CN102925359A - 一种海水螺旋藻富硒培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海水螺旋藻富硒培养方法。它选择经过海水驯化的钝顶螺旋藻、极大螺旋藻和盐泽螺旋藻中的一种或者数种的组合作为藻种，以天然海水或者人工海水或两者任意比例的混合物为基础，然后再加入硒元素，硒元素的浓度范围为1～160mg/L，以此作为培养基，将藻种接种至含有培养基的光生物反应器中进行培养，然后对培养好的螺旋藻体进行收集得到海水螺旋藻，由此获得的富硒海水螺旋藻。本发明具有方法简单、硒添加浓度低、培养基可长期循环利用、操作简便、富硒能力强、成本廉价、绿色安全等优点。海水螺旋藻生物活性物质与藻体内的有机硒协同效应发挥作用，可用于补硒添加剂、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、防治克山病等由于缺硒、氧自由基氧化损伤引起的各种疾病。

Description

一种海水螺旋藻富硒培养方法

技术领域：

本发明涉及一种螺旋藻的培养方法，具体涉及一种海水螺旋藻富硒培养方法.

背景技术：

硒是人体和其他哺乳动物必需的微量元素之一，它具有重要的生理功能。它能提高机体免疫力；能显著地预防和抑制动物的自发性、移植性和化学致癌剂引起的肿瘤的发生、增殖、迁移和复发；对预防心血管疾病、抗衰老也有重要作用。补硒可以防治多种疾病，如克山病，心血管病、肝病及肿瘤等，应用硒预防肿瘤和其它疾病是一个方兴未已的热点。基于有机硒的高生物活性和低毒性，利用生物体富集有机硒的研究受到广泛关注。市场上多种含硒、富硒的产品相继问世，如富硒酵母、富硒蘑菇、富硒多糖、富硒茶、富硒鸡蛋等，但是这些产品存在硒含量低或成本高亦或富硒载体不理想等问题。

螺旋藻属于蓝藻门、蓝藻纲、段殖藻目、颤藻科、螺旋藻属（Spirulina）。螺旋藻蛋白质含量60-70%，含有8种人体必需的氨基酸。螺旋藻还含有丰富的藻蓝蛋白（包括C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白2个组分）、β-胡萝卜素、γ-亚麻酸、多糖、不饱和脂肪酸等活性成分，营养保健及药用价值很高。美国、日本和墨西哥的科学家对螺旋藻的毒理和药理学作用进行了研究，证明它有多种生物活性，可作为治疗多种疾病的药物和辅助药物。归纳如下：（1）增强机体免疫力，减缓细胞衰老速度降低胆固醇，具有防癌、抗癌、抗辐射作用；（2）刺激前列腺素合成，刺激生理功能；（3）促进新陈代谢，加速伤口愈合，防止皮肤角质化；（4）对贫血、肝炎、糖尿病、胃及十二指肠溃疡、视力减退等有良好的疗效；（5）对严重营养不良病人的调养，病后虚弱者的恢复，儿童增加营养和老年人身体保健、延年益寿均有特殊的效果。毒理学研究证明，即使长期食用，螺旋藻也是安全无毒的。

螺旋藻生长速度快，易于大规模培养，对硒有较强的耐性，是进行硒有机化的理想载体。可以通过富硒培养进一步提高其营养及医疗保健功能，从而促进相关深加工产品的开发。

目前螺旋藻主要采用淡水培养基进行培养，国际上仅有数家企业或机构采用海水培养。淡水螺旋藻富集硒元素需要添加较高的无机硒浓度，低硒浓度的富集效果不好，然而在较高浓度的无机硒培养时，对藻生长产生一定的不良影响，为了缓解高浓度硒的毒害，藻细胞对（亚）硒酸盐类的氧化还原物质产生一甲基硒和二甲基硒气体和红色单质硒（Se）沉淀，前者对被释放在空气中，对藻细胞、环境和人类具有毒性，后者是不溶沉淀，沉积在培养容器的底部，难以有效利用。因此，高浓度的无机硒培养螺旋藻，容易导致培养失败，培养物难以连续循环培养，失败培养物若倾倒排放于环境中，不仅浪费硒原料和其它培养基肥料，培养物中的硒元素和其它富营养盐成分将产生潜在的环境问题。

发明内容：

本发明的目的是提供一种能得到富含硒元素的螺旋藻的海水螺旋藻富硒培养方法。

本发明的海水螺旋藻富硒培养方法，其特征在于，选择经过海水驯化的钝顶螺旋藻、极大螺旋藻和盐泽螺旋藻中的一种或者数种的组合作为藻种，以天然海水或者人工海水或两者任意比例的混合物为基础，然后再加入硒元素，硒元素的浓度范围为1~160 mg/L，以此作为培养基，将藻种接种至含有培养基的光生物反应器中进行培养，然后对培养好的螺旋藻体进行收集得到海水螺旋藻。

收集螺旋藻可以先对培养好的螺旋藻体进行浓缩，得到富硒海水螺旋藻藻泥，用清水洗掉附着在藻细胞表面的盐分、无机硒，经喷雾烘干得到富硒海水螺旋藻藻粉，可为医药、保健品、食品、食品添加剂、饲料添加剂等生物制品提供原料，对癌症、克山病、白内障、糖尿病和动脉硬化等等由于缺硒、氧自由基氧化损伤引起的各种疾病均有一定程度的防治作用。

所述的天然海水或人工海水，其海水的盐度范围优选为20~60‰。

所述的人工海水优选为南海Ⅱ号改良的人工海水培养基，其含有碳酸氢钠8 g/L、氯化钠30 g/L、硝酸钠0.1 g/L、七水硫酸亚铁0.1 g/L、  尿素0.05 g/L、氯化钙0.04 g/L、N：P：K复合肥0.3 g/L、硫酸钾1 g/L、硫酸镁1 g/L，余量为水。将上述组份混合均匀即为南海Ⅱ号改良的人工海水培养基。

所述的加入硒元素是以含硒化合物的形式加入，所述的含硒化合物优选为亚硒酸盐或硒酸盐，所述的亚硒酸盐进一步优选为亚硒酸钠或亚硒酸钾；所述的硒酸盐进一步优选为硒酸钠或硒酸钾。

所述的将藻种接种含有培养基的光生物反应器中进行培养，其培养条件优选为温度为25-35℃，光照500-8000 Lux，pH 8~9.5。

收集螺旋藻体后的培养基补充细胞吸收富集部分所带走的硒元素后，可以再循环利用进行培养海水螺旋藻，确保富硒培养的长期可持续性。

所述的经过海水驯化的钝顶螺旋藻、极大螺旋藻和盐泽螺旋藻，其中藻种海水驯化是指通过向淡水藻种培养物种逐步添加氯化钠、海盐或天然海水并经反复分离纯化所得，为一种常规方法。

本发明的培养海水螺旋藻的光生物反应器包括跑道池、圆池及柱式、管式、平板式、罐式、袋式等任何形状或结构的光生物反应器，可以建在沿海滩涂荒地上，因此可少占耕地，充分利用自然资源。在培养海水螺旋藻的繁殖过程中，可以采用叶轮搅拌机、悬臂式搅拌机、鼓泡充气等方式搅拌，培养的光源可以为太阳光、LED灯、白炽灯、光管。培养方式可使采用分批培养、半连续培养或连续培养。

本发明选用经过驯化的海水螺旋藻作为富硒的载体，与淡水原种相比，海水螺旋藻具有更好的适应强光、高温和高盐度等优良特性；海水螺旋藻在增殖过程中吸收亚硒酸盐效率高，转化能力强，对低浓度硒具有十分显著的富集效应，避免了添加高硒所造成的浪费，降低了富硒螺旋藻的培养成本，而且对环境绿色友好，这种优越性是淡水螺旋藻无法比拟的。同时，在海水培养基中生长，能积累更多的蛋白质、藻胆蛋白、肌醇、活性多糖等生物活性物质，更容易转化为这些活性物质的有机硒；钙、镁、铁等矿质元素也远远高于淡水螺旋藻；大规模培养可用天然海水做基础培养基，海水中有80多种元素，许多是螺旋藻生长必需的，只需补充少量元素就可满足螺旋藻生长的需要，简化了养殖配方，节省大量营养盐，降低了成本，由于有些元素吸收的协同作用，提高藻体转化无机硒为有机硒的能力。富硒后的海水螺旋藻大大扩大了螺旋藻的应用范围，提高了螺旋藻的经济价值。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

藻种为中国科学院南海海洋研究所微藻组驯化的钝顶螺旋藻（Spirulina Platensis）海水SPH株系,该藻种采用正文内容所提及的盐度递增法从淡水藻种驯化而来，培养基以南海Ⅱ号改良的人工海水培养基为基础，所述的南海Ⅱ号改良的人工海水培养基含有碳酸氢钠8g/L、氯化钠30 g/L、硝酸钠0.1 g/L、七水硫酸亚铁0.1 g/L、尿素0.05 g/L、氯化钙0.04 g/L、N：P：K复合肥（购自中化集团公司，中化牌复合肥，N:P:K=15:15:15）0.3 g/L、硫酸钾1 g/L、硫酸镁1 g/L，余量为水，于500 ml的三角瓶中加150 ml上述南海Ⅱ号改良的人工海水培养基，并加入不同体积浓度为10 mg/ml的硒母液（亚硒酸钠为溶质，水为溶剂），使得硒终浓度分别为0、40、60、80 mg/L，每个浓度梯度设两次重复，然后补加南海Ⅱ号改良的人工海水培养基达200 ml，由此得到海水螺旋藻的培养基。随后在海水螺旋藻的培养基中加入螺旋藻藻种，接种密度OD₅₆₀=0.351，培养温度（30±2）℃，光照强度5000 Lux左右，光照时间24 h.d^-1，每天定时摇藻4次，培养到7天，在此期间维持pH值在pH 8~9.5之间，收集藻细胞进行检测，结果：0、40、60、80 mg/L对应的藻细胞中的藻蓝蛋白中硒含量为0、354.0、402.2和372.9 mg/kg。

实施例2

藻种为中国科学院南海海洋研究所微藻组驯化的钝顶螺旋藻（Spirulina Platensis）海水SPH株系，该藻种采用正文内容所提及的盐度递增法从淡水藻种驯化而来。培养基以南海Ⅱ号改良的人工海水培养基为基础，所述的南海Ⅱ号改良的人工海水培养基含有碳酸氢钠8g/L、氯化钠30 g/L、硝酸钠0.1 g/L、七水硫酸亚铁0.1 g/L、尿素0.05 g/L、氯化钙0.04 g/L、N：P：K复合肥（购自中化集团公司，中化牌复合肥，N:P:K=15:15:15）0.3 g/L、硫酸钾1 g/L、硫酸镁1 g/L，余量为水，于500 ml的三角瓶中加150 ml南海Ⅱ号改良的人工海水培养基，并加入不同体积浓度为10 mg ml^-1的硒母液（亚硒酸钠为溶质，水为溶剂），使得硒终浓度分别为0、40，80，100，120，160 mg L^-，每个浓度梯度设两次重复，然后补加培养基达200 ml，得到海水螺旋藻的培养基。随后在海水螺旋藻的培养基中加入螺旋藻藻种，接种密度OD₅₆₀=0.251，培养温度（30±2）℃，光照强度5000 Lux左右，光照时间24 h.d^-1，每天定时摇藻4次，培养到7天，在此期间维持pH值在pH 8~9.5之间，过滤收集藻体。检测藻干重、藻蓝蛋白（CPC）和藻体中硒的含量，具体结果如表2所示。

表1不同浓度培养液中添加硒母液情况

表2不同浓度组对生物量、藻蓝蛋白、硒含量和富硒吸收的影响

实施例3

藻种为中国科学院南海海洋研究所微藻组驯化的钝顶螺旋藻（Spirulina Platensis）海水SPH株系，培养基以南海Ⅱ号改良的人工海水培养基为基础，所述的南海Ⅱ号改良的人工海水培养基含有碳酸氢钠8 g/L、氯化钠30 g/L、硝酸钠0.1 g/L、七水硫酸亚铁0.1 g/L、  尿素0.05 g/L、氯化钙0.04 g/L、N：P：K复合肥（购自中化集团公司，中化牌复合肥，N:P:K=15:15:15）0.3 g/L、硫酸钾1 g/L、硫酸镁1 g/L，余量为水，然后将16L的南海Ⅱ号改良的人工海水培养基加入到20 L玻璃缸反应器中，然后加入10 mg ml^-1的硒母液（亚硒酸钠），使得硒终浓度为40 mg L^-，由此得到海水螺旋藻的培养基，然后再加入藻种，接种密度OD₅₆₀=0.50，加入室外自然光培养。在光照情况下，每隔4个小时搅拌一次，每天补充培养基的蒸发量，培养到7天，在此期间维持pH值在pH 8~9.5之间，过滤收集藻体，在阳光充足的情况下，采收后每隔2-3天又可采收，实现了1个月的半连续培养和采收。检测藻体中硒的含量242.3 mg/kg。

实施例4

藻种为中国科学院南海海洋研究所微藻组驯化的钝顶螺旋藻（Spirulina Platensis）海水SPH株系，培养基以南海Ⅱ海水培养基为基础，所述天然海水培养基中,每升海水含有碳酸氢钠8 g/L、硝酸钠0.1 g/L、尿素0.05 g/L、N：P：K复合肥（同实施例1）0.3 g/L、七水硫酸亚铁0.01/g L，然后将16 L的南海Ⅱ号改良的人工海水培养基加入到250 m²玻开放式跑道培养池培养，2个培养池中分别加入10 mg ml^-1的硒母液（亚硒酸钠），加入从其它大池中过滤浓缩的藻泥作为藻种，接种密度OD₅₆₀=1.1，培养深度为29cm±0.5 cm,使得硒终浓度为1mg L^-1，室外太阳光下进行半连续培养，最大光强11万lux，温度范围25-42℃，白天叶轮搅拌机搅拌，培养物pH通过补充二氧化碳控制在8.3-10之间。培养3-5天后，培养光密度达到1.5左右时采收约30%的培养物，采收后的培养基过滤液补充少量氮磷铁元素(按起始培养基浓度补加20%)和硒元素（补加0.1 mg/L）后返回培养池，重复上述培养-采收-循环培养过程，连续培养2个月。采收样品（藻泥）经冲洗干净后，铺成2-3 mm薄片，太阳下晒干，将干燥样品分月收集并混合，按采收批次检测藻体中硒的含量，其硒含量为26.3±3.1 mg/kg。合并、粉碎并均匀混合所有采收样品，冻融法提取藻蓝蛋白，经60%饱和度硫酸铵盐析和透析处理的藻蓝蛋白，混合藻体中藻蓝蛋白含量19.32%（干重），藻蓝蛋白含硒量达到41.3 mg/kg。

Claims (7)

1. 一种海水螺旋藻富硒培养方法，其特征在于，选择经过海水驯化的钝顶螺旋藻、极大螺旋藻和盐泽螺旋藻中的一种或者数种的组合作为藻种，以天然海水或者人工海水或两者任意比例的混合物为基础，然后再加入硒元素，硒元素的浓度范围为1~160 mg/L，以此作为培养基，将藻种接种至含有培养基的光生物反应器中进行培养，然后对培养好的螺旋藻体进行收集得到海水螺旋藻。

2.根据权利要求1所述的海水螺旋藻富硒培养方法，其特征在于，所述的天然海水或人工海水，其海水的盐度范围为20~60‰。

3.根据权利要求1所述的海水螺旋藻富硒培养方法，其特征在于，所述的人工海水为南海Ⅱ号改良的人工海水培养基，其含有碳酸氢钠8 g/L、氯化钠30 g/L、硝酸钠0.1 g/L、七水硫酸亚铁0.1 g/L、  尿素0.05 g/L、氯化钙0.04 g/L、N：P：K复合肥0.3 g/L、硫酸钾1 g/L、硫酸镁1 g/L，余量为水。

4.根据权利要求1所述的海水螺旋藻富硒培养方法，其特征在于，所述的加入硒元素是以含硒化合物的形式加入，所述的含硒化合物为亚硒酸盐或硒酸盐。

5.根据权利要求4所述的海水螺旋藻富硒培养方法，其特征在于，所述的亚硒酸盐为亚硒酸钠或亚硒酸钾；所述的硒酸盐为硒酸钠或硒酸钾。

6.  根据权利要求1所述的海水螺旋藻富硒培养方法，其特征在于，所述的将藻种接种含有培养基的光生物反应器中进行培养，其培养条件为温度为25-35℃，光照500-8000 Lux，pH 8~9.5。

7.  根据权利要求1所述的海水螺旋藻富硒培养方法，其特征在于，收集螺旋藻体后的培养基补充细胞吸收富集部分所带走的硒元素后，再循环利用进行培养海水螺旋藻。