CN108179124B - 一种用于培养钝顶螺旋藻的复合培养基 - Google Patents

Abstract

本发明属于藻类培养技术领域，公开了一种用于培养钝顶螺旋藻的复合培养基，其包括如下原料，硝酸钠，碳酸氢钠，氯化钠，柠檬酸铁铵，钼酸钠，硫酸锌，丙酰胺，麦麸提取液，水稻秸秆提取液。本发明培养基使用了大量农业废弃物，原料组分相对较少，节约了成本。

Description

一种用于培养钝顶螺旋藻的复合培养基

技术领域

本发明属于藻类培养技术领域，具体涉及一种用于培养钝顶螺旋藻的复合培养基。

背景技术

螺旋藻，亦称 “节旋藻”。蓝藻纲，颤藻科。藻体为单列细胞组成的不分枝丝状体，胶质鞘无或只有极薄的鞘，并有规则螺旋状，以形成藻殖段繁殖。无异形胞和后壁孢子。约38种，多数生长在碱性盐湖。目前国内外均有大规模人工培育，主要为钝顶螺旋藻、极大螺旋藻和印度螺旋藻三种。可食用，营养丰富，蛋白质含量高达60%-70%。在自然水域，其大量繁殖会形成水华。螺旋藻的最佳生长pH范围是3-11.0，当pH高于11.0时将不利于生长。在营养和温度正常的情况下，光照就成为影响螺旋藻生长的一个重要因素，在室外培养，光源主要是太阳；在实验中，一般使用冷白光源，生长培养所需光强度约为3700-4000 lx。螺旋藻的生长不仅受到光强度的影响，而且因光的色值不同，反应各异。

钝顶螺旋藻是世界上广泛推行的优良品种，这种藻类已被人类广泛采集食用了几百年。1960年法国科学家Clement对钝顶螺旋藻的营养价值和保健功能进行了大量研究，发现它有巨大的经济和社会效益。以后各国学者也作了广泛的研究。钝顶螺旋藻的蛋白质最高，藻蓝蛋白含量最多，SOD活性高，可溶性蛋白量高。 钝顶螺旋藻应用比较广泛、现在人们主要研究究的也是钝顶螺旋藻、原因在于钝顶螺旋藻的营养成份比其它如极大螺旋藻、盐泽螺旋藻要高的多，具有关资料显示，钝顶螺旋藻蛋白质含量最低都已达到56%以上，全国的钝顶螺旋藻蛋白质平均含量在63%左右、大康螺旋藻蛋白质含更是高达65%以上。现在螺旋藻产区主要分布在南方程海、福建和北方内蒙古鄂乐多斯，其中以南方程海的为佳。

钝顶螺旋藻的作用比较多，一般最常用也最主要的作用为提高机体免疫力、促进肠胃蠕动、补充机体的常规元素和微量元素。值得一提的是螺旋藻藻蓝蛋白，藻蓝蛋是一种天然的食用色素、浴于水，不溶于油脂和醇类，是一种蓝色粉末。具有抗癌、促进细胞再生的功能、可作为高级的天然色素。螺旋藻多糖是螺旋藻细胞内的一种水溶性多糖，具有抗肿瘤、抗辐射、抗突变等生物活性，能提高机体细胞和体液的免疫功能，抵制癌细胞增殖，减轻辐射所引起的遗传损伤等，在防癌、抗衰老、增强机体免疫力等方面具有广阔的应用前景。螺旋藻可改善公众营养由于物质丰富后人们摄入了过多的高脂肪、高糖、高蛋白食品，造成了宏观营养过剩而微观营养不足的局面。因不良的饮食习惯已成为影响国民健康和患病较高的主要因素。

目前，钝顶螺旋藻的培养基研究较多，国内外广泛使用的是扎鲁克培养基，研究人员对培养基进行了改进，以用来提高藻类的生物量，例如中国专利技术“CN104830719A”公开了一种螺旋藻培养基，该培养基包括碳酸氢钠12g/L、过磷酸钙0.5g/L、氯化钾0.5g/L、氯化钠1g/L、硫酸镁0.2g/L、柠檬酸铁15mg/L、N2EDTA 10mg/L、芸苔素内酯0.01mg/L、胺鲜酯1mg/L、乙烯利1mg/L、ZnSO4·4H2O 23μg/L、MnCl2·4H2O178μg/L、CuSO4·5H2O 10μg/L、Na2MoO4·2H2O 7.3μg/L、CoCl2·6H2O 12μg/L和钪盐0.5mg/L，培养效果较常规培养基明显提高，但是存在原料组分多、成本较高等缺陷；开发一种成本低廉、螺旋藻生长速度快的培养基是钝顶螺旋藻培养技术中需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术钝顶螺旋藻培养基成本高、藻细胞生长缓慢等缺陷，提供了一种用于培养钝顶螺旋藻的复合培养基。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种用于培养钝顶螺旋藻的复合培养基，其包括如下原料，硝酸钠，碳酸氢钠，氯化钠，柠檬酸铁铵，钼酸钠，硫酸锌，丙酰胺，麦麸提取液，水稻秸秆提取液。

进一步地，

所述复合培养基按照如下工艺制备而得：取硝酸钠0.3-0.5g，碳酸氢钠0.3-0.5g，氯化钠0.1-0.2g，柠檬酸铁铵0.05-0.07g，钼酸钠0.02-0.03g，硫酸锌0.01-0.02g，丙酰胺0.001-0.002g，麦麸提取液10-20ml，水稻秸秆提取液20-30ml，余量为水，调整pH为8-9，定容至1L，即得。

进一步地，

所述麦麸提取液按照如下工艺制备而得：将麦麸研磨粉碎，然后置于反应罐中,加入2倍重量的6M的盐酸，在60℃温度下搅拌水解8小时，搅拌速度为100rpm，过滤收集滤液，然后用2M的氢氧化钠溶液中和残余盐酸，调整溶液pH为8-9，即得。

进一步地，

所述水稻秸秆提取液按照如下工艺制备而得：将水稻秸秆置于粉碎机中粉碎，然后添加到2倍重量的浓度为5M的KOH溶液中，搅拌均匀，加热至60℃，然后保温条件下浸泡5h，过滤收集滤液，再往滤液中添加浓度为3M的磷酸溶液，调整溶液的pH为8-9，即得。

本发明还要求保护上述任其一所述的复合培养基在钝顶螺旋藻培养中的应用。

本发明取得的有益效果主要包括几个方面：

本发明复合培养基的效果明显优于常规的扎鲁克培养基；本发明复合培养基中麦麸提取液和秸秆提取液相互协同，使得培养基的营养物质更加全面，可以有效促进藻细胞增殖，而且有效利用了农业废弃物，使得培养基的成本更加低廉，应用前景广阔。

本发明培养基中通过添加丙酰胺化学刺激物可以改变钝顶螺旋藻的密度、胞外多糖以及胞内多糖含量；通过多浓度梯度试验发现，0.001－0.002g/L的添加量对钝顶螺旋藻的密度、胞外多糖以及胞内多糖含量的提高幅度最明显，当浓度提高到提高0.004g/L，反而会降低顶螺旋藻的密度、胞外多糖以及胞内多糖含量，可见，丙酰胺对上述各指标是先促进后抑制的调控方式。

本发明对农业废弃物秸秆进行了粉碎和水解处理，使得氮、磷、钾、钙、镁以及多糖等得到有效利用；提取工艺中采用酸碱中和方式，在平衡pH度的同时，增加了氮源以及钠钾离子的供应量，一举两得；麦麸属于农产品加工副产物，其含有蛋白质，脂肪，糖、矿物质以及维生素等，但是藻类利用率较低，通过处理后，提高了各养分的浸出率，利用率大大提高；本发明复合培养基使用了农产品副产物以及农业废弃物，使得培养基成本大大降低，实现了变废为宝，提高了工业附加值，企业利润大大提高。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种用于培养钝顶螺旋藻的复合培养基，其包括如下原料，按照1L配方计：

硝酸钠0.3g，碳酸氢钠0.5g，氯化钠0.1g，柠檬酸铁铵0.07g，钼酸钠0.02g，硫酸锌0.01g，丙酰胺0.001g，麦麸提取液10ml，水稻秸秆提取液30ml，余量为水，调整pH为9，定容至1L；

所述麦麸提取液按照如下工艺制备而得：

将麦麸研磨粉碎，然后置于反应罐中, 加入2倍重量的6M的盐酸，在60℃温度下搅拌水解8小时，搅拌速度为100rpm，过滤收集滤液，然后用2M的氢氧化钠溶液中和残余盐酸，调整溶液pH为9，即得；

所述水稻秸秆提取液按照如下工艺制备而得：

将水稻秸秆置于粉碎机中粉碎，然后添加到2倍重量的浓度为5M的KOH溶液中，搅拌均匀，加热至60℃，然后保温条件下浸泡5h，过滤收集滤液，再往滤液中添加浓度为3M的磷酸溶液，调整溶液的pH为9，即得。

实施例2

一种用于培养钝顶螺旋藻的复合培养基，其包括如下原料，按照1L配方计：

硝酸钠0.5g，碳酸氢钠0.3g，氯化钠0.2g，柠檬酸铁铵0.05g，钼酸钠0.03g，硫酸锌0.02g，丙酰胺0.002g，麦麸提取液20ml，水稻秸秆提取液20ml，余量为水，调整pH为8，定容至1L；

所述麦麸提取液按照如下工艺制备而得：

将麦麸研磨粉碎，然后置于反应罐中, 加入2倍重量的6M的盐酸，在60℃温度下搅拌水解8小时，搅拌速度为100rpm，过滤收集滤液，然后用2M的氢氧化钠溶液中和残余盐酸，调整溶液pH为8，即得；

所述水稻秸秆提取液按照如下工艺制备而得：

将水稻秸秆置于粉碎机中粉碎，然后添加到2倍重量的浓度为5M的KOH溶液中，搅拌均匀，加热至60℃，然后保温条件下浸泡5h，过滤收集滤液，再往滤液中添加浓度为3M的磷酸溶液，调整溶液的pH为8，即得。

实施例3

本发明复合培养基培养钝顶螺旋藻效果测试：

取对数生长期的钝顶螺旋藻接种到培养基中进行培养，光强度控制在4000lux，温度控制在32℃，通入空气流量为0.4vvm。

实验组为实施例1；对照组1使用扎鲁克培养基；对照组2，不添加麦麸提取液，其余同实施例1；对照组3，不添加水稻秸秆提取液，其余同实施例1；其余培养条件同上，实验组和对照组1-3相同。每隔天通过分光光度计来检测培养基中钝顶螺旋藻的细胞密度（OD560），其中第0天的密度为接种时的密度；为具体见表1：

表1

天数	实验组	对照组1	对照组2	对照组3
					0	0.22	0.22	0.22	0.22
2	0.67	0.41	0.49	0.54
					4	1.49	0.95	0.93	1.08
6	2.51	1.68	1.87	2.06
					8	3.16	2.12	2.37	2.59

结论：如上表1所示，四个组别接种量相当，经过培养后，本发明钝顶螺旋藻的细胞密度在各个时间点明显优于对照组1-3，其中，培养到第8天时，藻细胞密度分别是对照组1-3的1.49、1.33、1.22倍；说明，本发明复合培养基的效果明显优于常规的扎鲁克培养基；本发明复合培养基中麦麸提取液和秸秆提取液相互协同，使得培养基的营养物质更加全面，可以有效促进藻细胞增殖，而且有效利用了农业废弃物，使得培养基的成本更加低廉，应用前景广阔；上述结果表明，说明本发明供的培养基具有明显的培养优势。

实施例4

丙酰胺对钝顶螺旋藻增殖以及多糖含量的影响：以实施例2为研究例；分别设置丙酰胺多个浓度梯度，分别为：0g/L，0.0005g/L，0.001g/L，0.002g/L，0.004g/L；

操作流程：培养6天，通过分光光度计来检测培养基中钝顶螺旋藻的细胞密度（OD560），然后藻液经4000r/min离心，取上清液，调pH7，逐渐加入20%醋酸铅液至沉淀完全，以除去蛋白质、色素、胶体等物质，并加入与醋酸铅液等体积的10%的硫酸钠溶液，至不再产生沉淀为止，然后加入95 %乙醇沉淀得螺旋藻胞外多糖；离心所得藻泥水洗后加去离子水；超声波破碎，调至pH10，用热水抽提法提取螺旋藻胞内多糖，用三氯乙酸(TCA)法去蛋白质和细胞色素；硫酸－苯酚法检测多糖含量。

表2

丙酰胺g/L	细胞密度OD560	胞内多糖含量％(以细胞干重计)	胞外多糖含量g/L
				0	2.11	4.06	0.45
0.0005	2.23	4.23	0.49
				0.001	2.46	5.12	0.76
0.002	2.57	5.23	0.72
				0.004	2.08	4.15	0.51

结论：从表2可以看出，通过添加丙酰胺可以改变钝顶螺旋藻的密度、胞外多糖以及胞内多糖含量；通过多浓度梯度试验发现，0.001－0.002g/L的添加量对钝顶螺旋藻的密度、胞外多糖以及胞内多糖含量的提高幅度最明显，当浓度提高到提高0.004g/L，反而会降低顶螺旋藻的密度、胞外多糖以及胞内多糖含量，可见，丙酰胺对上述各指标是先促进后抑制的调控方式。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种用于培养钝顶螺旋藻的复合培养基，其特征在于，所述复合培养基按照如下工艺制备而得：取硝酸钠0.3-0.5g，碳酸氢钠0.3-0.5g，氯化钠0.1-0.2g，柠檬酸铁铵0.05-0.07g，钼酸钠0.02-0.03g，硫酸锌0.01-0.02g，丙酰胺0.001-0.002g，麦麸提取液10-20ml，水稻秸秆提取液20-30ml，余量为水，调整pH为8-9，定容至1L，即得；

所述麦麸提取液按照如下工艺制备而得：将麦麸研磨粉碎，然后置于反应罐中, 加入2倍重量的6M的盐酸，在60℃温度下搅拌水解8小时，搅拌速度为100rpm，过滤收集滤液，然后用2M的氢氧化钠溶液中和残余盐酸，调整溶液pH为8-9，即得；

所述水稻秸秆提取液按照如下工艺制备而得：将水稻秸秆置于粉碎机中粉碎，然后添加到2倍重量的浓度为5M的KOH溶液中，搅拌均匀，加热至60℃，然后保温条件下浸泡5h，过滤收集滤液，再往滤液中添加浓度为3M的磷酸溶液，调整溶液的pH为8-9，即得。

2.权利要求1所述的复合培养基在钝顶螺旋藻培养中的应用。