CN102408994A

CN102408994A - 一种富含油脂新月菱形藻及其优化培养基和规模化培养方法

Info

Publication number: CN102408994A
Application number: CN2010102381743A
Authority: CN
Inventors: 张新建; 任艳; 李纪顺; 宋莉璐; 黄玉杰; 赵晓燕; 张广志; 杨合同
Original assignee: BIOTECHNOLOGY CENTER OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES
Current assignee: BIOTECHNOLOGY CENTER OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES
Priority date: 2011-11-29
Filing date: 2011-11-29
Publication date: 2012-04-11

Abstract

本发明属于可再生生物能源领域，涉及一种可用于开发生物柴油的富含油脂新月菱形藻藻种及优化培养基和该藻种的规模化培养方法。所述藻种为新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.3747；所述优化培养基为本发明人优选自养培养基和异养培养基；所述规模化培养方法包括光合自养培养和异养规模化培养。在优化培养条件下，藻细胞生长迅速，比生长速率大，细胞密度高，油脂含量达到65％。

Description

一种富含油脂新月菱形藻及其优化培养基和规模化培养方法

技术领域

本发明属于可再生生物能源领域，主要涉及到一株可用于开发生物柴油的富含油脂新月菱形藻藻种及优化培养基和该藻种的规模化培养方法。

技术背景

生物柴油(脂肪酸甲酯)，是一种可生物降解、无毒的可再生环保燃料能源，受到世界的广泛关注。由于石油资源的枯竭以及环保法规加强，世界各国积极开展对生物柴油的研制和生产。目前，生物柴油主要是以植物和动物脂肪酸为原料来生产的。例如，在美国，主要是以大豆、棕榈、菜籽、动物脂肪酸、玉米油、麻疯树为原来，东南亚国家则以一些热带植物的种子为原料。但是，由上述原料生产的生物柴油尚不能满足当前车用燃料需求量的一小部分，同时，使用植物原料在所有国家中均存在种植过程中产生的土地资源紧缺的问题，特别在我国人多地少的情况下，这个问题尤为突出。因此发现、开发新的生物柴油原料资源迫在眉睫，而且具有巨大的经济效益。

微藻源油脂特点在于不需要利用大量的农业产品为原料，而且可用海水作为天然培养基进行大量繁殖。由微藻产生的油脂性质更接近植物油脂，易于后续的加工，而且比陆生植物单产油脂高出几十倍，因此具有非常大的开发潜力。20世纪80年代，美国的研究人员首次从不同类型微藻中筛选出生长快、适应能力强、含油量高的藻株，在Roswell等地建造室外养殖池进行实验，将从藻类中提取的脂类用于内燃机燃料的生产。目前通过筛选和改良，部分微藻品种的含油量已超过细胞干重的50％，产量能达到50g/(m²d)，每桶生物柴油的成本平均为94$。目前其价格虽不能与传统柴油竞争，但是随着技术的不断改进，成本正逐渐降低，据推测至2010年以微藻为来源的生物柴油将具有市场竞争力。

新月菱形藻(Nitzschia closterium)属于硅藻门、羽纹纲、双菱形目。新月菱形藻是海洋生态系统初级生产力之一，可以作为甲壳类、双壳类和仔鱼的饵料，在海水养殖业中占有重要地位。据报道，新月菱形藻的总脂肪含量为28％-50％，而且富含多种不饱和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是开发开发生物质能源和保健食品的理想材料。做为一种新型能源型生物，新月菱形藻在天然海水中的密度很低，远不能满足社会对其资源开发及利用的需要。实现新月菱形藻的高密度培养将会产生巨大的经济及社会效益。因此新月菱形藻的优良藻种选育、大规模养殖以及胞内、外物质的开发应用成为当今海洋微藻生物技术中急需解决的重要内容。

发明内容

本发明目的是针对现有微藻培养技术的不足，提供一种富含油脂的新月菱形藻及其规模化培养方法。

本发明技术方案包括：

新月菱形藻优异藻种的筛选；

培养基和培养条件的优化；

规模化培养方法。

现分别说明如下：

1.新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6藻种的筛选

1.1藻株的命名和保藏

本发明提供的藻株分类命名为新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6。

该藻株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.3747，保藏日期为2010年4月21日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

1.2本发明所述的新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6藻种的筛选步骤如下：

采集青岛栈桥附件的带泥沙的海水，利用f/2培养基进行培养分离，获得一株细胞呈纺锤形的藻种；再利用紫外线诱变技术对该藻种进行紫外诱变，利用f/2培养基进行培养，筛选生长快速、油脂含量高的藻株，最终获得保藏号为CGMCC No.3747的新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6。

培养筛选新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6的f/2培养基组成如下：

NaNO₃ 74.8mg，NaH₂PO₄ 4.4mg，Na₂SiO₃·9H₂O 8.4-16.7mg，f/2微量元素溶液1ml，f/2维生素溶液1ml，定容到1000ml。121℃灭菌20min备用。

上述f/2培养基中，f/2微量元素溶液：ZnSO₄·4H₂O 23mg，MnCl₂·4H₂O 178mg，CuSO₄·5H₂O 10mg，FeC₆H₅O₇·5H₂O 3.9g，Na₂MoO₄·2H₂O 7.3mg，CoCl₂·6H₂O 12mg，Na₂EDTA 4.35g，定容到1000ml。

上述f/2培养基中，f/2维生素溶液：维生素B120.5mg，维生素B1 100mg，维生素H 0.5mg，定容到1000ml。

1.3新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6的生物特征如下：

该藻细胞呈纺锤形，中央膨大，两端细长。细胞长40-50μm，宽3-5μm，有硅质细胞壁，中央有一细胞核，有2片黄褐色的色素体，位于细胞中央细胞核的两侧。该藻种在显微镜下的培养形态如图1所示。

2.适宜于新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6的培养基和培养条件的筛选优化；

为了进一步提高新月菱形藻的生长速度及油脂含量，本发明人对培养条件和培养基配方进行了筛选研究，优化了最佳培养条件，并筛选了适用于新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6的自养培养基和异养培养基配方，现分述如下：

2.1适宜于新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6的最佳培养发酵条件：

培养温度范围15-26℃，在最佳培养温度20℃时，藻细胞比生长速率最高；

初始pH范围6.5-8.5，在最适pH值7.5时，藻细胞比生长速率最大；

光照强度范围54μmol·m^-2·s^-1～108μmol·m^-2·s^-1，在光照强度为54μmol·m^-2·s^-1时，藻细胞生长最旺盛，细胞生物量达到最大。

2.2适用于新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6的自养培养基组成：

NaNO₃ 74.8mg～120mg，最佳用量为105mg，NaH₂PO₄ 4.5mg，Na₂SiO₃·9H₂O50mg～150mg，最佳用量为100mg，FeC₆H₅O₇·5H₂O 3mg，维生素B₁220μg，维生素B₁₂ 0.22μg，NaCl3.6g，将上述物质溶解在1000ml人工海水中；所述人工海水的组成为：MgCl₂ 4.98g，KBr 0.096g，NaF 0.003g，SrCl₂ 0.024g，H₃BO₃ 0.026g，NaHCO₃ 0.192g，CaCl₂ 1.102g，KCl 0.664g，Na₂SO₄ 3.917g，NaCl 23.476g，溶于1L蒸馏水中；用0.1mol·L^-1的HCl和/或NaOH调节培养基的初始pH值为7.5。

2.3适用于新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6的异养培养基：

在自养培养基中加入0.1％重量份数的葡萄糖，获得异养培养基。

上述优选培养基同最初分离培养用的f/2培养基相比，Na₂SiO₃·9H₂O由原来的8.4-16.7mg·L^-1提高到100mg·L^-1，NaNO₃由74.8mg·L^-1提高到105mg·L^-1，NaCl添加量为27g·L^-1。

2.4不同培养基的培养效果对比

在培养发酵过程中，使用本发明优化培养基和培养条件，新月菱形藻能够更好的生长。

对新月菱形藻的生长密度及油脂含量测定结果表明：在优化自养培养基培养条件下，藻细胞生长迅速，最大比生长速率达到0.117·d^-1；最高细胞密度可达16.9×10⁵·ml^-1，比优化前增长了2.2倍；油脂含量达到55％。在优化异养培养基培养条件下，最高比生长速率达到0.15·d^-1，最大细胞生长密度为16.6×10⁵·ml^-1；油脂含量达到65％。。而在f/2培养基中，新月菱形藻最大比生长速率为0.074·d^-1，细胞生长密度最高达到7.6×10⁵·ml^-1；油脂含量为28～50％。

3.新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6的规模化培养方法

3.1采用自养培养基扩大培养——光合自养培养新月菱形藻

新月菱形藻接种密度为2.5×10⁵细胞·ml^-1，新月菱形藻与自养培养基体积比为1∶10，初始pH控制在7.5，培养温度为20℃，光照强度为54μmol·m^-2·s^-1，通气量为5L·min^-1，培养至对数生长期。

3.2自养培养液中新月菱形藻的细胞浓缩

自养培养液自然沉淀后，高速离心，弃上清液，保留自养细胞沉淀。

3.3采用异养培养基规模化培养

将3.2得到的自养细胞，重新悬浮于异养培养基中，细胞初始密度为10×10⁵个/ml。异养培养开始时，调整氧饱和度达到100％，温度18-22℃，通气速率150-250L/h，异养培养体系的pH控制在6.5-8的范围之内，搅拌速度为120r/min，光照强度为54μmol·m^-2·s^-1。当细胞密度超过100g/L时，终止培养。异养规模化培养时间介于200-300h之间。

3.4藻细胞收集、干燥及存放

采用固-液分离技术从异养培养液中收集藻细胞，包括藻细胞的自然沉淀、过滤、离心和冷冻干燥；藻细胞以固体干粉形式存放。

4.新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6藻细胞中的油脂提取及应用

采用溶剂浸提法提取藻细胞中的油脂，所得油脂用于制备生物柴油等燃料油。

附图说明

图1是新月菱形藻在f/2培养基中的培养形态。

图2是最佳培养条件下新月菱形藻在三种培养基中的生长曲线。

图3是三种培养基培养新月菱形藻藻体中油脂的含量。其中，1：F/2培养基；2：优化培养基自养培养；3：优化培养基异养培养

图4是不同培养温度对新月菱形藻生长的影响。

图5是不同初始pH值对新月菱形藻生长的影响。

图6是不同光照强度对新月菱形藻生长的影响。

图7是不同NaNO₃含量对新月菱形藻生长的影响。

图8是不同NaCl含量对新月菱形藻生长的影响。

图9是5L生物反应器中异养转化后微藻细胞的生长。

具体实施方式

现通过列举实施例方式，对本发明技术方案予以详细说明。

实施例1

新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6藻株的筛选及生物特征

1.1新月菱形藻BC6藻种分离如下：

采集青岛栈桥附件的带泥沙的海水，利用f/2培养基进行培养分离，获得一株细胞呈纺锤形的藻种，该藻种在显微镜下初步鉴定为新月菱形藻；利用紫外线诱变技术对该藻种进行紫外诱变，利用f/2培养基进行培养，筛选生长快速、油脂含量高的藻株，最终获得一株新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)BC6；利用f/2对该藻种进行培养、保存；并在CGMCC保藏，保藏号CGMCC No.3747。

1.2该藻细胞呈纺锤形，中央膨大，两端细长。细胞长40-50μm，宽3-5μm，有硅质细胞壁，中央有一细胞核，有2片黄褐色的色素体，位于细胞中央细胞核的两侧。图1所示为在显微镜下该藻种在f/2培养基中的培养形态。

实施例2

培养液中新月菱形藻BC6细胞数量和比生长速率的测定方法

用比色法测定生物量，建立细胞个数与吸光度关系曲线

2.1吸光值的测定：取新鲜培养液，3500rpm离心15min，弃上清液，以无菌f/2培养基悬浮，再次离心，定容到一定的浓度，用721型分光光度计在OD₆₈₀nm波长下测定新月菱形藻的吸光值，每个实验重复3次，取平均值。

2.2细胞计数：取1ml藻液稀释适当倍数，加入2-5滴0.1％的碘液，杀死游动的藻细胞，于显微镜下用血球计数板计数。

2.3比生长速率的测定

利用下式计算比生长速率：

μ＝(lnN_t-lnN₀)/t式中：μ为比生长速率，t为培养天数(d)，N₀为培养开始时藻体的吸光值，N_t为培养t天后藻体的吸光值。

实施例3

新月菱形藻BC6的培养条件优化，按以下步骤进行：

3.1新月菱形藻BC6接种密度为2.5×10⁵细胞·ml^-1，按新月菱形藻BC6与培养基体积比为1∶5的接种比例接种新月菱形藻BC6到含有f/2培养基的三角瓶中，分别选取15℃、20℃、23℃、26℃、30℃为处理温度，pH值为7.5，光照强度为54μmol·m^-2·s^-1光暗比为12h/12h，每天摇动3次条件下进行不充气培养。每2天取样一次，连续观测10d，测定不同温度对新月菱形藻BC6的生长影响。每组分设2个平行组，以下同。

结果见图4，新月菱形藻BC6在15-26℃均能正常生长。培养温度在20℃时，其生长密度明显高于其他温度，在前5d就表现出较高的生长速度，比生长速率均保持在0.1·d^-1以上，第6d时可获得最高比生长速率0.1127·d^-1，此后仍能以较快速度生长，到第10d时比生长速率还可高达0.07·d^-1。当培养温度达到30℃时，前5d藻细胞能够正常生长，但此后并没有明显的对数生长期，而且比生长速率虽培养时间的延长而逐渐下降。由此可以认为这种新月菱形藻BC6在低温范围有利于生长，在培养温度为20℃时可获得最大的比生长速率和最高的吸光值，而高温(30℃)最终对生长不利。

3.2根据实验3.1选择温度为20℃，初始pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，其他见3.1，测定不同初始pH对新月菱形藻BC6的生长影响。

结果见图5，初始pH在6.5-8.5范围内藻细胞生长旺盛，最适pH值为7.5，比生长速率最大可达0.125·d^-1；而pH值过低或过高都会降低藻细胞的生长速度，藻细胞基本处于抑制状态。虽然初始pH值为5.0-9.0，但是在生长过程中，培养液PH值会逐渐升高，到第5d培养结束pH值上升到5.5-9.5，因此在第5d需再次调节pH值，直到培养结束。

3.3根据实验3.1和3.2选择温度为20℃，pH为7.5，光照强度为54μmol·m^-2·s^-1、108μmol·m^-2·s^-1、162μmol·m^-2·s^-1、216μmol·m^-2·s^-1，其他见3.1，测定不同光照强度对新月菱形藻BC6的生长影响。

结果见图6，在54μmol·m^-2·s^-1-108μmol·m^-2·s^-1光强范围内，新月菱形藻BC6均能保持正常生长。在实验设置光照强度为54μmol·m^-2·s^-1时，藻细胞生长最旺盛，细胞生物量达到最大1.31×10⁶ml^-1，比生长速率达到最0.1·d^-1。当光照强度达到162μmol·m^-2·s^-1-216μmol·m^-2·s^-1时，接种后前4天的生长速度未有显著变化，但在5天后即表现出明显的受抑状态，比生长率随光照强度的增加呈下降趋势，说明新月菱形藻BC6对强光耐受力较弱，因此培养时取54μmol·m^-2·s^-1为宜。

实施例4

新月菱形藻BC6的培养基优化筛选，按以下步骤进行：

4.1在温度为20℃、初始pH为7.5、光照强度为54μmol·m^-2·s^-1、、其他与3.1相同的条件下，在培养基其他成分不变的情况下，以NaNO₃为氮源，改变培养基中的NaNO₃量为0mg·L^-1、45mg·L^-1、74.8mg·L^-1、105mg·L^-1、120mg·L^-1，测定不同浓度的NaNO₃对新月菱形藻BC6的生长影响。

结果见图7，当NaNO₃含量在74.8-105mg·L^-1时，可获得较高藻体浓度，尤其是当含量达到105mg·L^-1时，比生长速率达到最大值0.1217·d^-1。但藻体浓度并不是随着氮浓度的升高而升高，当NaNO₃含量达到120mg·L^-1时，藻体生长开始出现抑制作用，但不十分明显，比生长速率仍可达到0.088·d^-1。当NaNO₃低于74.8mg·L^-1时，藻体生长速度降低，当含氮量为0mg·L^-1时，藻细胞比生长速率下降至0.0587·d^-1，三角瓶中藻体颜色逐渐变白，而且在显微镜下可以观察到：藻体细胞稀少，很多藻体已死亡。由此可见，氮源浓度是影响新月菱形藻生长得关键因素。因此认为，最适合的NaNO₃添加量为105mg·L^-1。

4.2在温度为20℃、初始pH为7.5、光照强度为54μmol·m^-2·s^-1、其他与3.1相同的条件下，在培养基其他成分不变的情况下，改变培养基中的Na₂SiO₃·9H₂O添加量，测定不同浓度的Na₂SiO₃·9H₂O对新月菱形藻BC6的生长影响。

试验测试结果表明，当Na₂SiO₃·9H₂O含量在50mg～150mg·L^-1时，可获得较高藻体浓度，尤其是当含量达到100mg·L^-1时，比生长速率达到最大值，因此认为，最适合的Na₂SiO₃·9H₂O添加量为100mg·L^-1。

4.3.在温度为20℃、初始pH为7.5，光照强度为54μmol·m^-2·s^-1，其他与3.1相同的条件下，在培养基其他成分不变的情况下，变化培养基中的NaCl含量为0g·L^-1、10g·L^-1、23.4g·L^-1、27g·L^-1、30g·L^-1，测定不同浓度的NaCl对新月菱形藻BC6的生长影响。

结果见图8，在23.4g-30g之间均能正常生长，其中在NaCl添加量为27g·L^-1时，藻体细胞生长最旺盛，最大比生长速率达到0.1164·d^-1，当NaCl添加量为0g时，细胞生长缓慢，藻体颜色加深，呈片状，并贴在瓶壁上。

按照上述实验方式，本发明人对培养基其余组分也进行了筛选优化，从而优选出一种适用于新月菱形藻BC6的培养基，即本发明所公开的自养培养基，其组成如下：

NaNO₃ 74.8mg～120mg，NaH₂PO₄ 4.5mg，Na₂SiO₃·9H₂O 50mg～150mg，FeC₆H₅O₇·5H₂O 3mg，维生素B₁ 220μg，维生素B₁₂ 0.22μg，NaCl3.6g，将上述物质溶解在1000ml人工海水中；所述人工海水的组成为：MgCl₂ 4.98g，KBr0.096g，NaF 0.003g，SrCl₂ 0.024g，H₃BO₃ 0.026g，NaHCO₃ 0.192g，CaCl₂1.102g，KCl 0.664g，Na₂SO₄ 3.917g，NaCl 23.476g，溶于1L蒸馏水中；用0.1mol·L^-1的HCl和/或NaOH调节培养基的初始pH值为7.5。

其中，NaNO₃74.8mg～120mg，最佳用量为105mg，Na₂SiO₃·9H₂O 50mg～150mg·L^-1，最佳用量为100mg·L^-1，NaCl最佳用量为27g·L^-1。

本发明所述异养培养基组成为：在自养培养基中加入0.1％重量份数的葡萄糖，即获得异养培养基。

实施例5.新月菱形藻BC6在不同培养基中的生长密度及油脂含量测定对比

5.1新月菱形藻BC6生长速率

在温度20℃、初始pH 7.5，光照强度54μmol·m^-2·s^-1的条件下，利用f/2培养基、自养培养基和异养培养基分别培养新月菱形藻BC6，采用比生长速率测定新月菱形藻BC6分别在三种培养基中的生长状况，同时对三种培养基中的藻体进行油脂含量的测定。

新月菱形藻BC6的生长状况见图2。在自养培养基优化培养条件下，藻细胞生长迅速，第2-5天的比生长速率均保持在0.1·d^-1以上，其最大比生长速率出现在第2天，达到0.117·d^-1；6-10天，细胞密度持续增长，到第10天时仍未到达平台期。最高细胞密度可达16.9×10⁵ml^-1，比优化前增长了2.2倍。在异养培养基优化培养条件下，藻细胞生长比自养更迅速，第2天比生长速率就达到0.126·d^-1，第3天达到最高为0.15·d^-1，在4、5、6、7天分别为0.139·d^-1、0.128·d^-1、0.114·d^-1、0.1·d^-1，虽然比生长速率均保持在0.1·d^-1以上，但细胞密度增长速度趋于缓慢，到第10天时最大细胞密度为16.6×10⁵·ml^-1。f/2培养基中，新月菱形藻在第6d进入对数生长期，第8d后达到平稳期，其最大比生长速率为0.074·d^-1，细胞生长密度最高达到7.6×10⁵ml^-1。

5.2新月菱形藻BC6油脂含量

对藻体进行油脂含量测定。取培养10d的藻液500ml，3500rpm，离心15min，收集藻体，真空冷冻干燥藻体，用研钵充分研磨，取藻粉称重，采用溶剂浸提法，提取溶剂为石油醚、乙醚混合液(体积比为2∶1)，将研磨后的藻粉加入提取溶剂，40℃条件下，浸提5h。期间振荡混匀，待提取结束，加入质量分数10％的氢氧化钾溶液沉淀藻细胞，静置一段时间后，混合液在6000rpm转速下离心10min，收集上清液于恒重离心管中，于60℃水浴迅速蒸去多余溶剂，称重，计算油脂含量。

结果见图3，利用三种培养基培养新月菱形藻，发现藻体中油脂含量不同，其中在异养培养基优化培养条件下培养的新月菱形藻含油量最高，达到65％；其次为自养培养基优化培养的新月菱形藻，油脂含量达到55％；用普通f/2培养基培养时其油脂含量仅为50％。

实施例6.新月菱形藻BC6的规模化培养方法

6.1光合自养培养新月菱形藻BC6

新月菱形藻BC6接种密度为2.5×10⁵细胞·ml^-1，按新月菱形藻BC6与培养基体积比为1∶10的接种比例接种新月菱形藻到装有自养培养基的培养瓶中，初始pH控制在7.5，培养温度为20℃，光照强度为54μmol·m^-2·s^-1，通气量为5L·min^-1，培养至对数生长期。

6.2新月菱形藻BC6的细胞浓缩

由于新月菱形藻比重较大，首先采用自然沉淀的方法将自养培养好的新月菱形藻BC6静置5h，然后采用高速离心技术，4000r/min离心10min，离心后弃上清液，保留自养细胞沉淀。

6.3新月菱形藻BC6的规模化异养培养

将收集得到的自养细胞，重新悬浮于异养培养基中，细胞初始密度为10×10⁵个/ml。异养培养可在不同容积的生物反应器中进行，本实施例是在5L生物反应器中进行。异养培养之前，组装好温度、pH、溶氧电极(校正)和消泡电极，加入异养培养基并高压灭菌。异养培养条件设定如下：发酵开始时，调整罐压、空气流量及转速使初始氧饱和度达到100％，温度18-22℃，通气速率150-250L/h，补加酸碱溶液将发酵体系的pH控制在6.5-8的范围之内，搅拌速度为120r/min，保留光照，光照强度为54μmol·m^-2·s^-1。每天定时取样测定细胞密度。当细胞密度超过100g/L时，终止培养。总异养培养时间介于200-300h之间。

为了防止自养培养和细胞浓缩过程可能引起的杂菌污染，在异养培养液中添加抗生素抑制杂菌生长，主要添加链霉素，使用浓度为0.1g/L。

6.4藻细胞收集与干燥及油脂的提取

从发酵液中收集藻细胞主要采用固-液分离技术分离，包括藻细胞的自然沉淀、过滤、离心和干燥。分离得到的藻细胞主要以冷冻干燥方式干燥，固体形态(干粉)存放。

实施例7采用溶剂浸提法提取藻细胞中的油脂

取新月菱形藻BC6干粉，研磨粉碎后，加入石油醚、乙醚等提取溶剂，40℃条件下，浸提5h。期间振荡混匀，待提取结束，加入质量分数10％的氢氧化钾溶液沉淀藻细胞，静置一段时间后，混合液在6000rpm转速下离心10min，收集上清液于恒重离心管中，在60℃水浴迅速蒸去多余溶剂，所得油脂用于制备生物柴油。

Claims

1.一种富含油脂新月菱形藻，其分类命名为新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)BC6；该藻株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.3747，保藏日期为2010年4月21日。

2.如权利要求1所述新月菱形藻BC6的规模化培养方法，其特征在于包括以下操作步骤：优化培养条件；优化筛选自养培养基和异养培养基；采用自养培养基扩大培养和采用异养培养基规模化培养。

3.如权利要求2所述新月菱形藻BC6的规模化培养方法，其特征在于所说的优化培养条件如下：

光照强度范围54μmol·m^-2·s^-1-108μmol·m^-2·s^-1，在光照强度为54μmol·m^-2·s^-1时，藻细胞生长最旺盛，细胞生物量达到最大。

4.如权利要求2所述新月菱形藻BC6的规模化培养方法，其特征在于所说的优化培养条件如下：

最佳培养温度20℃；

最适pH值7.5；

最佳光照强度为54μmol·m^-2·s^-1。

5.如权利要求2所述新月菱形藻BC6的规模化培养方法，其特征在于所说的优化筛选的自养培养基的组成如下：

NaNO₃ 74.8mg～120mg，NaH₂PO₄ 4.5mg，Na₂SiO₃·9H₂O 50mg～150mg，FeC₆H₅O₇·5H₂O 3mg，维生素B₁ 220μg，维生素B₁₂0.22μg，NaCl 3.6g，将上述物质溶解在1000ml人工海水中；所述人工海水的组成为：MgCl₂ 4.98g，KBr0.096g，NaF 0.003g，SrCl₂ 0.024g，H₃BO₃ 0.026g，NaHCO₃ 0.192g，CaCl₂1.102g，KCl 0.664g，Na₂SO₄ 3.917g，NaCl 23.476g，溶于1L蒸馏水中；用0.1mol·L^-1的HCl和/或NaOH调节培养基的初始pH值为7.5。

6.如权利要求5所述新月菱形藻BC6的规模化培养方法，其特征在于所说的优化筛选的自养培养基的优化组成如下：

NaNO₃ 105mg，NaH₂PO₄ 4.5mg，Na₂SiO₃·9H₂O 100mg，FeC₆H₅O₇·5H₂O 3mg，维生素B₁ 220μg，维生素B₁₂ 0.22μg，NaCl3.6g，将上述物质溶解在1000ml人工海水中；所述人工海水的组成为：MgCl₂ 4.98g，KBr 0.096g，NaF 0.003g，SrCl₂ 0.024g，H₃BO₃ 0.026g，NaHCO₃ 0.192g，CaCl₂ 1.102g，KCl 0.664g，Na₂SO₄ 3.917g，NaCl 23.476g，溶于1L蒸馏水中；用0.1mol·L^-1的HCl和/或NaOH调节培养基的初始pH值为7.5。

7.如权利要求2所述新月菱形藻BC6的规模化培养方法，其特征在于所说的优化筛选的异养培养基的组成为：在自养培养基中加入0.1％重量份数的葡萄糖。

8.如权利要求2所述新月菱形藻BC6的规模化培养方法，其特征在于所说的自养培养过程如下：

新月菱形藻接种密度为2.5×10⁵细胞·ml^-1，新月菱形藻与自养培养基体积比为1∶10，初始pH控制在7.5，培养温度为20℃，光照强度为54μmol·m^-2·s^-1，通气量为5L·min^-1，培养至对数生长期；然后，自养培养液自然沉淀后，离心分离，保留自养藻细胞沉淀。

9.如权利要求2所述新月菱形藻BC6的规模化培养方法，其特征在于所说的异养规模化培养过程如下：

将自养藻细胞重新悬浮于异养培养基中，细胞初始密度为10×10⁵个/ml。异养培养开始时，调整氧饱和度达到100％，温度18-22℃，通气速率150-250L/h，异养培养体系的pH控制在6.5-8的范围之内，搅拌速度为120r/min，光照强度为54μmol·m^-2·s^-1。当细胞密度超过100g/L时，终止发酵。总异养培养时间介于200-300h之间；采用固-液分离技术从异养培养液中收集藻细胞，冷冻干燥；以固体干粉形式存放。

10.如权利要求1所述新月菱形藻BC6的应用，其特征在于采用溶剂浸提法提取藻细胞中的油脂，所得油脂用于制备生物柴油。