CN105647810B - 雨生红球藻游动细胞的培养方法及原生质体的制备方法 - Google Patents
雨生红球藻游动细胞的培养方法及原生质体的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105647810B CN105647810B CN201610218349.1A CN201610218349A CN105647810B CN 105647810 B CN105647810 B CN 105647810B CN 201610218349 A CN201610218349 A CN 201610218349A CN 105647810 B CN105647810 B CN 105647810B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protoplast
- cell
- haematococcus pluvialis
- swarm
- collagenase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 58
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 title claims abstract description 48
- 241000168517 Haematococcus lacustris Species 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 21
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims abstract description 14
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 13
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims abstract description 13
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 18
- 210000000947 motile cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 10
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 10
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 8
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 8
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims description 8
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 8
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 8
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 8
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 claims description 3
- QGUAJWGNOXCYJF-UHFFFAOYSA-N cobalt dinitrate hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Co+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O QGUAJWGNOXCYJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229960002413 ferric citrate Drugs 0.000 claims description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 3
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L manganese(II) chloride tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Mn+2] CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 claims description 3
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 claims description 3
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 claims description 3
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 claims description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 2
- RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[[4-[(e)-[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfonatophenyl)methyl]azaniumylidene]-2-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]methyl]-n-ethyl-3-methylanilino]methyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=C1 RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 claims 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 claims 1
- BEGBSFPALGFMJI-UHFFFAOYSA-N ethene;sodium Chemical group [Na].C=C BEGBSFPALGFMJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 abstract 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 10
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 7
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 7
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 6
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 5
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 5
- 235000013793 astaxanthin Nutrition 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 241000512259 Ascophyllum nodosum Species 0.000 description 3
- JEBFVOLFMLUKLF-IFPLVEIFSA-N Astaxanthin Natural products CC(=C/C=C/C(=C/C=C/C1=C(C)C(=O)C(O)CC1(C)C)/C)C=CC=C(/C)C=CC=C(/C)C=CC2=C(C)C(=O)C(O)CC2(C)C JEBFVOLFMLUKLF-IFPLVEIFSA-N 0.000 description 3
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 3
- 241000168525 Haematococcus Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 241000195474 Sargassum Species 0.000 description 3
- 241000219095 Vitis Species 0.000 description 3
- MQZIGYBFDRPAKN-ZWAPEEGVSA-N astaxanthin Chemical compound C([C@H](O)C(=O)C=1C)C(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)C(=O)[C@@H](O)CC1(C)C MQZIGYBFDRPAKN-ZWAPEEGVSA-N 0.000 description 3
- 229940022405 astaxanthin Drugs 0.000 description 3
- 239000001168 astaxanthin Substances 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical group C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 description 3
- 108010087005 glusulase Proteins 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040350 B family Human genes 0.000 description 1
- 108091072128 B family Proteins 0.000 description 1
- 241000253968 Bryopsis hypnoides Species 0.000 description 1
- 241001292415 Caloglossa leprieurii Species 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000703939 Gracilariopsis longissima Species 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241001491708 Macrocystis Species 0.000 description 1
- 241001555052 Oscillatoria amoena Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000912545 Porphyra crispata Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000015177 Saccharina japonica Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- BDKZHNJTLHOSDW-UHFFFAOYSA-N [Na].CC(O)=O Chemical compound [Na].CC(O)=O BDKZHNJTLHOSDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SYZKBMPNHSQNHG-UHFFFAOYSA-N [Na].CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.NCCN Chemical compound [Na].CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.NCCN SYZKBMPNHSQNHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 150000001514 astaxanthins Chemical class 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 108010081495 driselase Proteins 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- -1 pectase Proteins 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 1
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Botany (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种雨生红球藻游动细胞的培养方法，包括将雨生红球藻在含有乙酸钠、酵母提取物和其他无机营养的培养基中进行培养的步骤。通过具有特定成分的培养基培养可获得高达85％以上的游动细胞，细胞密度可达105个/ml以上。本发明还提供了一种利用游动细胞制备原生质体的方法，在含有胶原蛋白酶Collagenase的酶溶液中处理后可获得80％以上的原生质体。本发明的细胞培养与原生质体制备过程操作简单，方便快捷，具有可重复性，原生质体制备率高，活性保持好，有利于后续的原生质体融合与分子生物学操作等工作。
Description
技术领域
本发明涉及一种雨生红球藻游动细胞的培养方法及原生质体的制备方法。
背景技术
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)被公认为自然界中生产天然虾青素(3，3’-二羟基-β，β’-类胡萝卜素-4，4’-二酮)的最好生物。虾青素是一种生物活性物质，具有抗氧化、消除自由基、增强动物免疫、促进繁殖、生长、成熟等作用，被应用于医药、水产养殖等各个领域。近年来，雨生红球藻已应用于大规模的自养培养中，但由于雨生红球藻为自养型生物，导致其在培养过程中存在生长缓慢、生物量低、培养条件要求高等问题，严重制约了雨生红球藻大规模商业化高密度培养。利用现代微生物育种技术选育性状优良的藻株已日益受到关注。原生质体融合、基因工程等育种技术已成为选育优良藻株的有效手段。因此，建立高效的雨生红球藻原生质体的制备技术及其重要。
雨生红球藻的生活周期主要分为进行营养生长的绿色游动细胞时期和积累红色虾青素的不动细胞时期。当环境适宜(如低光照、营养盐充足等)时，细胞为绿色细胞并且大量繁殖。当细胞处于胁迫条件(如高光照、营养盐缺乏、高C/N等)时，细胞壁增厚、体积增大、细胞增殖减慢，且因积累大量虾青素而呈红色。雨生红球藻生长十分缓慢，Harker等曾在30L的气升式(air-lift)光反应器中用光和自养方法(不添加有机碳源)培养雨生红球藻，三周的时间内，生物量仅达到105个/ml。
藻类的细胞操作可以追溯到50年代末期，Fushs(1958)利用丝状蓝藻——颤藻(Oscillatoria amoena)制备得到原生质体。到70年代中后期，其他种类藻原生质体的制备也相继获得成功：Kobayashi用机械法挤压出羽藻(Bryopsis hypnoides)的原生质体；1986年，Cheney分离得到江篱(Gracilaria verrucosa)的原生质体，并培养成株；1989年，周一红和王素娟用生物技术手段分离获得鹧鸪菜(Caloglossalep rieurii)原生质体并培养成株。1990年，Saga和Sakai分离到海带(Laminaria Japonica)、巨藻(Macrocystis)和马尾藻(Sargassum horueri)的原生质体，并把巨藻和马尾藻的原生质体培养成株。1993年，Gall等分离到了长紫菜(porphyra crispata)的原生质体，并观察了其中间及最终再生形态。1996年，查向东等利用褐藻胶酶和纤维素酶获得裙带菜配子体原生质体，并经4-5周再生成为同普通配子体大小和形状相同的新的配子体。
早期酶法制备原生质体过程中的酶主要来源于生物体内，如微生物来源的海藻解壁酶、动物来源的海藻解壁酶。目前，广泛用于原生质体制备的酶主要有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、几丁质酶、蛋白酶、崩溃酶、离析酶等。范寰等(一种白腐真菌的原生质体制备方法，中国专利200910228483X)采用蜗牛酶酶解分离一种酵母菌的原生质体，β-巯基乙醇预处理条件下，原生质体形成率可达90％-96％。
根据不同藻类细胞壁成分的不同，各种多糖水解酶如纤维素酶、蜗牛酶、果胶酶、离析酶等被广泛应用于微藻原生质体的制备中。魏东等(葡萄藻原生质体的制备及葡萄藻原生质体制备率检测方法，中国专利201410312883X)提出采用纤维素酶、果胶酶及离析酶的复合酶溶液来制备葡萄藻原生质体的方法，但并未提及制备效率。
对于雨生红球藻而言，其细胞壁是由糖蛋白分子以及少量的纤维素和几丁质组成，所以Tjahjono于1993年提出以蛋白酶K来制备原生质体。随后在2004年王明兹等(雨生红球藻原生质体制备与再生技术，中国专利2004100075358)用酸性缓冲液、EDTA和二硫苏糖醇配制而成的预处理剂处理雨生红球藻细胞，然后以纤维素酶、蜗牛酶、果胶酶和酸性缓冲液组成的复合高渗酶溶液来分离得到原生质体，制备率可达80％。但是，在雨生红球藻生活史中存在多种细胞类型，其细胞壁结构及组成均存在较大差异。上述专利中原生质体制备方法并未针对雨生红球藻生活史中特定细胞，且需要进行破壁预处理，方法繁琐，耗时较长，所需酶种类较多。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种雨生红球藻游动细胞的培养方法，以快速获得富集化的雨生红球藻游动细胞。
本发明的另一目的是提供一种利用雨生红球藻游动细胞制备原生质体的方法，用以制备雨生红球藻原生质体。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明技术方案的提出，是基于发明人认为在雨生红球藻的生活史中存在游动细胞和不动细胞两种细胞，这两种细胞细胞壁结构上存在很大差异，游动细胞的原生质不含有纤维素层，仅被一层透明的凝胶状细胞层所包被，而不动细胞则存在厚而致密的纤维素化细胞壁层，因而通过游动细胞制备原生质体应要明显优于不动细胞。
本发明的第一方面，提供一种雨生红球藻游动细胞的培养方法，包括将雨生红球藻在含有乙酸钠、酵母提取物和其他无机营养的培养基中进行培养的步骤。
上述培养基中，乙酸钠浓度为0.5-3g/L，酵母提取物浓度为0.5-3g/L；其中，乙酸钠不仅为红球藻提供异养的有机碳源，而且还明显导致藻细胞光自养的光合综合性能指数发生改变；酵母提取物为普通市售酵母提取物，含有氨基酸、核苷酸、肽、B族维生素、微量元素、各种形式的氮和磷等营养物质，可明显促进雨生红球藻游动细胞的快速增殖。
上述培养基中，所述其他无机营养包含：硝酸钠1000mg/L，七水硫酸镁75mg/L，二水氯化钙36mg/L，磷酸二氢钾40mg/L，碳酸钠20mg/L，柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵3mg/L，乙二胺四乙酸钠1mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，五水硫酸铜0.08mg/L，四水氯化锰1.81mg/L，二水钼酸钠0.39mg/L，六水硝酸钴0.05mg/L，硼酸2.86mg/L。
上述培养方法中，培养的条件为：培养温度为20-25℃、光照强度为30-60μmol m- 2s-1，培养时间为3-6天。
采用上述的培养方法，获得的雨生红球藻的游动细胞占总细胞数的85％以上，细胞密度可达105个/ml以上。
本发明的第二方面，提供一种利用游动细胞制备原生质体的方法，包括：将雨生红球藻的游动细胞以一定初始密度重悬于含有胶原蛋白酶的缓冲液中进行酶解的步骤和制备雨生红球藻原生质体悬液的步骤。
上述方法中，所述胶原蛋白酶选自胶原蛋白酶I，II，III或IV类型。
上述方法中，所述胶原蛋白酶的浓度为0.2-0.6％(m/v)。
上述方法中，所述酶解的条件为：在35±1℃和100rpm转速下酶解15-60分钟。
上述方法中，制备雨生红球藻原生质体悬液的步骤具体为：离心收集酶解后的细胞，利用缓冲液进行洗涤，然后重悬在缓冲液中，获得雨生红球藻原生质体悬液。
上述方法中，缓冲液中主要成分为：0.5mM CaCl2，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05MTris-HCl(pH 7.8)。
上述方法中，游动细胞的初始密度为0.5-3×105个/ml。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了一种培养基成分及其培养条件，可用于快速富集培养获得雨生红球藻游动细胞，采用本发明的培养基和培养条件进行培养，获得的雨生红球藻的游动细胞占总细胞数的85％以上，细胞密度可达105个/ml以上，在短时间内实现了雨生红球藻的大量繁殖。
(2)本发明还提供了一种利用雨生红球藻游动细胞制备原生质体的方法，通过含有胶原蛋白酶成分的酶解液，可以高效处理获得雨生红球藻原生质体，原生质体的得率最高可达88％以上。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
将雨生红球藻(SCCAP K-0084)不动细胞接种于含0.5g/L乙酸钠和3g/L酵母提取物的BG11培养基中(BG11培养基中含有硝酸钠1000mg/L，七水硫酸镁75mg/L，二水氯化钙36mg/L，磷酸二氢钾40mg/L，碳酸钠20mg/L，柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵3mg/L，乙二胺四乙酸钠1mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，五水硫酸铜0.08mg/L，四水氯化锰1.81mg/L，二水钼酸钠0.39mg/L，六水硝酸钴0.05mg/L，硼酸2.86mg/L)，于25℃、持续光强为60μmol m-2s-1条件下培养3天可获得游动细胞占细胞总数85％的培养物。
配制含0.5mM CaCl2，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05M Tris-HCl(pH 7.8)的缓冲液，加入胶原蛋白酶(Collagenase IV)至终浓度为0.2％(m/v)，将上述制备的游动细胞以3×105个/ml的密度重悬于酶解缓冲液中，控制温度在35℃、摇动速度100rpm下酶解45min，原生质体得率可达84％。
实施例2
雨生红球藻(NIES-144)不动细胞接种于与实施例1中无机营养相同的培养基中，乙酸钠和酵母提取物的浓度分别为3g/L和0.5g/L，于25℃、持续光强为30μmol m-2s-1条件下培养3天可获得游动细胞占细胞总数90％的培养物。
将细胞以1×105个/ml的细胞密度，重悬在含有0.4％胶原蛋白酶(CollagenaseⅢ)、0.5mM CaCl2，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05M Tris-HCl(pH 7.8)的酶解缓冲液中，控制温度在35℃、摇动速度100rpm下酶解30min，原生质体得率可达85％。
实施例3
雨生红球藻(SAG 34-1b)不动细胞接种于与实施例1中无机营养相同的培养基中，乙酸钠和酵母提取物的浓度分别为2g/L和2g/L，于25℃、持续光强为30μmol m-2s-1条件下培养3天可获得约90％的游动细胞。
将细胞以2×105个/ml的细胞密度，重悬在含有0.6％胶原蛋白酶(CollagenaseI)、0.5mM CaCl2，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05M Tris-HCl(pH 7.8)的酶解缓冲液中，控制温度在35℃、摇动速度100rpm下酶解50min，原生质体得率可达88％。
以上实施例中，将所用的藻种替换为NIES-144或SAG 34-1b等其他株系的雨生红球藻，或将所用的胶原蛋白酶更换为其他Collagenase I或Ⅲ等胶原蛋白酶所得结果相似。
对比例1
将雨生红球藻(SCCAP K-0084)不动细胞接种于含4g/L乙酸钠的BG11培养基中，于25℃、持续光强为60μmol m-2s-1条件下培养3天，可获得游动细胞占细胞总数74％的培养物。
配制含0.5mM CaCl2，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05M Tris-HCl(pH 7.8)的缓冲液，加入胶原蛋白酶(Collagenase IV)至终浓度为0.2％(m/v)，将上述制备的游动细胞以3×105个/ml的密度重悬于酶解缓冲液中，控制温度在35℃、摇动速度100rpm下酶解45min，原生质体得率为72％。
对比例2
将雨生红球藻(SCCAP K-0084)不动细胞接种于含0.5g/L乙酸钠和0.3g/L酵母提取物的BG11培养基中，于25℃、持续光强为60μmol m-2s-1条件下培养3天可获得游动细胞占细胞总数78％的培养物。
配制含0.5mM CaCl2，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05M Tris-HCl(pH 7.8)的缓冲液，加入胶原蛋白酶(Collagenase IV)至终浓度为0.2％(m/v)，将上述制备的游动细胞以3×105个/ml的密度重悬于酶解缓冲液中，控制温度在35℃、摇动速度100rpm下酶解45min，原生质体得率可达75％。
对比例3
将雨生红球藻(SCCAP K-0084)不动细胞接种于含0.5g/L乙酸钠和0.5g/L酵母提取物的BG11培养基中，于25℃、持续光强为60μmol m-2s-1条件下培养3天可获得游动细胞占细胞总数76％的培养物。
配制含0.5mM CaCl2，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05M Tris-HCl(pH 7.8)的缓冲液，加入胶原蛋白酶(Collagenase IV)至终浓度为0.2％(m/v)，将上述制备的游动细胞以3×105个/ml的密度重悬于酶解缓冲液中，控制温度在35℃、摇动速度100rpm下酶解45min，原生质体得率可达73％。
由上述实施例和对比例可以看出，在BG11培养基中添加乙酸钠和酵母提取物，可以用于雨生红球藻生活史中特定的细胞(游动细胞)快速培养富集，并以此为对象进行原生质体的制备。培养基中酵母提取物的加入量是经过多次试验优化得到的，酵母提取物加入的过多或过少都会影响游动细胞的数量和原生质体的得率，经试验验证，在BG11培养基中添加浓度为0.5-3g/L的乙酸钠和浓度为0.5-3g/L的酵母提取物，其最有利于雨生红球藻游动细胞的培养和原生质体的制备。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术的技术人员在本发明批露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种雨生红球藻游动细胞的培养方法，其特征在于，将雨生红球藻不动细胞接种于含乙酸钠和酵母提取物的BG11培养基中培养，培养温度为25℃、光照强度为30-60μmol m- 2s-1，培养时间为3天；
所述培养基中，乙酸钠浓度为0.5-3g/L，酵母提取物浓度为0.5-3g/L；
所述BG11培养基配方为：硝酸钠1000mg/L，七水硫酸镁75mg/L，二水氯化钙36mg/L，磷酸二氢钾40mg/L，碳酸钠20mg/L，柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁铵3mg/L，乙二胺四乙酸钠1mg/L，七水硫酸锌0.22mg/L，五水硫酸铜0.08mg/L，四水氯化锰1.81mg/L，二水钼酸钠0.39mg/L，六水硝酸钴0.05mg/L，硼酸2.86mg/L。
2.一种利用权利要求1所述的培养方法得到的雨生红球藻游动细胞制备原生质体的方法，其特征在于，将权利要求1培养得到的雨生红球藻游动细胞以1-3×105个/ml的密度重悬于含有胶原蛋白酶的缓冲液中进行酶解，即得；
所述胶原蛋白酶的浓度为0.2-0.6％。
3.如权利要求2所述的制备原生质体的方法，其特征在于，所述胶原蛋白酶选自胶原蛋白酶I，II，III或IV类型。
4.如权利要求2所述的制备原生质体的方法，其特征在于，酶解条件为：在35±1℃和100rpm转速下酶解15-60分钟。
5.如权利要求2所述的制备原生质体的方法，其特征在于，缓冲液中主要成分为：0.5mMCaCl2，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05M Tris-HCl，pH 7.8。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610218349.1A CN105647810B (zh) | 2016-04-08 | 2016-04-08 | 雨生红球藻游动细胞的培养方法及原生质体的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610218349.1A CN105647810B (zh) | 2016-04-08 | 2016-04-08 | 雨生红球藻游动细胞的培养方法及原生质体的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105647810A CN105647810A (zh) | 2016-06-08 |
| CN105647810B true CN105647810B (zh) | 2019-06-21 |
Family
ID=56496191
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610218349.1A Expired - Fee Related CN105647810B (zh) | 2016-04-08 | 2016-04-08 | 雨生红球藻游动细胞的培养方法及原生质体的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105647810B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109680008B (zh) * | 2018-11-22 | 2022-03-15 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种雨生红球藻遗传转化方法 |
| CN111909957B (zh) * | 2020-08-13 | 2022-07-15 | 深圳大学 | 一种雨生红球藻的遗传转化方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1560227A (zh) * | 2004-02-25 | 2005-01-05 | 福建师范大学 | 雨生红球藻原生质体制备与再生技术 |
| CN101173214A (zh) * | 2007-10-30 | 2008-05-07 | 中国科学院南海海洋研究所 | 雨生红球藻的虾青素高产突变株 |
-
2016
- 2016-04-08 CN CN201610218349.1A patent/CN105647810B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1560227A (zh) * | 2004-02-25 | 2005-01-05 | 福建师范大学 | 雨生红球藻原生质体制备与再生技术 |
| CN101173214A (zh) * | 2007-10-30 | 2008-05-07 | 中国科学院南海海洋研究所 | 雨生红球藻的虾青素高产突变株 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 雨生红球藻原生质体制备与再生;王明兹 等;《中国藻类学会第十一次学术讨论会论文摘要》;20011101;第1页第1-4段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105647810A (zh) | 2016-06-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102138436A (zh) | 一种富硒北冬虫夏草的培育方法 | |
| CN102094061B (zh) | 一种利用微藻生产叶黄素的方法 | |
| CN108410737B (zh) | 一种紫球藻的两步培养法 | |
| WO2012071983A1 (zh) | 一种微藻高产率异养培养的方法 | |
| CN103299826A (zh) | 可提高虫草素含量的北虫草培养方法 | |
| CN105441525A (zh) | 一种通过共培养提高以蔗糖为碳源下红球藻虾青素产率的方法 | |
| CN106701588A (zh) | 一种富硒小球藻的培养方法 | |
| CN107418993A (zh) | 褪黑素在提高雨生红球藻中虾青素含量中的应用 | |
| CN106190853A (zh) | 一种高产藻蓝蛋白的红藻培养方法 | |
| CN104830691A (zh) | 小球藻的培养方法 | |
| WO2022247225A1 (zh) | 共生菌组合物及其制备方法和微藻的培养方法 | |
| CN105647810B (zh) | 雨生红球藻游动细胞的培养方法及原生质体的制备方法 | |
| CN102948325A (zh) | 一种北虫草高效快速栽培技术 | |
| CN106520559B (zh) | 一种小球藻高效率光自养培养方法 | |
| CN106434817B (zh) | 一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法 | |
| CN106399108A (zh) | 一种简便高效的雨生红球藻营养细胞培养和采收方法 | |
| CN102726211A (zh) | 野生红土鸡枞菌人工驯化母种的制备方法 | |
| CN109392600A (zh) | 一种富硒蛹虫草的培养方法 | |
| CN104212720A (zh) | 一种用味精离交母液生产微藻生物质的方法 | |
| CN108179124B (zh) | 一种用于培养钝顶螺旋藻的复合培养基 | |
| CN107988121B (zh) | 一种培养钝顶螺旋藻的工艺 | |
| CN102703332B (zh) | 一株产花生四烯酸油脂的菌株及其应用 | |
| CN107189946A (zh) | 一种避免微藻光抑制以提高虾青素产量的方法 | |
| CN112831449B (zh) | 一种利用升温进行葛仙米藻殖段发生的扩种方法 | |
| CN114836324A (zh) | 雨生红球藻耐高温突变株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190621 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |