CN111909957B

CN111909957B - 一种雨生红球藻的遗传转化方法

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Publication number: CN111909957B
Application number: CN202010815013.XA
Authority: CN
Inventors: 胡章立; 郭春立; 王潮岗; 王会
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2020-08-13
Filing date: 2020-08-13
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2040-08-13
Also published as: CN111909957A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种雨生红球藻的遗传转化方法。该方法包括如下步骤：利用聚乙二醇溶液介导外源基因进入雨生红球藻的原生质体。本发明首次提出采用聚乙二醇溶液介导外源基因转入雨生红球藻的原生质体，由于聚乙二醇可以使细胞膜的通透性增加，使得线性化质粒更容易转入雨生红球藻原生质体，且该方法不对细胞造成机械损伤，避免因损伤导致的细胞胁迫反应，从而影响雨生红球藻的转化。该方法解决了基因枪和农杆菌介导遗传转化中操作繁琐、成本高、周期长且转化率低的难题。该方法可广泛应用于红球藻细胞优良性状改良、基因编辑及表达调控等，具有巨大的商业优势和广阔的市场前景。

Description

一种雨生红球藻的遗传转化方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种雨生红球藻的遗传转化方法。

背景技术

雨生红球藻作为重要的经济绿藻，是天然虾青素的主要来源。虾青素属于类胡萝卜素，可以延缓衰老、促进抗体产生以及增强机体免疫力，是天然的抗氧化剂；虾青素还对人类糖尿病、痛风、高血压和癌症等氧化应激类疾病的防治有明显的效果，因此虾青素具有极大的市场价值，雨生红球藻具有重大的研究意义。

目前用于商业化生产天然虾青素的雨生红球藻大多为筛选得到的野生型品种，这种野生型红球藻细胞中虾青素的含量非常有限(2％以下)，在实验室规模上最高的含量也不超过4％，且生长速度慢，细胞密度低，对培养技术要求高，目前只能以较高的生产成本进行小规模的培养。利用转基因技术来改善雨生红球藻的品质，获得生长速度快、虾青素含量高、耐受性强的新品种是突破现有产量及成本限制的有效手段，具有巨大的商业优势和广阔的市场前景。

基因枪法和农杆菌介导法是已有报道的对雨生红球藻进行基因改造的方法。但是，基因枪转化的藻细胞受到金粉颗粒冲击后，会逐渐变红死亡，影响转化，同时基因枪转化法操作繁琐、仪器成本高、阳性转化率低且成功率极低。而农杆菌介导法由于雨生红球藻细胞壁比较厚，农杆菌很难侵染，遗传转化的成功率也很低。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的雨生红球藻的遗传转化方法操作繁琐、成本高、阳性转化率低且成功率低等缺陷，从而提供一种雨生红球藻的遗传转化方法。

为此，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种雨生红球藻的遗传转化方法，包括如下步骤：利用聚乙二醇溶液介导外源基因进入雨生红球藻的原生质体。

进一步地，所述聚乙二醇溶液包括质量浓度为25-35％的聚乙二醇，0.1-0.3M的甘露醇和0.05-0.2M的氯化钙。

进一步地，所述聚乙二醇溶液包括质量浓度为30％的聚乙二醇，0.2M的甘露醇和0.1M的氯化钙。

进一步地，所述聚乙二醇为聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000或聚乙二醇8000中的一种。

进一步地，所述的雨生红球藻的遗传转化方法，包括如下步骤：

S1，将收集的雨生红球藻细胞加入酶溶液中，进行细胞壁酶解处理，得到雨生红球藻原生质体；

S2，将所得红球藻原生质体加入W5溶液中，冰水浴沉淀，弃上清液，加入MMG溶液，得到原生质体溶液；

S3，将线性化质粒与所述原生质体溶液混合，加入等体积的聚乙二醇溶液，进行转化；

S4，加W5溶液，终止转化，分离得第一沉淀物，加入W1溶液中，避光孵育；

S5，将孵育后的溶液进行分离，得第二沉淀物，加入ESP液体培养基，经避光培养，弱光培养，正常光培养，再在ESP抗性培养基上培养，实现雨生红球藻的遗传转化；

其中，所述W5溶液包括0.15-0.16M NaCl，0.12-0.13M CaCl₂，4-6mM KCl，1-3mMMES，pH为5-6；

所述MMG溶液包括0.3-0.5M甘露醇，12-17mM MgCl₂，3-5mM MES pH为5-6；

所述W1溶液包括3-5mM MES 0.4-0.6M甘露醇，0.01-0.03M KCl，pH为5-6。

进一步地，所述步骤S3中的线性化质粒为pH124，含有Not I特异限制性内切酶酶切位点，且含有RBCS2启动子驱动的Ble。

进一步地，所述ESP抗性培养基包括ESP液体培养基，凝固剂和抗生素。

进一步地，所述抗生素为博来霉素。

进一步地，所述的雨生红球藻的遗传转化方法符合(1)-(11)中的至少一项：

(1)所述步骤S1中酶溶液包括质量浓度为1-2％的纤维素酶R-10，质量浓度为0.3-0.5％的离析酶R-10，0.3-0.5M的甘露醇，0.01-0.03M的KCl，0.01-0.03M的MES，0.005-0.015M的CaCl₂，质量浓度为0.05-0.15％BSA，4-6mM的巯基乙醇；

(2)所述步骤S1中酶解处理的条件为23-28℃，避光，摇床转速20-30rpm，5.5-6h；

(3)所述步骤S3中所述转化温度为23-28℃，转化时间为5-25min；

(4)所述步骤S5中避光培养的时间为5-7h；

(5)所述步骤S5中弱光培养的时间为5-7h，弱光强度为5-10μmol/m²/s；

(6)所述步骤S5中正常光培养的时间为5-7h，正常光强度为28-33μmol/m²/s；

(7)所述步骤S5中在ESP抗性培养基上培养的时间为10-15h；光照强度为28-33μmol/m²/s；

(8)所述步骤S5中ESP抗性培养基包括ESP液体培养基，凝固剂1.5-2.5g/100mL和抗生素4.5-5.5μg/mL；

(9)所述凝固剂为琼脂；

(10)所述ESP液体培养基和ESP抗性培养基的pH均为7.0-7.2；

(11)所述步骤S4和步骤S5中的分离步骤均采用离心分离，离心速度为(80-120)×g，离心时间为1.5-3min。

进一步地，所述的雨生红球藻的遗传转化方法符合(1)-(12)中的至少一项：

(1)所述步骤S1中酶溶液包括质量浓度为1.5％的纤维素酶R-10，质量浓度为0.4％的离析酶R-10，0.4M的甘露醇，0.02M的KCl，0.02M的MES，0.01M的CaCl₂，质量浓度为0.1％BSA，5mM的巯基乙醇；

(2)所述步骤S1中酶解处理的条件为25℃，避光，摇床转速25rpm，5.5-6h；

(3)所述步骤S3中所述转化温度为25℃，转化时间为10min；

(4)所述步骤S5中避光培养的时间为6h；

(5)所述步骤S5中弱光培养的时间为6h，弱光强度为5-10μmol/m²/s；

(6)所述步骤S5中正常光培养的时间为6h，正常光强度为30μmol/m²/s；

(7)所述步骤S5中在ESP抗性培养基上培养的时间为12h；光照强度为30μmol/m²/s；

(8)所述步骤S5ESP抗性培养基包括ESP液体培养基，凝固剂2g/100mL和抗生素5μg/mL；

(9)所述凝固剂为琼脂；

(10)所述ESP液体培养基和ESP抗性培养基的pH均为7.0-7.2；

(11)所述步骤S4和步骤S5中的分离步骤均采用离心分离，离心速度为100×g，离心时间为2min；

(12)所述步骤S4中加入两倍体积的W5溶液，终止转化。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的雨生红球藻的遗传转化方法，包括如下步骤：利用聚乙二醇溶液介导外源基因转入雨生红球藻的原生质体。本发明首次提出采用聚乙二醇溶液介导外源基因转入雨生红球藻的原生质体，由于聚乙二醇可以使细胞膜的通透性增加，使得线性化质粒更容易转入雨生红球藻原生质体，且该方法不对细胞造成机械损伤，避免因损伤导致的细胞胁迫反应，从而影响雨生红球藻的转化。该方法解决了基因枪和农杆菌介导遗传转化中操作繁琐、成本高、周期长且转化率低的难题。该方法可广泛应用于红球藻细胞优良性状改良、基因编辑及表达调控等，具有巨大的商业优势和广阔的市场前景。

2.本发明提供的雨生红球藻的遗传转化方法，通过对聚乙二醇溶液的进一步限定，能够提高雨生红球藻细胞遗传转化的阳性率。

3.本发明提供的雨生红球藻的遗传转化方法，包括如下步骤：S1，将收集的雨生红球藻细胞加入酶溶液中，进行细胞壁酶解处理，得到雨生红球藻原生质体；S2，将所得红球藻原生质体加入W5溶液中，冰水浴沉淀，弃上清液，加入MMG溶液，得到原生质体溶液；S3，将线性化质粒与所述原生质体溶液混合，加入等体积的聚乙二醇溶液，进行转化；S4，加入W5溶液，终止转化，分离得第一沉淀物，加入W1溶液中，避光孵育；S5，将孵育后的溶液进行分离，得第二沉淀物，加入ESP液体培养基，经避光培养，弱光培养，正常光培养，再在ESP抗性培养基上培养，实现雨生红球藻的遗传转化。本发明通过对各步骤的具体限定，保证了雨生红球藻的遗传转化，且阳性转化率高，能够达到32％。其中，选用线性化质粒，其比环状的质粒更容易结合到雨生红球藻核基因组，以便获得更多阳性转化子。步骤S5中，依次经避光培养，弱光培养，正常光培养。这主要是因为原生质体处理以后比较脆弱，所以要慢慢的适应光环境的变化，如果直接用正常光照射，会很容易死掉，影响阳性转化率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中酶解处理前后的对照图，其中，左图为酶解之前，右图为酶解之后；从图中可以看出，酶解处理之后细胞壁和鞭毛消失。

图2是本发明实施例1中雨生红球藻遗传转化结果，A转化后的ESP平板(5μg/mL博来霉素)，B转化子转移到新的ESP平板(5μg/mL博来霉素)。

图3为常规PCR和RT-PCR进行阳性转化子PCR鉴定结果；

其中，PCR-Ble：为以转化子DNA为模板，以HpBle-F/R为引物，扩增的Ble基因；PCR-Actin：为以转化子DNA为模板，以HpAct-F/R为引物，扩增内参基因的片段；RtPCR-Ble：为以阳性转化子的cDNA为模板，以RtBle-F/R为引物扩增cDNA中的Ble；RtPCR-Actin：为以阳性转化子的cDNA为模板，以HpAct-F/R为引物扩增阳性转化子的内参基因编码区的片段。

图4为本发明中转化用质粒pH124的图谱。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1

本实施例提供一种雨生红球藻的遗传转化方法，包括以下步骤：

1转化用质粒的线性化

本实施例中用的质粒为pH124。利用质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit II(欧米伽(Omega Bio-tek)，美国)从大肠杆菌DH5α中提取pH124质粒，用限制性内切酶Not I对质粒进行线性化处理，Not I的酶切体系为30μL，具体包括：20μL DNA溶液，2μL Not I快切酶(新英格兰(NEB)，美国)，3μL Cutsmart Buffer(新英格兰(NEB)，美国)，5μL水。酶切温度37℃，酶切时间2h，得到线性化pH124质粒，具有SEQ ID NO：1所示的DNA序列，所述线性化的质粒浓度约为1.0μg/μL。

2雨生红球藻遗传转化

(1)收集雨生红球藻细胞

本实施例选用的雨生红球藻细胞为192.80菌株(购自EPSAG(藻类实验生态与藻种保藏，哥廷根大学，哥廷根，德国))，在ESP液体培养基中将雨生红球藻192.80在25℃，30μmol/m²/s条件下培养至对数期，将培养液在1600rpm离心5min收集藻细胞。对数期的雨生红球藻细胞生长状态好，适合遗传转化。

(2)雨生红球藻原生质体的制备

在超净工作台中，在上述收集的藻细胞中加入10mL配制好的酶溶液，所述酶溶液包括1.5％纤维素酶R-10，0.4％离析酶R-10，0.4M甘露醇，0.02M KCl，0.02M MES，0.01MCaCl₂，0.1％BSA，5mM巯基乙醇。之后25℃，摇床转速25rpm，避光酶解6h，光学显微镜下观察至鞭毛和细胞壁消失(如图1所示)。摇床转速过高容易使原生质体破碎，如果静置会使细胞壁酶解不彻底。由于雨生红球藻细胞壁比较厚，因此处理时间要延长至5.5-6h。

加入10mL W5溶液，轻柔混匀，100×g离心2min，去除上清；再加入1mL W5溶液，冰浴30min，原生质体自然沉淀25min,小心去除上清，最后加入1mL MMG溶液，重悬即得到原生质体溶液。自然沉降的时间要在25min以上，否则原生质体沉降不彻底。

(3)转化

取步骤(1)得到的10μL线性化质粒加入到上述200μL原生质体溶液，轻柔混匀。加入210μL聚乙二醇溶液，轻柔混匀，室温放置10min，间歇轻柔多次混匀。加入840μL W5溶液，轻柔混匀，终止转化过程。100×g离心2min，去除上清，沉淀重悬于1mL溶液W1中。

转化后的原生质体溶液在摇床转速25rpm，25℃下，避光过夜孵育。100×g离心2min，去除上清，1mL ESP液体培养基重悬，避光培养6h，转入8μmol/m²/s光照下弱光培养6h，最后30μmol/m²/s光照条件下培养12h。100×g离心2min，去除约800μL上清，剩余的约200μL ESP液体培养基重悬原生质体，涂布到含有5μg/mL博莱霉素的ESP抗性筛选培养基上，25℃，30μmol/m²/s条件下培养2周，培养结果如图2A所示，然后挑单克隆到新的ESP抗性培养基上相同条件下培养1周，结果如图2B所示，从图中可以看出，转化后的原生质体在ESP抗性培养基上培养后，逐渐长出单克隆藻落。

其中，所述W5溶液包括0.154M NaCl，0.125M CaCl₂，5mM KCl，2mM MES，pH为5.7。

所述MMG溶液包括0.4M甘露醇，15mM MgCl₂,4mM MES pH为5.7。

所述聚乙二醇溶液包括30％PEG4000，0.2M甘露醇，0.1M CaCl₂。

所述W1溶液包括4mM MES 0.5M甘露醇，0.02M KCl，pH为5.7。

上述用于重悬的ESP液体培养基组成如表1所示：

表1

上述土提液的制备：在一个6L的烧瓶中加入三分之一的花园土。加入去离子水，使其高出土壤5cm，然后加热1h，24h后再加热1h。4000rpm离心10min，获得土提液。121℃高压灭菌20min，储存在冰箱中备用。

上述用于筛选的抗性ESP抗性培养基包括ESP液体培养基、质量浓度2％琼脂粉和5μg/mL博来霉素。

3阳性转化子鉴定

(1)常规PCR验证

从上述抗性筛选培养基上挑单克隆，CTAB法提取基因组，具体过程为：挑取单克隆至无抗ESP液体培养基，25℃，30μmol/m²/s培养箱培养至对数期。5000rpm，5min收集藻细胞；加入CTAB(2％)，65℃处理1h；加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)，12000rpm，10min，取上清到一新的1.5mL EP管中，加入等体积的异丙醇，-20℃放置30min，用70％酒精洗一次，加入500μL无菌水溶解；以其为模板进行PCR扩增，鉴定引物为HpBle-F:ATATCAAGCTTATCGATACCGT(SEQ ID NO：2)；HpBle-R:CCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTT(SEQ IDNO：3)。以转化子DNA为模板，扩增转化子的Actin片段，扩增引物为HpAct-F：ACCTCAGCGTTCAGCCTTGT(SEQ ID NO：4)；Hpact-R：TGGTCCACGACACCATCAAC(SEQ ID NO：5)，以排除模板DNA污染。引物序列由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，用来扩增的聚合酶为2×Taq Plus PCR Master Mix(中科瑞泰(北京)生物科技有限公司,中国)，PCR扩增的体系见表2。扩增出1289bp条带的克隆即为阳性转化子，参见图3。

表2用于阳性转化子鉴定的常规PCR体系

(2)RT-PCR验证

挑选常规PCR验证结果呈阳性的藻株，利用植物总RNA提取试剂盒(天根，中国)上述方法提取总RNA，反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行反转录PCR，反转录引物为RtBle-F:GTCGAGTTCTGGACCGACC(SEQ ID NO：6)；RtBle-R:GCGCTGATGAACAGGGTCAC(SEQ ID NO：7)。以阳性转化子cDNA为模板，扩增Actin片段，扩增引物为HpAct-F：ACCTCAGCGTTCAGCCTTGT(SEQID NO：4)；Hpact-R：TGGTCCACGACACCATCAAC(SEQ ID NO：5)，以保证cDNA的质量。引物序列由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，用来扩增的聚合酶为2×Taq Plus PCR MasterMix(中科瑞泰(北京)生物科技有限公司,中国)，PCR扩增的体系见表3。扩增出98bp条带的克隆即为阳性转化子，参见图3。

表3用于阳性转化子鉴定的RT-PCR体系

本次实施例中，一共筛选了134个雨生红球藻转化子，其中根据PCR鉴定的结果有43株为阳性克隆，阳性转化率为32.1％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳大学

<120> 一种雨生红球藻的遗传转化方法

<130> 2020

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4899

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccgcggtgga gctccagctt ttgttccctt tagtgagggt taatttcgag cttggcgtaa 60

tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 120

cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta 180

attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 240

tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg 300

ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 360

gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 420

ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 480

cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 540

ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 600

accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 660

catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 720

gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 780

tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 840

agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 900

actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 960

gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 1020

aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 1080

gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 1140

aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 1200

atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 1260

gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 1320

atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 1380

ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 1440

cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 1500

agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 1560

cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 1620

tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 1680

agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 1740

gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 1800

gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 1860

ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 1920

tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 1980

tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 2040

gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 2100

caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 2160

atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac 2220

gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct 2280

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gagcggggat cgatcctcta gagtgggtcg acgtcggtta gtcctgctcc tcggccacga 3180

agtgcacgca gttgccggcc gggtcgcgca gggcgaactc ccgcccccac ggctgctcgc 3240

cgatctcggt catggccggc ccggaggcgt cccggaagtt cgtggacacg acctccgacc 3300

actcggcgta cagctcgtcc aggccgcgca cccacaccca ggccagggtg ttgtccggca 3360

ccacctggtc ctgcaaatgg aaacggcgac gcagggttag atgctgcttg agacagcgac 3420

agaggagcca aaagccttcg tcgacacaat gcgggcgttg caagtcaaat ctgcaagcac 3480

gctgcctgat ccgccgggct tgctcgtcga ctcacctggt cctggaccgc gctgatgaac 3540

agggtcacgt cgtcccggac cacaccggcg aagtcgtcct ccacgaagtc ccgggagaac 3600

ccgagccggt cggtccagaa ctcgaccgct ccggcgacgt cgcgcgcggt gagcaccgga 3660

acggcgctgg tcagcttggc catcctgcaa atggaaacgg cgacgcaggg ttagatgctg 3720

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aagatgttga gtgacttctc ttgtaaaaaa gtaaagaaca taggccccct ggccggttta 3900

tcaggagggc accgctccag gggctgcatg cgaactgctt gcattggcgc ctagcctttg 3960

tgggccaggg ggcttccgga taagggttgc aagtgctcaa ataccccatc aaacatcatc 4020

ctggtttggc tgcgctcctt ctggcattta aatctcgagg tcgacggtat cgataagctt 4080

gatatcgaat tcgctgaggc ttgacatgat tggtgcgtat gtttgtatga agctacagga 4140

ctgatttggc gggctatgag ggcgggggaa gctctggaag ggccgcgatg gggcgcgcgg 4200

cgtccagaag gcgccatacg gcccgctggc ggcacccatc cggtataaaa gcccgcgacc 4260

ccgaacggtg acctccactt tcagcgacaa acgagcactt atacatacgc gactattctg 4320

ccgctataca taaccactca gctagtggat cccgggcgcg ccagaaggag cgcagccaaa 4380

ccaggatgat gtttgatggg gtatttgagc acttgcaacc cttatccgga agccccctgg 4440

cccacaaagg ctaggcgcca atgcaagcag ttcgcatgca gcccctggag cggtgccctc 4500

ctgataaacc ggccaggggg cctatgttct ttactttttt acaagagagc tagccacgtg 4560

cgtcgaccca ctctagagga tccccgctcc gtgtaaatgg aggcgctcgt tgatctgagc 4620

cttgccccct gacgaacggc ggtggatgga agatactgct ctcaagtgct gaagcggtag 4680

cttagctccc cgtttcgtgc tgatcagtct ttttcaacac gtaaaaagcg gaggagtttt 4740

gcaattttgt tggttgtaac gatcctccgt tgattttggc ctctttctcc atgggcgggc 4800

tgggcgtatt tgaagcgggt accgagctcg aattcctgca gcccggggga tccactagtt 4860

ctagagcggc cgccaccgcg gtggagctcc agcttttgt 4899

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atatcaagct tatcgatacc gt 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccagggtttt cccagtcacg acgtt 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acctcagcgt tcagccttgt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tggtccacga caccatcaac 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtcgagttct ggaccgacc 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcgctgatga acagggtcac 20

Claims

1.一种雨生红球藻的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

S4，加入W5溶液，终止转化，分离得第一沉淀物，加入W1溶液中，避光孵育；

其中，所述W5溶液包括0.15-0.16 M NaCl，0.12-0.13 M CaCl₂，4-6 mM KCl，1-3 mMMES，pH为5-6；

所述MMG溶液包括0.3-0.5 M 甘露醇，12-17 mM MgCl₂，3-5 mM MES pH为5-6；

所述聚乙二醇溶液包括质量浓度为25-35%的聚乙二醇，0.1-0.3 M的甘露醇和0.05-0.2 M的氯化钙；

所述W1溶液包括3-5 mM MES 0.4-0.6 M甘露醇，0.01-0.03 M KCl，pH为5-6

所述步骤S5中避光培养的时间为5-7 h；

所述步骤S5中弱光培养的时间为5-7 h，弱光强度为5-10 μmol/m²/s；

所述步骤S5中正常光培养的时间为5-7 h，正常光强度为28-33 μmol/m²/s；

所述步骤S5中在ESP抗性培养基上培养的时间为10-15 h；光照强度为28-33 μmol/m²/s。

2.根据权利要求1所述的雨生红球藻的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤S3中的线性化质粒为pH124，含有Not I特异限制性内切酶酶切位点，且含有RBCS2启动子驱动的Ble。

3.根据权利要求1所述的雨生红球藻的遗传转化方法，其特征在于，所述ESP抗性培养基包括ESP液体培养基，凝固剂和抗生素。

4.根据权利要求3所述的雨生红球藻的遗传转化方法，其特征在于，所述抗生素为博来霉素。

5.根据权利要求3或4所述的雨生红球藻的遗传转化方法，其特征在于，符合（1）-（7）中的至少一项：

（1）所述步骤S1中酶溶液包括质量浓度为1-2%的纤维素酶R-10，质量浓度为0.3-0.5%的离析酶R-10，0.3-0.5 M的甘露醇，0.01-0.03 M的KCl，0.01-0.03 M的MES，0.005-0.015M的CaCl₂，质量浓度为0.05-0.15% BSA，4-6 mM的巯基乙醇；

（2）所述步骤S1中酶解处理的条件为23-28 ℃，避光，摇床转速20-30 rpm，5.5-6 h；

（3）所述步骤S3中所述转化温度为23-28 ℃，转化时间为5-25 min；

（4）所述步骤S5中ESP抗性培养基包括ESP液体培养基，凝固剂1.5-2.5 g/100 mL和抗生素4.5-5.5 µg/mL；

（5）所述凝固剂为琼脂；

（6）所述ESP液体培养基和ESP抗性培养基的pH均为7.0-7.2；

（7）所述步骤S4和步骤S5中的分离步骤均采用离心分离，离心速度为（80-120）×g，离心时间为1.5-3 min。

6.根据权利要求5所述的雨生红球藻的遗传转化方法，其特征在于，符合（1）-（14）中的至少一项：

（1）所述步骤S1中酶溶液包括质量浓度为1.5%的纤维素酶R-10，质量浓度为0.4%的离析酶R-10，0.4 M的甘露醇，0.02 M的KCl，0.02 M的MES，0.01 M的CaCl₂，质量浓度为0.1%BSA，5 mM的巯基乙醇；

（2）所述步骤S1中酶解处理的条件为25 ℃，避光，摇床转速25 rpm，5.5-6 h；

（3）所述步骤S3中所述转化温度为25 ℃，转化时间为10 min；

（4）所述步骤S5中避光培养的时间为6 h；

（5）所述步骤S5中弱光培养的时间为6 h，弱光强度为5-10 μmol/m²/s；

（6）所述步骤S5中正常光培养的时间为6 h，正常光强度为30 μmol/m²/s；

（7）所述步骤S5中在ESP抗性培养基上培养的时间为12 h；光照强度为30 μmol/m²/s；

（8）所述步骤S5 ESP抗性培养基包括ESP液体培养基，凝固剂2 g/100 mL和抗生素5 µg/mL；

（9）所述凝固剂为琼脂；

（10）所述ESP液体培养基和ESP抗性培养基的pH均为7.0-7.2；

（11）所述步骤S4和步骤S5中的分离步骤均采用离心分离，离心速度为100×g，离心时间为2min；

（12）所述步骤S4中加入两倍体积的W5溶液，终止转化；

（13）所述聚乙二醇溶液包括质量浓度为30%的聚乙二醇，0.2 M的甘露醇和0.1 M的氯化钙；

（14）所述聚乙二醇为聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000或聚乙二醇8000中的一种。