CN114395020B

CN114395020B - GmRALF1蛋白在促进植物对磷元素吸收中的应用

Info

Publication number: CN114395020B
Application number: CN202111676684.3A
Authority: CN
Inventors: 王金祥; 李方剑; 麦翠珊; 黄丽雅; 张亚楠; 邓雅茹; 吴丽霞
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114395020A

Abstract

本发明公开了GmRALF1蛋白在促进植物对磷元素吸收中的应用，本发明通过将大豆快速碱化因子GmRALF1基因作为目的基因构建可高效表达大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的基因工程菌，并在缺磷土壤中接种该菌，可以有效改善植物的缺磷症状，促进植物的根系生长，进一步提高植物对磷养分的吸收和对干物质的积累；同时证明了表达快速碱化因子GmRALF1的枯草芽孢杆菌相较于表达AtRALF23枯草芽孢杆菌在改善植物生长发育、提高植物磷养分吸收方面的效果更快、更强，表明大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白相比现有的拟南芥快速碱化因子RALF23蛋白能够更好的改善植物生长发育，提高植物磷吸收。

Description

GmRALF1蛋白在促进植物对磷元素吸收中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程及基因工程技术领域，更具体地，涉及GmRALF1蛋白在促进植物对磷元素吸收中的应用。

背景技术

磷是植物生长发育必需的营养元素之一，也是限制全球农作物产量的主要因素之一。通常土壤中植物可吸收的可溶性磷(PI)的浓度低于10μM，而土壤中其他植物不可直接利用的有机磷、不溶性磷含量却相对较高。

植物在适应低磷环境的过程中，进化出了一些适应低磷胁迫的功能。其中一种受低磷环境上调的快速碱化因子蛋白(RALF)在植物应对低磷胁迫，改善植物磷养分吸收方面具有重要意义。植物快速碱化因子(RALF)蛋白最早在烟草中被发现，在拟南芥和番茄中过表达RALF时，会导致培养基碱化及植物的根系发育受阻。目前研究表明，RALF蛋白在调节植物根系生长和花粉管发育方面起一定作用，但其具体作用机制尚不明确。植物界中RALF家族蛋白高度保守，RALF蛋白是小分子，平均长度为80-90个氨基酸。虽然RALF基因在植物中的功能还不完全清楚，但RALF蛋白包含关键的调节功能元件，如YISY基序，它是RALF与其可能的受体结合所必需的。近期研究表明，拟南芥AtRALF1可以通过调节植物根细胞尺寸来调节植物根系长度；也有人证明，RALF通过激活Feronia受体，导致Ser899处的细胞膜H-ATP2磷酸化，从而抑制拟南芥根细胞的伸长。总之，RALF蛋白在调节植物生长方面具有重要作用。目前关于枯草芽孢杆菌表达拟南芥快速碱化因子AtRALF23具有改善植物磷营养方面作用的研究已有结果，但是其他植物编码的快速碱化因子基因，尤其是农作物编码快速碱化因子基因方面还没有相关研究结果。关于大豆快速碱化基因GmRALF1的研究是空白，特别是关于GmRALF1在低磷胁迫方面的功能还未有研究报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白或其编码基因GmRALF1在促进植物对磷元素吸收中的应用。

本发明的第二个目的在于提供大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白或其编码基因GmRALF1在制备促进植物对磷元素吸收的制剂或基因工程菌中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种表达大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的基因工程菌，

本发明的第三个目的在于提供一种微生物肥料。

本发明的第四个目的在于提供所述基因工程菌或所述微生物肥料的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种提高植物对磷养分吸收的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明首先利用定量PCR检测了低磷条件下大豆快速碱化因子RALF家族的基因表达情况，明确了大豆快速碱化因子GmRALF1(Glyma.18G002500)显著受低磷上调表达。再以大豆快速碱化因子GmRALF1基因作为目的基因，以插入35S启动子的pBEs质粒作为表达载体，以枯草芽孢杆菌为表达宿主，构建了一种可高效表达大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的基因工程菌；然后把该菌接种到已在低磷土壤基质中生长7天的大豆和拟南芥根系上，发现该菌有效改善了大豆和拟南芥的缺磷症状，并提高了大豆和拟南芥干物质和磷营养的积累。同时证明了表达快速碱化因子GmRALF1的枯草芽孢杆菌相较于表达AtRALF23枯草芽孢杆菌在改善植物生长发育、提高植物磷养分吸收方面的效果更快、更强，表明大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白相比现有的拟南芥快速碱化因子RALF23蛋白能够更好的改善植物生长发育，提高植物磷吸收。

因此，本发明首先提供关于大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白或其编码基因GmRALF1的以下应用：

大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白或其编码基因GmRALF1在促进植物对磷元素吸收中的应用。

大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白或其编码基因GmRALF1在制备促进植物对磷元素吸收的制剂或基因工程菌中的应用。

本发明还提供一种快速表达大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的基因工程菌，是以大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的编码基因为目的基因构建基因表达载体，再转化宿主菌后构建得到。

优选地，所述大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，为大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白有效序列。

进一优选地，所述大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，所述宿主菌为枯草芽胞杆菌；所述序列是以GmRALF1密码子为基础进行优化，更易于其在枯草芽胞杆菌中进行表达。

优选地，所述表达载体为pBEs质粒。

进一步优选地，所述表达载体为插入35S启动子的pBEs质粒，核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

进一步优选地，所述重组表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

优选地，所述宿主菌为枯草芽孢杆菌RIK1285菌株。

本发明还提供上述任一所述快速表达大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的基因工程菌在制备微生物肥料中的应用。

本发明还提供一种微生物肥料，含有上述任一所述基因工程菌，所述微生物肥料接种在土壤基质中，可以有效缓解植物的缺磷症状，增加植物干物质和磷营养的积累量。

通过在缺磷土壤中接种上述快速表达大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的基因工程菌或微生物肥料，可以有效改善植物的缺磷症状，促进植物的根系生长，进一步提高植物对磷养分的吸收和对干物质的积累来改善植物生长发育状况，进而提高植物对磷元素的吸收利用，对提高一些缺磷土壤的生产力具有积极意义。

因此，本发明还提供任一所述快速表达大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的基因工程菌或微生物肥料在提高植物对磷养分吸收或在制备有机肥、土壤改良剂方面的应用。

本发明还提供一种提高植物对磷养分吸收的方法，是将上述任一所述快速表达大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的基因工程菌先在培养液中进行培养，得到种子液，再将种子液接种至植物生长的根际土壤中或将上述微生物肥料直接施用在植物生长的根际土壤中。

优选地，所述植物为大豆或拟南芥。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白或其编码基因GmRALF1在促进植物对磷元素吸收中的应用；本发明通过将大豆快速碱化因子GmRALF1基因作为目的基因构建基因工程表达菌，在缺磷土壤中接种该菌，可以有效改善植物的缺磷症状，促进植物的根系生长，进一步提高植物对磷养分的吸收和对干物质的积累；相比于之前发明的表达拟南芥快速碱化因子RALF23蛋白，大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白能更好的改善植物生长发育，提高植物磷吸收。

附图说明

图1为低磷条件下大豆(YC03-3)快速碱化因子GmRALF1基因的定量PCR结果，HP表示正常磷营养，500μm KH₂PO₄；LP表示低磷营养，25μm KH₂PO₄；Root表示从大豆的根提取的RNA，Leaf表示从大豆的叶提取的RNA；数据是3个生物学重复的平均值和标准误，星号代表2个磷水平间差异(Student’s T-test)，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，下同。

图2为重组质粒pBEs/GmRALF1的构建流程。

图3为pBEs/GmRALF1双酶切验证图谱，用Eco52I和XbaI双酶切电泳验证。

图4为重组菌B.subtilis/pBEs/GmRALF1表达的蛋白质杂交(WESTERN BLOT)鉴定结果。

图5为重组菌B.subtilis/pBEs/GmRALF1接种高磷和低磷(HP&LP)土壤基质生长30天拟南芥(哥伦比亚野生型)生长状态。pBEs表示土壤基质中接种pBEs空载的重组枯草芽孢杆菌；pBEs/GmRALF1表示土壤基质接种了表达GmRALF1蛋白的枯草芽孢杆菌，下同(图中标尺为2cm)。

图6为重组菌B.subtilis/pBEs/GmRALF1，B.subtilis/pBEs/AtRALF23和空载菌B.subtilis/pBEs接种高磷和低磷(HP&LP)土壤基质生长30天大豆(YC03-3)生长状态(图中标尺为10cm)。

图7为重组菌B.subtilis/pBEs/GmRALF1，B.subtilis/pBEs/AtRALF23和空载菌B.subtilis/pBEs接种高磷(HP)和低磷(LP)土壤基质不同天数大豆(YC03-3)的株高变化，图中不同字母表示不同处理间差异达显著水平(P<0.05)。

图8为重组菌B.subtilis/pBEs/GmRALF1，B.subtilis/pBEs/AtRALF23和空载菌B.subtilis/pBEs接种高磷(HP)和低磷(LP)土壤基质生长30天大豆(YC03-3)鲜干物质积累量。图中数据是4个生物学重复的平均值和标准误(Student’s t-test)，图中不同字母表示不同处理间差异达显著水平(P<0.05)。

图9为重组菌B.subtilis/pBEs/GmRALF1接种高磷和低磷(HP&LP)土壤基质生长30天大豆(YC03-3)可溶性磷总量。图中数据是4个生物学重复的平均值和标准误(Student’st-test)，图中不同字母表示不同处理间差异达显著水平(P<0.05)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

快速碱化因子RALF基因是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并构建的重组质粒载体pBEs/GmRALF1。湖南大学于峰教授馈赠B.subtilis/pBEs/AtRALF23菌株。各实施例中所用Trelief 5α菌株，由华南农业大学根系研究中心保存。

下述实施例中所涉及的试剂为：购自上海翌圣生物科技蛋白质分子量标记(Marker)、His标签(tag)、兔抗His标签多克隆抗体、碱性磷酸酶标记山羊抗兔抗体IgG(H+L)和DNA分子量标记(Marker)；购自天根生化科技(北京)有限公司的DNA凝胶回收试剂盒和PCR产物回收试剂盒。

下述实施例中所涉及的培养基及缓冲液为：

LB培养基(g/L)：酵母粉5克，蛋白胨10克，氯化钠5克，加入2％的琼脂即为LB固体培养基。

抗生素溶液：先将抗生素配置成浓度为100mg/mL的母液，然后用0.22μm的滤膜过滤除菌，用1.5mL离心管分装，置于﹣20℃保存。

磷酸钾缓冲液(PB，50mmol/L，pH为7.0)：取86mL的0.1mol/L的K₂HPO₄，加入14mL的0.1mol/L的KH₂PO₄，再加入100mL的水，调节pH至7.0。

下述实施例中所涉及的培养方法为：

种子液的制备：从卡纳抗性的固体培养基上，挑取重组菌(B.subtilis RIK1285.)单菌落，接种到LB液体培养基，37℃，200rpm摇床培养8h。

摇瓶发酵培养：以体积分数4％转接种子液于发酵培养基中，30℃，220rpm，培养48h。

Western-blot分析：采用10％的浓缩胶与15％的分离胶，转尼龙膜后孵育抗体，观测结果，并拍照。

实施例1 GmRALF1在不同磷水平的表达模式

1、方法

(1)大豆材料的种植和缺磷处理

a.种子消毒

将成熟、饱满的大豆种子单层排列在培养皿中，放入干燥器中，并将培养皿打开，盖子紧挨着培养皿。将100mL的次氯酸钠加至干燥器中的250mL烧杯中，然后沿着杯壁缓缓加入4.2mL浓盐酸，立即密闭干燥器，静置10小时。从干燥器中拿出后去除过多的氯气。

b.催芽

将消毒后的种子点入湿润的石英砂中催芽萌发。

c.移苗

一周后两叶一心状态时选择长势正常、一致的幼苗移栽至水培系统，于温室中用1/2大豆营养液培养。

d.处理

一周左右待第一片三出复叶完全展开后进行处理：低磷(LP：25μM)、高磷(HP：500μM)，每个处理5个生物学重复。每周换一次营养液，每3天调一次pH。

e.采样

对处理后14天的根、叶采样，液氮冷冻，-80℃保存。

(2)总RNA的提取

参照TRIzo1一步法分离总RNA。取0.2g样品放入预冷的研钵中磨成粉末状，转至1.5mL离心管，加入1mL TRIzo1提取液，剧烈震荡混匀，室温静置5分钟；加入0.2mL氯仿，剧烈晃动，室温静置2～5分钟，4℃下12000rpm离心15分钟；取上清液转入新管，加入0.5mL异丙醇，室温放置10分钟，4℃下12000rpm离心5分钟，倒掉乙醇，风干沉淀，加入DEPC水溶液；最后测量OD值，来确定RNA的纯度和浓度。

(3)实时荧光定量PCR引物设计

从Phytozome网站下载大豆(Glycine max Wm82)快速碱化因子GmRALF1基因(Glyma.18G002500)家族的基因序列(SEQ ID NO.1)、转录本序列(SEQ ID NO.1)和CDS序列(SEQ ID NO.2)并设计其特异的定量扩增引物，见表1。

表1定量PCR引物

(4)实时荧光定量PCR样品的制备及分析

用DNaseI处理总RNA以移除基因组DNA的污染，按逆转录酶说明书将RNA反转成第一条链。将所得第一链稀释100倍后作为定量PCR反应模板。将适量cDNA原液按梯度稀释后作为标准曲线的模板。反应体系及反应条件分别见表2和表3

表2定量PCR反应体系(总体积20μL)：

表3定量PCR反应条件

用Rotor-Gene的Real-Time Analysis Software 6.0计算每个样品的表达量。

低磷条件下大豆，快速碱化因子GmRALF1基因的定量PCR结果如图1所示，结果表明大豆叶部和根部的快速碱化因子GmRALF1(Glyma.18G002500)显著受低磷上调表达。

实施例2：重组质粒的构建

在Phytozome网站下载(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/#)大豆(Glycinemax Wm82)GmRALF1蛋白序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；保留GmRALF1蛋白有效序列SEQ ID NO.4，将蛋白序列翻译成枯草芽孢杆菌可识别的脱氧核糖核苷酸序列SEQ IDNO.5并构建重组质粒pBEs/GmRALF1(构建过程如图2，pBEs质粒序列如SEQ ID NO.6所示，重组质粒pBEs/GmRALF1的序列如SEQ ID NO.7所示)。将得到的重组质粒分别转化Trelief 5α，经过氨苄抗性平板筛选，从阳性转化子中提取质粒，分别利用Eco52I和XbaI双酶切电泳验证(验证结果如图3)，凝胶电泳条带与目的基因大小一致，将验证正确的基因测序，与目的序列比对，结果表明构建成功。

实施例3重组菌的构建

将实施例2得到的重组质粒pBEs/GmRALF1转入B.subtilis感受态RIK1285，从含有卡纳抗性的平板上挑选阳性克隆，获得重组菌株RIK1285/pBEs/GmRALF1。将获得的重组菌，摇瓶发酵(温度：28℃，转速：150-180rpm)培养24h，得到发酵液，离心得上清，上清即蛋白液。取30μL由RIK1285/pBEs/GmRALF1所得的蛋白液，加入10μL 4×的上样缓冲液，煮沸10min，进行Western-blot检测，结果见图4，比对结果显示与目的条带匹配度最高的GmRALF1蛋白序列，分子量10.5KDa，进一步表明GmRALF1蛋白序列中表达成功。

实施例4植物根系土壤接种重组菌(RIK1285RIK1285/pBEs/GmRALF1)实验

将成功表达GmRALF1蛋白的枯草芽孢杆菌RIK1285/pBEs/GmRALF1以1:500的比例接种在含卡纳抗性的LB培养液中，在28℃的摇床中培养16小时，转速为150-180rpm。离心收集菌体并用清水以1:1000稀释为菌液。在低磷土壤生长7天的大豆和拟南芥的根部接种10mL和1mL稀释菌液。相同的方式接种表达AtRALF23蛋白的枯草芽孢杆菌(RIK1285/pBEs/AtRALF23)和空载的枯草芽孢杆菌(RIK1285/pBEs)以及接种二级水为对照。

结果表明：在缺磷的土壤基质中，在植物根系土壤接种枯草芽孢杆菌(RIK1285/pBEs/GmRALF1)可以有效改善大豆和拟南芥的生长发育状况，显著增加鲜重、干物质以及磷积累(结果如图5～图8)同时证明了表达快速碱化因子GmRALF1的枯草芽孢杆菌相较于AtRALF23在改善植物生长发育，提高植物磷养分吸收方面的效果更好(图9)。另外在高磷条件接种枯草芽孢杆菌(RIK1285/pBEs/GmRALF1)对改善大豆生长发育，提高干物质和磷营养吸收也有着较好的效果。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> GmRALF1蛋白在促进植物对磷元素吸收中的应用

<141> 2021-12-31

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 571

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)

<400> 1

atctcgcact taaaacaaaa caagacacca ggcagctaaa cacaacaatg tcccaaccca 60

gattcatttc catgatctcc ctctgtctga ccctttttct gttccacact tgcactggcc 120

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<210> 2

<211> 369

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)

<400> 2

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<210> 3

<211> 122

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)

<400> 3

Met Ser Gln Pro Arg Phe Ile Ser Met Ile Ser Leu Cys Leu Thr Leu

1 5 10 15

Phe Leu Phe His Thr Cys Thr Gly Leu Pro Phe Val Asp Leu Asn Phe

20 25 30

His Glu Val Asp Val Met Thr Lys Arg Val Cys Thr Lys Ser Ile Gly

35 40 45

Glu Cys Leu Ser Leu Thr Glu Pro Glu Met Asp Ser Glu Thr Asn Arg

50 55 60

Arg Val Leu Ala Met Gln Lys Lys Tyr Ile Ser Tyr Asp Thr Leu Lys

65 70 75 80

Arg Asp Met Val Pro Cys Asp Arg Ala Gly Ala Ser Tyr Tyr Asn Cys

85 90 95

His Ala Ile Arg Ala Asn Pro Tyr Asn Arg Gly Cys Glu Val Ile Thr

100 105 110

Ala Cys Ala Arg Gly Gln Asp Ile Lys Thr

115 120

<210> 4

<211> 55

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)

<400> 4

Ala Met Gln Lys Lys Tyr Ile Ser Tyr Asp Thr Leu Lys Arg Asp Met

1 5 10 15

Val Pro Cys Asp Arg Ala Gly Ala Ser Tyr Tyr Asn Cys His Ala Ile

20 25 30

Arg Ala Asn Pro Tyr Asn Arg Gly Cys Glu Val Ile Thr Ala Cys Ala

35 40 45

Arg Gly Gln Asp Ile Lys Thr

50 55

<210> 5

<211> 288

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60

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<210> 6

<211> 5880

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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ctatttcgtt catccatatt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 2520

gcttaccatc tggccccgtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 2580

tttatcagca ataaacagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 2640

tccgcctcca tccagctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 2700

atagtttgcg caacttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 2760

tatggcttca ttcgctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 2820

tgcaaaaaag cgttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 2880

tgttatcact ctggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 2940

atgcttttct tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 3000

ccgagttgcc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 3060

aagtgctctc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 3120

gagatccgtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 3180

accagctttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 3240

cgacaggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 3300

gggtattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 3360

gttcgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga 3420

cataacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga 3480

cggtgaaaac ctctgacagt aaccaacatg attaacaatt attagaggtc atcgttcaaa 3540

atggtatgcg ttttgacaca tccactatat atccgtgtcg ttctgtccac tcctgaatcc 3600

cattccagaa attctctagc gattccagaa gtttctcaga gtcggaaagt tgaccagaca 3660

ttacgaactg gcacagatgg tcataacctg aaggaagatc tgattgctta actgcttcag 3720

ttaagaccga agcgctcgtc gtataacaga tgcgatgatg cagaccaatc aacatggcac 3780

ctgccattgc tacctgtaca gtcaaggatg gtagaaatgt tgtcggtcct tgcacacgaa 3840

tattacgcca tttgcctgca tattcaaaca gctcttctac gataagggca caaatcgcat 3900

cgtggaacgt ttgggcttct accgatttag cagtttgata cactttctct aagtatccac 3960

ctgaatcata aatcggcaaa atagagaaaa attgaccatg tgtaagcggc caatctgatt 4020

ccacctgaga tgcataatct agtagaatct cttcgctatc aaaattcact tccaccttcc 4080

actcaccggt tgtccattca tggctgaact ctgcttcctc tgttgacatg acacacatca 4140

tctcaatatc cgaatagggc ccatcagtct gacgaccaag agagccataa acaccaatag 4200

ccttaacatc atccccatat ttatccaata ttcgttcctt aatttcatga acaatcttca 4260

ttctttcttc tctagtcatt attattggtc cattcactat tctcattccc ttttcagata 4320

attttagatt tgcttttcta aataagaata tttggagagc accgttctta ttcagctatt 4380

aataactcgt cttcctaagc atccttcaat ccttttaata acaattatag catctaatct 4440

tcaacaaact ggcccgtttg ttgaactact ctttaataaa ataatttttc cgttcccaat 4500

tccacattgc aataatagaa aatccatctt catcggcttt ttcgtcatca tctgtatgaa 4560

tcaaatcgcc ttcttctgtg tcatcaaggt ttaatttttt atgtatttct tttaacaaac 4620

caccatagga gattaacctt ttacggtgta aaccttcctc caaatcagac aaacgtttca 4680

aattcttttc ttcatcatcg gtcataaaat ccgtatcctt tacaggatat tttgcagttt 4740

cgtcaattgc cgattgtata tccgatttat atttattttt cggtcgaatc atttgaactt 4800

ttacatttgg atcatagtct aatttcattg cctttttcca aaattgaatc cattgttttt 4860

gattcacgta gttttctgta ttcttaaaat aagttggttc cacacatacc aatacatgca 4920

tgtgctgatt ataagaatta tctttattat ttattgtcac ttccgttgca cgcataaaac 4980

caacaagatt tttattaatt tttttatatt gcatcattcg gcgaaatcct tgagccatat 5040

ctgacaaact cttatttaat tcttcgccat cataaacatt tttaactgtt aatgtgagaa 5100

acaaccaacg aactgttggc ttttgtttaa taacttcagc aacaaccttt tgtgactgaa 5160

tgccatgttt cattgctctc ctccagttgc acattggaca aagcctggat ttacaaaacc 5220

acactcgata caactttctt tcgcctgttt cacgattttg tttatactct aatatttcag 5280

cacaatcttt tactctttca gcctttttaa attcaagaat atgcagaagt tcaaagtaat 5340

caacattagc gattttcttt tctctccatg gtctcacttt tccacttttt gtcttgtcca 5400

ctaaaaccct tgatttttca tctgaataaa tgctactatt aggacacata atattaaaag 5460

aaacccccat ctatttagtt atttgtttag tcacttataa ctttaacaga tggggttttt 5520

ctgtgcaacc aattttaagg gttttcaata ctttaaaaca catacatacc aacacttcaa 5580

cgcacctttc agcaactaaa ataaaaatga cgttatttct atatgtatca agataagaaa 5640

gaacaagttc aaaaccatca aaaaaagaca ccttttcagg tgcttttttt attttataaa 5700

ctcattccct gatctcgact tcgttctttt tttacctctc ggttatgagt tagttcaaat 5760

tcgttctttt taggttctaa atcgtgtttt tcttggaatt gtgctgtttt atcctttacc 5820

ttgtctacaa accccttaaa aacgttttta aaggctttta agccgtctgt acgttcctaa 5880

<210> 7

<211> 6046

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

actagtgttc ttttctgtat gaaaatagtt atttcgagtc tctacggaaa tagcgagaga 60

tgatatacct aaatagagat aaaatcatct caaaaaaatg ggtctactaa aatattattc 120

catctattac aataaattca cagaatagtc ttttaagtaa gtctactctg aacttaagca 180

aaaggagagg gacgcgtgtg agaagcaaaa aattgtggat cagcttgttg tttgcgttaa 240

cgttaatctt tacgatggcg ttcagcaaca tgtctgcgca ggctgcggcc ggtgccatgc 300

agaaaaaata tatctcatat gacacattga agcgggacat ggtcccgtgc gatagagccg 360

gtgcatctta ttataactgc catgcaattc gggctaaccc ttacaaccgc ggatgcgaag 420

ttatcacagc ctgcgcaaga gggcaagaca ttaaaacgtc tagacatcac catcatcacc 480

actaatgcgg tagtttatca cagttaaatt gctaacgcag tcaggcaccg tgtatgaaat 540

ctaacaatgc gctcatcgtc atcctcggca ccgtcaccct ggatgctgta ggcataggct 600

tggttatgcc ggtactgccg ggcctatttc actttttgca ttctacaaac tgcataacta 660

ttatgtaaat cgctcctttt taggtggcac aaatgtgagg cattttcgct ctttccggca 720

accacttcca agtaaagtat aacacactat actttatatt cataaagtgt gtgctctgcg 780

aggctgtcgg cagtgccgac caaaaccata aaacctttaa gacctttctt ttttttacga 840

gaaaaaagaa acaaaaaaac ctgccctctg ccacctcagc aaaggggggt tttgctctcg 900

tgctcgttta aaaatcagca agggacaggt agtatttttt gagaagatca ctcaaaaaat 960

ctccaccttt aaacccttgc caatttttat tttgtccgtt ttgtctagct taccgaaagc 1020

cagactcagc aagaataaaa tttttattgt ctttcggttt tctagtgtaa cggacaaaac 1080

cactcaaaat aaaaaagata caagagaggt ctctcgtatc ttttattcag caatcgcgcc 1140

cgattgctga acagattaat aatagatttt agctttttat ttgttgaaaa aagctaatca 1200

aattgttgtc gggatcaatt actgcaaagt ctcgttcatc ccaccactga tcttttaatg 1260

atgtattggg gtgcaaaatg cccaaaggct taatatgttg atataattca tcaattccct 1320

ctacttcaat gcggcaacta gcagtaccag caataaacga ctccgcacct gtacaaaccg 1380

gtgaatcatt actacgagag cgccagcctt catcacttgc ctcccataga tgaatccgaa 1440

cctcattaca cattagaact gcgaatccat cttcatggtg aaccaaagtg aaacctagtt 1500

tatcgcaata aaaacctata ctctttttaa tatccccgac tggcaatgcc gggatagact 1560

gtaacattct cacgcataaa atcccctttc attttctaat gtaaatctat taccttatta 1620

ttaattcaat tcgctcataa ttaatccttt ttcttattac gcaaaatggc ccgatttaag 1680

cacacccttt attccgttaa tgcgccatga cagccatgat aattactaat actaggagaa 1740

gttaataaat acgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 1800

tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 1860

agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 1920

tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 1980

cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 2040

ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 2100

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 2160

ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 2220

ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 2280

cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 2340

gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 2400

atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 2460

ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 2520

gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 2580

tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 2640

ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 2700

taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 2760

gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 2820

gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 2880

ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 2940

aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 3000

gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 3060

cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 3120

actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 3180

caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 3240

gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 3300

ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 3360

caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 3420

tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 3480

gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 3540

cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 3600

ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 3660

gacagtaacc aacatgatta acaattatta gaggtcatcg ttcaaaatgg tatgcgtttt 3720

gacacatcca ctatatatcc gtgtcgttct gtccactcct gaatcccatt ccagaaattc 3780

tctagcgatt ccagaagttt ctcagagtcg gaaagttgac cagacattac gaactggcac 3840

agatggtcat aacctgaagg aagatctgat tgcttaactg cttcagttaa gaccgaagcg 3900

ctcgtcgtat aacagatgcg atgatgcaga ccaatcaaca tggcacctgc cattgctacc 3960

tgtacagtca aggatggtag aaatgttgtc ggtccttgca cacgaatatt acgccatttg 4020

cctgcatatt caaacagctc ttctacgata agggcacaaa tcgcatcgtg gaacgtttgg 4080

gcttctaccg atttagcagt ttgatacact ttctctaagt atccacctga atcataaatc 4140

ggcaaaatag agaaaaattg accatgtgta agcggccaat ctgattccac ctgagatgca 4200

taatctagta gaatctcttc gctatcaaaa ttcacttcca ccttccactc accggttgtc 4260

cattcatggc tgaactctgc ttcctctgtt gacatgacac acatcatctc aatatccgaa 4320

tagggcccat cagtctgacg accaagagag ccataaacac caatagcctt aacatcatcc 4380

ccatatttat ccaatattcg ttccttaatt tcatgaacaa tcttcattct ttcttctcta 4440

gtcattatta ttggtccatt cactattctc attccctttt cagataattt tagatttgct 4500

tttctaaata agaatatttg gagagcaccg ttcttattca gctattaata actcgtcttc 4560

ctaagcatcc ttcaatcctt ttaataacaa ttatagcatc taatcttcaa caaactggcc 4620

cgtttgttga actactcttt aataaaataa tttttccgtt cccaattcca cattgcaata 4680

atagaaaatc catcttcatc ggctttttcg tcatcatctg tatgaatcaa atcgccttct 4740

tctgtgtcat caaggtttaa ttttttatgt atttctttta acaaaccacc ataggagatt 4800

aaccttttac ggtgtaaacc ttcctccaaa tcagacaaac gtttcaaatt cttttcttca 4860

tcatcggtca taaaatccgt atcctttaca ggatattttg cagtttcgtc aattgccgat 4920

tgtatatccg atttatattt atttttcggt cgaatcattt gaacttttac atttggatca 4980

tagtctaatt tcattgcctt tttccaaaat tgaatccatt gtttttgatt cacgtagttt 5040

tctgtattct taaaataagt tggttccaca cataccaata catgcatgtg ctgattataa 5100

gaattatctt tattatttat tgtcacttcc gttgcacgca taaaaccaac aagattttta 5160

ttaatttttt tatattgcat cattcggcga aatccttgag ccatatctga caaactctta 5220

tttaattctt cgccatcata aacattttta actgttaatg tgagaaacaa ccaacgaact 5280

gttggctttt gtttaataac ttcagcaaca accttttgtg actgaatgcc atgtttcatt 5340

gctctcctcc agttgcacat tggacaaagc ctggatttac aaaaccacac tcgatacaac 5400

tttctttcgc ctgtttcacg attttgttta tactctaata tttcagcaca atcttttact 5460

ctttcagcct ttttaaattc aagaatatgc agaagttcaa agtaatcaac attagcgatt 5520

ttcttttctc tccatggtct cacttttcca ctttttgtct tgtccactaa aacccttgat 5580

ttttcatctg aataaatgct actattagga cacataatat taaaagaaac ccccatctat 5640

ttagttattt gtttagtcac ttataacttt aacagatggg gtttttctgt gcaaccaatt 5700

ttaagggttt tcaatacttt aaaacacata cataccaaca cttcaacgca cctttcagca 5760

actaaaataa aaatgacgtt atttctatat gtatcaagat aagaaagaac aagttcaaaa 5820

ccatcaaaaa aagacacctt ttcaggtgct ttttttattt tataaactca ttccctgatc 5880

tcgacttcgt tcttttttta cctctcggtt atgagttagt tcaaattcgt tctttttagg 5940

ttctaaatcg tgtttttctt ggaattgtgc tgttttatcc tttaccttgt ctacaaaccc 6000

cttaaaaacg tttttaaagg cttttaagcc gtctgtacgt tcctaa 6046

Claims

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白或其编码基因GmRALF1在促进植物对磷元素吸收中的应用。

2.氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白或其编码基因GmRALF1在制备促进植物对磷元素吸收的制剂中的应用。

3.一种表达大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的基因工程菌或含有该基因工程菌的微生物肥料在提高植物对磷养分吸收或在制备有机肥、土壤改良剂方面的应用，其特征在于，所述基因工程菌是以氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的编码基因为目的基因构建基因表达载体，再转化宿主菌后构建得到。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述宿主菌为枯草芽胞杆菌。

5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述表达载体为pBEs质粒。

6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述宿主菌为枯草芽孢杆菌RIK1285菌株。

7.一种提高植物对磷养分吸收的方法，其特征在于，将表达大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的基因工程菌先在培养液中进行培养，得到种子液，再将种子液接种至植物生长的根际土壤中或将含有该基因工程菌的微生物肥料直接施用在植物生长的根际土壤中，其特征在于，所述基因工程菌是以氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的编码基因为目的基因构建基因表达载体，再转化宿主菌后构建得到。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述大豆快速碱化因子GmRALF1蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述宿主菌为枯草芽胞杆菌。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述表达载体为pBEs质粒。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述宿主菌为枯草芽孢杆菌RIK1285菌株。