀벡터에 외래의 단백질을 클로닝하였다. 베타 갈락토시다제 효소단백질은 일단 클로닝이 되면 형질전환체의 표현형으로 클로닝의 성공 여부 뿐 만아니라 발현 유무도 알 수 있으므로 가장 폭넓게 사용하는 유전자이다.

Lb . plantarum의 염색체 DNA는 실시예 2(1)의 방법에 따라 분리하였다.

이 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR를 수행하였고 사용된 프라이머는 다음과 같다.

Gal-For : AAATTGGATCCGTAGTTGTTGTCATTTAGT(서열번호:13)

Gal-Re : AATTGGATCCTTTAGAAATGAATGTTAAAGC(서열번호:14)

위의 두 개의 프라이머에는 BamHI 제한효소 사이트가 존재하고, PCR 반응물은 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR를 수행하였고, 반응 혼합물 (50 ul)은 Taq DNA 중 합효소 0.5 ul, 10X buffer, 250 uM dNTPs, 위의 프라이머로 구성되었다. PCR 조건은 변성 94℃, 5분, 표준 PCR 30 주기(94℃, 30초, 55℃, 30초, 72℃, 3분) 및 최종반응(72℃, 5분)이었다. PCR 후 바이오니아사의 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였고, BamHI 을 처리하였다. 또한 pLeuEM도 같은 제한효소로 처리하고, 겔 purification kit를 이용하여 정제한 후 알칼라인 포스파타제를 사용하여 탈인산화반응을 시켰다. 이렇게 준비한 pLeuEM 벡터와 삽입 DNA(베타-갈락토시다제)를 실시예3(1)의 방법에 따라 클로닝 하고 대장균 MC1061에 형질전환시켰다. 50ug/ml 암피실린(ampicillin)과 40mg/ml X-gal 용액 40ul가 첨가된 플레이트에 도말하여, 베타-갈락토시다제 활성을 갖는 푸른색을 띄는 콜로니로부터 당업계에서 공지된 방법으로 플라스미드를 분리하고, 이를 pLeuEMgal로 명명하였다. 실시예 4와 같은 방법으로 변이균주 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567의 콤페턴터 세포(competent cell)를 제조하여 앞에서 준비한 pLeuEMgal벡터를 전기충격법으로 형질전환 하였고, 형질전환체는 5ug/ml 에리스로마이신과 40mg/ml X-gal 용액 40㎕이 포함된 MRS배지에 도말한 후 48시간 동안 30℃에서 배양하였다. 이틀 뒤 모든 콜로니에서 푸른색을 확인하였고, 변이균주를 숙주세포로 하였을 시 락토바실러스 유래 베타 갈락토시다제가 성공적으로 발현되었음을 입증하였다(도 12).

실시예 11. 류코노스톡 시트륨 변이균주를 스타터로 이용한 동치미의 제조

무(800g)의 껍질을 벗기고 네 조각으로 자른후 4lL용량 김치통에 넣고 1% 소금을 붓고 1%의 설탕을 넣은 후 전 배양한 류코노스톡 시트륨 CB2567(대조군)과 변 이균주를 각각 전체 중량의 0.01% 접종하여 20℃에서 12시간 정치하였다. 마늘(10g)과 생강(3g)을 곱게 다져 넣고, 쪽파(20g)는 크게 잘라 넣은 후 4L의 물로 채우고 뚜껑을 닫은 다음 10℃에서 발효시켰다.

결과 발효 30일 동안 변이균주를 스타터로 첨가한 동치미는 대조군에 비해 점질물이 생성되지 않아 오랜 배양 후에도 높은 관능적 품질을 유지할 수 있었다.

도 1은 플라스미드 pCB42의 mini-replicon과 대장균 벡터인 pEK104로 셔틀벡터 pLC4255를 형성하는 방법을 설명하는 도면이다.

도 2는 pLC4255를 클로닝용 벡터로 이용하여 덱스트란수크라제 유전자의 앞부분을 이 벡터의 BamHI 사이트에, 덱스트란수크라제 유전자의 ORF 일부분을 PstI 사이트에 각각 클로닝하여 상동서열 재조합을 일으킬수 있는 벡터로 만든다. 만들어진 이 재조합용 벡터를 Leuconostoc citreum CB2567 균주(기탁번호: KACC91348P)에 형질 전환하고 계대배양하면서 상동서열 재조합을 일으켜 염색체 DNA의 덱스트란수크라제 유전자가 파괴되고 덱스트란수크라제가 불활성화된 변이균주를 얻는 과정을 보여주는 것이다.

도 3은 상동서열 재조합에 의해 염색체 내 덱스트란수크라제가 불활성화되는 과정을 보여주는 것이다.

도 4는 클로람페니콜이 들어있는 PES배지에서 덱스트란이 만들어 지지 않는 변이균주 Leuconostoc citreum CBM-D 2567의 선별과정을 말해준다. 염색체에서 상동서열 재조합변이를 일으키지 않은 균주는 수크로스가 존재하는 배지에서 투명한 점질물의 콜로니를 형성하고 변이균주는 점질물을 형성하지 않은 것을 보여준다.

도 5는 덱스트란 수크라제가 벡터에 삽입된 것을 확인하기 위하여 선발 변이균주 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567의 genomic DNA를 주형으로 하여 플라스미드에 포함된 클로람페니콜 유전자와 염색체 덱스트란수크라제에 들어있던 유전자 서열을 포함한 프라이머로 증폭하여 1.2kb 절편이 증폭된 것을 확인한 결과이다.

도 6은 수크로스를 넣은 casamino acid 배지에서 류코노스톡 시트륨 CB2567과 변이균주 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567의 시간에 따른 수크로스 소비량과 덱스트란 생성량을 비교하기 위한 배양시간별 배양액의 TLC 분석결과이다.

도 7은 2% 수크로스 배지에서 배양한 류코노스톡 시트륨 CB2567과 변이균주 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567의 전자현미경 사진이다.

도 8은 MRS 배지와 수크로스 배지에서의 류코노스톡 시트륨 CB2567과 변이균주 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567의 성장곡선을 나타낸 것이다.

도 9는 류코노스톡 시트륨 CB2567과 변이균주 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567의 49종류의 당에 대한 대사를 비교한 결과이다.

도 10은 류코노스톡 시트륨 CB2567과 변이균주 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567의 탄소원을 달리한 MRS 배지에서의 대사산물에 대한 분석결과이다.

도 11은 에리스로마이신 내성유전자를 포함한 대장균과 류코노스톡 셔틀벡터 pLeuEM 제작과정을 보여준다.

도 12는 pLeuEM 셔틀벡터에 Lactobacillus plantarum 유래 베터-갈락토시다제 유전자를 클로닝 후 변이균주 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567에 형질전환하여 락토바실러스 유래 베타 갈락토시데즈가 성공적으로 발현되었음을 보여주는 것이다.

<110> CHUNGBUK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Leuconostoc lacking dextransucrase and vector for making and using the same <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 32-For <400> 1 aattggtacc atgagtttaa tgcgca 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 32-Re <400> 2 aattggtacc gttccatatt tgttcc 26 <210> 3 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment <400> 3 ctcactttaa ctattgctgg ttttttgagt aaaactaatc aaccacgtcg caccataatt 60 taaaaaacca ctagcaaaca ctaataaagg tatatcgata ggtaatggtt tttgaagtat 120 catgtccaaa tacagtatga tgacaatagg tgttaaaaca aaatacagac gaccaatggc 180 cggactgata taataaaaca ccaaaatagc gagtaaataa tataaataga tattaccaaa 240 tactaattta gagacagata ataagctata tattgatggc aaaaacacca caaccgtaat 300 caattgccaa accaacgtat taggtttctc cagaaaattt aaaattgtca atactttgat 360 gcctaagcca ataaccattg tcgataatat caaggtacta attattaccg tccacatagg 420 tcctcccaaa 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tctggagaaa cctaatacgt tggtttggca attgattacg gttgtggtgt 5460 ttttgccatc aatatatagc ttattatctg tctctaaatt agtatttggt aatatctatt 5520 tatattattt actcgctatt ttggtgtttt attatatcag tccggccatt ggtcgtctgt 5580 attttgtttt aacacctatt gtcatcatac tgtatttgga catgatactt caaaaaccat 5640 tacctatcga tataccttta ttagtgtttg ctagtggttt tttaaattat ggtgcgacgt 5700 ggttgattag ttttactcaa aaaaccagca atagttaaag tgagtttgga tccccgggta 5760 ccatgagttt aatgcgcact tacactccac ttctaaaatg gagttgtttg cgctcaaaaa 5820 tatgtatcag aagtcgctgt tatcgacaac ttgaaaaaca acaaaagttc ttgttgcgag 5880 catactatgt gtggtcacac atgaggtaaa aatatatcta aattgatatg tttttgtttg 5940 ggaaattccc aatccctttt ttaattaaaa tcaattttga taagcggacg gttgatgaac 6000 gaaaaatact aacaaacaaa acggacgcta taaaagtact attagaaaac tatttaaata 6060 acctttgcca gaatcctttc tttggctgat ttctttttct tgatctcaat taggggttat 6120 tgtctctgta tctttttctt taattcgtga ttttaaataa ttaattaaac catctttttc 6180 agctagttgt tgcgctgtaa aagtgtcaac atagttactt gaagttgact ttttgggttt 6240 acgtttgttt gacactaaaa gttgccattc tttatcggtg aatgactttt tagataaatc 6300 tatattaagg cgtttagcct ttctatttaa ggcttgacga gatatttcta gttcgtctgc 6360 tatcgcgata atggtatcaa attcgtgtgt catcagtctc tccaaacgta aacttaagcg 6420 atgtaaagtt tacgttctaa gtttactata ttgttgacgt tttaagttta ctatattgtt 6480 gacgttttaa gttggtcgtt taattattaa aacataagat tatttgtttg tttattgtca 6540 tgtatagttc ttaatgctat actcatatca acatttaaat acaaataaaa agacctcaac 6600 ccctgcaagg gttaggactt ggtgacctag atattacaac tatcagggtt ttgccattac 6660 agaattagac ctctgcaatg gcttagaata cttactatta tacaaactta tagactcaga 6720 gtaaacagct ttactcaaaa aagaactata aacgactatg aaagcgtatc ctccagccta 6780 actaagcacg aggatacgct ttttacgtct gttcaatcgt tgtcggacgt tatcctaaca 6840 actaatacgg aacaggcgtg tatccgtcaa gagggctgaa aggtcgtcta aaccacgtcc 6900 aaagcaatca aagcgagatt gtggggatga acaattcgat tagggtaggc tcgcccgcaa 6960 gtaattggca aagaagtggc atatagaatt agcctctata tggtttaaat cgcatataaa 7020 gcgatttaag cggtgtctga cgtgttctaa ccttattgac ttataaaagt aagggtttct 7080 attggcagac gatagaagag aaattagagc gatatacgtg gttgatacaa gcgatatgat 7140 tctgaattat accttgaaca atcttaaaag tcctaaatac ttagggcttt ctctgctcaa 7200 atcaaactga ttgcccttgt tatcattgct aaatgaacaa tgcaagaaat atttgctaga 7260 aataaatttg ttgtcaaagt aatataatgg cgtaggaagg gaacaaatat ggaacggtac 7320 cgagctc 7327

Claims (13)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 류코노스톡 염색체의 덱스트란수크라제를 코딩하는 유전자를 파괴하는데 필요한 서열번호 16에 기재된 염기서열을 가지는 벡터 pLC42DSIT.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 제8항의 벡터를 류코노스톡 균주에 형질전환하여 제조된 덱스트란수크라아제 유전자가 파괴된 변이균주 류코노스톡 시트륨 CBM-D 2567(기탁번호 KACC 91388P).
13. 제 12항의 균주를 유효성분으로 하는 덱스트란 다당류를 생성하지 않는 미생물 스타터.

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