CN105602850A - 一种荒漠产油微藻规模化半连续培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荒漠产油微藻规模化半连续培养的方法，通过逐级（1-3级）的扩大培养，实现了小跑道池和大跑道池的培养并成功的实现了200？m²跑道池中的半连续培养，且2-3天就能收获一批油藻。利用本发明的方法，显著的缩短了培养周期，增加效率，在200？m²跑道池中半连续培养油脂产率可达到5.43？g/m²d，大大提高了油脂产率。本发明提供的方法极其适用于荒漠地区，可充分利用荒漠化闲置土地，不仅节约了成本，还充分利用了资源。

Description

一种荒漠产油微藻规模化半连续培养的方法

技术领域

本发明属于微藻培养生产技术领域，具体涉及一种荒漠产油微藻规模化半连续培养的方法。

背景技术

发展生物柴油首要就是不能与人争粮、与粮争地。中国荒漠化地区非常大，且自然条件严酷，生态环境脆弱，植被稀疏；但太阳辐射强，昼夜温差大，有利于植物体糖分和干物质积累。不占用耕地培养微藻，利用光能消耗CO₂的生长特性非常适宜在中国荒漠化地区培养利用。赵涛，苏青等(2011)报道，微藻生产阶段要消耗大量的CO₂，相比其他原料在荒漠中具有明显的环境效益，并且认为荒漠化地区发展微藻生物柴油是一种有效缓解能源危机和环境压力的解决途径，是最优选择(赵涛,苏青福,刘朝.中国荒漠化地区发展生物柴油的最优选择——微藻.资源科学.2011,33(8),1529-1536)。

微藻可以取代传统化石燃料，在经济的可行性方面还有较多技术需要突破。特别是大规模培养的微藻易遭受其它物种的污染和波动环境参数的影响而仅有较低的增长率和脂质产率，而要实现微藻产业链，微藻的培养工艺必须建立在室外大规模基础上。因此对规模培养进行可持续研究既必要也紧迫。

对于大规模的微藻生产，已经有开放的跑道池、管道和斜面的封闭系统建立。相比半封闭光生物反应器，虽然开放式跑道池中的产率低，但因其建筑费、运营费、及操作等方面具有明显低成本优点，因此被公认为最节约能量和低成本的反应器。开放式跑道池从20世纪50年代起已经用于微藻的大规模培养。现已普遍应用于微藻的商业化大规模培养中。世界上最大的跑道池位于美国加利福尼亚州，占地440,000m²，用于蓝藻食品生产。

半连续培养是一种简单有效的用于微藻生物燃料生产的策略，因它避免了低密度下微藻在平台期用时过长和在高密度时的后期生长抑制，使微藻一直处于指数生长期；然而半连续培养的次数是有限制，由于每次收获微藻细胞时，有部分死亡的藻细胞存留在原培养系统中，这会降低微藻的油含量。

但目前半连续培养的规模都不大，很多只在实验室研究此技术的可行性。同时也没有明确指出半连续培养的次数。中国荒漠化地区面积非常大，能源消耗也很大。

发明内容

针对上述问题，本发明提出了一种荒漠产油微藻规模化半连续培养的方法，该方法在荒漠地区建立水泥跑道池，综合使用半连续培养的技术，能显著降低产油微藻的生产成本，并同时提高油脂产率。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种荒漠产油微藻规模化半连续培养的方法，包括以下步骤：

1.小跑道池扩大培养

将生长至对数期的产油微藻接种到配好培养基的小跑道池中，通过搅拌使藻液流速为0.2-0.4m/s，搅拌时间段为8:00-17:00，同时在此时间段用地板刷每隔4小时对跑道池中的藻液推动一次，其余时间静置培养，当小跑道池中的藻液OD小于0.4时，控制光强≤800μmolm^-2s^-1，当小跑道池中的藻液OD达到0.4时不需控制光强。

小跑道池，尺寸为0.5-1.5m×3.5-4.5m×0.2-0.5m；

2.大跑道池半连续培养

将小跑道池中培养至对数期的藻液接种至配好培养基大跑道池中。

通过搅拌使藻液流速达0.2-0.4m/s，白天搅拌，搅拌时间为8:00-17:00，且在此时间段每天辅助以人工推动跑道池底部的藻，即用地板刷每隔4小时对跑道池中的藻液推动一次，其余时间静置培养。当200m²跑道池培养7-10天后，收获1/3-2/3的藻液，离心，检测初始藻液含油量，大跑道池中加入等体积的半连续培养培养基，进行下一轮半连续培养，培养2天后，再收获1/3-2/3的藻液，加入等体积半连续培养培养基且向半连续培养培养基中添加0-0.25g/L的尿素(即每隔一次半连续培养，半连续培养培养基中添加0-0.25g/L的尿素)。如此循环，直到收获的藻液油含量与初始藻液含油量相比下降了15-20％即停止培养，收获整个跑道池的藻液。

所述的培养基配方包括：

所述的培养基组分包括：

其余成分为地下水。

所述的半连续培养培养基的配方包括：

其余成分为地下水。

所述的大跑道池，尺寸为3-6m×20-40m×0.2-0.5m。

跑道池中藻液pH及温度根据所用微藻的最适pH及生长温度进行常规调节；

以上所述的方案中，优选的，跑道池的架设选择在荒漠地区的平坦沙地或盐碱地选址，同时建立温棚，使其能够一定范围内缓冲培养基温度，温棚内的温度控制在15℃～40℃。

以上所述的方案中，优选的，选取的产油微藻耐盐碱。

以上所述的方案中，优选的，培养池外壁系统采用水泥，外壁高于地面0.2-0.4m，有效阻止沙尘进入，选择性有效利用太阳光能，减少水分蒸发，同时起到保温效果。

以上所述的方案中，优选的，小跑道池的培养深度为10-20cm，培养基加上藻液总体积0.5-2m³，接种浓度OD为0.05-0.2。

以上所述的方案中，优选的，大跑道池的培养深度为10-20cm，培养基加上藻液总体积20-40m³，接种OD为0.05-0.2。

以上所述的方案中，优选的，所述的产油微藻为耐碱单针藻，CCTCCNO:M2013348。

以上所述方案中，优选的，步骤1中所述的生长至对数期的产油微藻培养方法包括：1级扩大培养：固体平板中微藻转接到液体中培养

250mL三角瓶中盛装200mL培养基，锡箔纸封口后灭菌，由接种环将固体平板中产油微藻接种到250mL三角瓶中(接种5-10环)，通入空气，初始通气量为0.2-0.4L/min，控制光强≤400μmolm^-2s^-1，直到三角瓶中颜色变绿后，通气量调整为0.4-0.6L/min。光强也可缓慢增加，控制光强≤1400μmolm^-2s^-1，通气时段6:00-20:00，其余时间静置培养。2级扩大培养

1L三角瓶盛装700mL培养基，5L三角瓶盛装3.5L培养基中，用锡纸封口后灭菌待用，接种1级扩大培养后生长至对数期的藻100mL到1L三角瓶中，培养到对数期，再将1L三角瓶中生长至对数期的藻液300mL到5L三角瓶中。

2级扩大培养过程中，白天通气培养通气时段为6:00-20:00，通气量1-1.8L/min，其余时间静置培养，光强控制与1级扩大培养相同。

3级扩大培养

18L透明桶分装15L培养液，将5L三角瓶中对数期的藻种，接种到18L透明桶内，通气管直接通入到桶底部，通气量是为1-1.8L/min，通气时段6:00-20:00，光强控制与1级培养相同；当18L桶的藻液培养到对数期时，即可接种至小跑道池。

以上所述的1-3级扩大培养均在荒漠地区的平坦沙地或盐碱地的温棚中。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1).选取合适的耐盐碱的产油微藻进行培养，可利用荒漠地区下面的咸水，充分利用荒漠化地，闲置地，不仅节约了成本，还充分利用了资源。

(2).与传统的分批培养，大大提高了油脂产率，在200m²跑道池中半连续培养油脂产率可达到5.43g/m²d，比分批培养(4.75g/m²d)增加14.3％。

(3).收获时间短，2-3天就能收获一批，显著的缩短了培养周期，增加效率。

(4).能成功在200m²跑道池进行半连续培养，培养规模之大，在国际上首创。

附图说明

图1为本发明实施例1逐级放大培养方法。

图2为5m²的跑道池。

图3为200m²的跑道池。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。

实施例：

一种荒漠产油微藻规模化半连续培养的方法，包括以下步骤：

1)跑道池建设和盐碱地选址

在荒漠地区的平坦沙地，建立玻璃温室使得温室内的温度控制在15℃～40℃，建设水泥跑道池。

所述的水泥跑道池包括2个5.04m²的跑道池，规格为4.8(长)×1.05(宽)×0.5(深)m；1个200m²的跑道池，尺寸为40×5×0.5m。

跑道池采用水泥材质，建设呈斜面(池底具有一定坡度，5.04m²米的跑道池，落差为5厘米；200m²的跑道池，落差为5厘米)，水泥池壁高出地面0.3m，跑道池内壁铺设锡纸。

2)培养基的配制：本实施例所用培养基均基于表1所述培养基，如未特别说明，本实施例涉及到的培养基即为配方为表1所示的培养基。

培养基的配方包括表1的成分，其余为水，所述的水为地下水，地下水pH值为9.40。

表1

3)微藻的扩大培养

以下扩大培养均在温室内进行，扩大培养的温度变化：白天20℃-35℃，夜间温度为18℃-25℃。

1级扩大培养：固体微藻转接到液体培养

250mL三角瓶中盛装200mL培养基，锡箔纸封口后灭菌，将耐碱单针藻(CCTCCNO:M2013348)固体平板，接种十环到250mL三角瓶中，通入空气，初始通气量为0.3L/min，控制光强≤400μmolm^-2s^-1，直到三角瓶中颜色变绿后，通气量调整为0.5L/min。光强也可缓慢增加，控制光强≤1400μmolm^-2s^-1，通气时段6:00-20:00，其余时间静置培养。

2级扩大培养

1L三角瓶盛装700mL培养基，5L三角瓶盛装3.5L培养基中，用锡纸封口后灭菌待用，接种1级扩大培养后生长至对数期的藻100mL到1L三角瓶中，培养到对数期，再将1L三角瓶中生长至对数期的藻液300mL到5L三角瓶中。

2级扩大培养过程中，通气管穿过棉塞，一端接0.22μm滤膜的空气过滤器，另一端通入藻液中，棉塞封口。通气培养通气时段为6:00-20:00，通气量1L/min，其余时间静置培养，以上1L和5L三角瓶均是如此处理。光强控制与1级培养相同。

3级和4级扩大培养

18L透明桶分装15L培养液，将5L三角瓶中对数期的藻种，接种到18L透明桶内，通气管接已灭菌的砂芯，直接通入到桶底部通气量是为1L/min，通气时段6:00-20:00，其余时间静置培养，光强控制与1级培养相同；当18L桶的藻液培养到对数期时，进行第4级扩大培养接种，即接种到两个5.04m²的跑道池中，培养深度为20cm，每个小跑道池的装液量是1000L，平均每个跑道池接种20桶。再启动转轮，搅拌使藻液流速为0.3m/s，搅拌时间段为8:00-17:00，同时在此时间段辅助以人工搅拌，即用地板刷每隔4小时对跑道池中的藻液推动一次，控制光强≤800μmolm^-2s^-1，其余时段静置培养，当5.04m²跑道池中的藻液OD达到0.4时不需控制光强。

藻种扩大过程中的质量控制

在藻种扩大培养过程中，要非常注意控制藻液的质量。可以通过外观和显微镜观察鉴定藻种的质量。如外观上藻液的颜色是否正常、贴壁、沉淀等。显微观察是否有较多的原生动物、杂藻等。尤其是刚开始250mL和1L三角瓶培养，由于接种藻量较少，非常容易被其它藻污染，同时对光、温较敏感，因此在初始接种后要注意光强，和温度。同时在每步扩大过程中，尽量多接几瓶，作为备选方案。一旦发现藻种有较大的污染、或藻变黑、变白死亡等现象，应立即放弃藻液并做高温灭菌处理，同时用上一轮的藻液再扩种(备选)。

4)半连续培养

(1)跑道池在接种前的清洗和消毒

在去除残留藻液等残留物后，通入地下水，加入一定量的漂白粉，打开转轮然后搅拌过夜。第二天清洗跑道池，后用地下水冲洗一遍，然后暴晒一天，待用。

(2)接种到200m²跑道池中培养

先在200m²跑道池中通入20000L的地下水，按表1的培养基成分，按比例称取化学试剂加入到跑道池中，加入试剂前把转轮打开以防产生沉淀。再把两个5.04m²跑道池中培养至对数期的藻液用泵抽到200m²的跑道池中，再加地下水到40000L(培养深度为20cm)，搅拌使藻液流速为0.3m/s。

(3)半连续培养

当200m²跑道池培养7天后，收获2/3的藻液(离心，检测初始藻液含油量)，加入等体积的半连续培养培养基，进行下一轮半连续培养，培养2天后，再收获2/3的藻液，加入等体积的半连续培养培养基且向半连续培养培养基中加入0.1g/L的尿素(即每隔一次半连续培养，在加入的半连续培养培养基中添加0.1g/L的尿素)。如此循环，直到收获的藻液油含量与初始藻液含油量相比下降了16％即停止培养，收获整个跑道池的藻液。

所述的半连续培养培养基的配方包括：

其余成分为地下水，地下水pH为9.4。

2014年9月，利用上述方法，在200m²跑道池中半连续培养耐碱单针藻(CCTCCNO:M2013348)，在200m²跑道池培养7天后，第一次收获的藻液的初始含油量为31％，共半连续培养四次，收获5次藻液，油脂产率可达到5.43g/m²d，比分批培养(4.75g/m²d)增加14.3％。

针对耐碱单针藻半连续培养的具体流程如下：

第一次收获2/3藻液→等体积添加半连续培养培养基→第二次收获2/3藻液→等体积半连续培养培养基且向半连续培养培养基中添加0.1g/L的尿素→第三次收获2/3藻液→等体积添加半连续培养培养基→第四次收获2/3藻液→等体积半连续培养培养基且向半连续培养培养基中添加0.1g/L的尿素→收获全部藻液。

(4)半连续培养的质量控制

培养过程每天测定藻液的OD、pH、温度和光强，pH控制在8.7-9.98，藻液温度控制在15-26℃，光强为自然光，以常规方式检测藻的生长状况。搅拌使藻液流速为0.2-0.4m/s，白天搅拌，搅拌时间为8:00-17:00，且在此时间段每天辅助以人工推动跑道池底部的藻，即用地板刷每隔4小时对跑道池中的藻液推动一次，其余时间静置培养。

Claims (7)

1.一种荒漠产油微藻规模化半连续培养的方法，包括以下步骤：

1).小跑道池扩大培养

将生长至对数期的产油微藻接种到配好培养基的小跑道池中；通过搅拌使藻液流速为0.2-0.4m/s，搅拌时间段为8:00-17:00，同时在此时间段用地板刷每隔4小时对跑道池中的藻液推动一次，其余时间静置培养；当小跑道池中的藻液OD小于0.4时，控制光强≤800μmolm^-2s^-1，当小跑道池中的藻液OD达到0.4时不需控制光强；

所述的小跑道池，尺寸为0.5-1.5m×3.5-4.5m×0.2-0.5m；

2).大跑道池半连续培养

将小跑道池中培养至对数期的藻液接种至配好培养基的大跑道池；通过搅拌使藻液流速为0.2-0.4m/s，搅拌时间为8:00-17:00，且在此时间段每天辅助以人工推动跑道池底部的藻，即用地板刷每隔4小时对跑道池中的藻液推动一次，其余时间静置培养；当200m²跑道池培养7-10天后，收获1/3-2/3的藻液，离心，检测初始藻液含油量，大跑道池中加入等体积的半连续培养培养基，进行下一轮半连续培养，培养2天后，再收获1/3-2/3的藻液，加入等体积的半连续培养培养基且向半连续培养培养基中添加0-0.25g/L的尿素；如此循环，直到收获的藻液油含量与初始藻液含油量相比下降了15-20％即停止培养，收获整个跑道池的藻液；

所述的半连续培养培养基配方包括：

其余成分为地下水；

所述的大跑道池，尺寸为3-6m×20-40m×0.2-0.5m；

所述的培养基组分包括：

其余为地下水；

跑道池中藻液pH及温度根据所用微藻的最适pH及生长温度进行常规调节。

2.根据权利要求1所述的方法，所述的跑道池的架设选择在荒漠地区的平坦沙地或盐碱地选址，同时建立温棚，温棚内的温度控制在15℃～40℃。

3.根据权利要求1所述的方法，所述的培养池外壁系统采用水泥，外壁高于地面0.2-0.4m。

4.根据权利要求1所述的方法，所述的小跑道池的培养深度为10-20cm，培养基加上藻液的总体积0.5-2m³，接种浓度OD为0.05-0.2。

5.根据权利要求1所述的方法，所述的大跑道池的培养深度为10-20cm，培养基加上藻液的总体积20-40m³，接种OD为0.05-0.2。

6.根据权利要求1所述的方法，所述的所述的产油微藻为耐碱单针藻，CCTCCNO:M2013348。

7.根据权利要求1所述的方法，所述的步骤1)中所述的生长至对数期的产油微藻培养方法包括：

1级扩大培养：固体平板中微藻转接到液体中培养

250mL三角瓶中盛装200mL培养基，锡箔纸封口后灭菌，由接种环将固体平板中产油微藻接种到250mL三角瓶中，通入空气，初始通气量为0.2-0.4L/min，控制光强≤400μmolm^-2s^-1，直到三角瓶中颜色变绿后，通气量调整为0.4-0.6L/min；光强也可缓慢增加，控制光强≤1400μmolm^-2s^-1，通气时段6:00-20:00，其余时间静置培养；

2级扩大培养

1L三角瓶盛装700mL培养基，5L三角瓶盛装3.5L培养基中，用锡纸封口后灭菌待用，接种1级扩大培养后生长至对数期的藻100mL到1L三角瓶中，培养到对数期，再将1L三角瓶中生长至对数期的藻液300mL到5L三角瓶中；

2级扩大培养过程中，白天通气培养通气时段为6:00-20:00，通气量1-1.8L/min，其余时间静置培养，光强控制与1级扩大培养相同；

3级扩大培养

18L透明桶分装15L培养液，将5L三角瓶中对数期的藻种，接种到18L透明桶内，通气管直接通入到桶底部，通气量是为1-1.8L/min，通气时段6:00-20:00，其余时间静置培养；当18L桶的藻液培养到对数期时，即可接种至小跑道池；

以上所述的1-3级扩大培养均在荒漠地区的平坦沙地或盐碱地的温棚中。