CN1710061A - 一种培养新月菱形藻的方法及其专用培养基 - Google Patents

一种培养新月菱形藻的方法及其专用培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种培养新月菱形藻的方法及其专用培养基。本发明所提供的培养基，其配方为：硝酸钠，180－220mg；磷酸二氢钾，18－22mg；硅酸钠，90－110mg；碳酸氢钠，400－500mg；柠檬酸铁，0.45－0.55mg；维生素B12，0.35－0.55μg；维生素B1，350－450μg；乙二胺四乙酸二钠，1.8－2.2mg；脲素，3.5－4.5mg；海水定容至1000ml。应用本发明所提供的培养基培养新月菱形藻，包括如下步骤：1)用海水配置培养基；2)新月菱形藻藻种密度为3×105细胞/毫升，按与培养基体积比为1∶5－9的比例将新月菱形藻接种到培养基中，在19－25℃，光照强度3000－6000Lux，光照时间8－12h/天条件下通气培养。本发明所提供的ZBNC培养基采用开放式的培养方式即可获得新月菱形藻及其目标产物，具有重要的应用价值。

Description

一种培养新月菱形藻的方法及其专用培养基
技术领域
本发明涉及藻类的培养方法及其专用培养基，特别是涉及新月菱形藻的培养方法及其专用培养基。
背景技术
新月菱形藻(Nitzschia closterium)属于硅藻门羽纹藻纲，是海洋生态系统初级生产力的常见种类。新月菱形藻富含多种不饱和脂肪酸，特别是二十碳五烯酸(EPA)，成为很多珍贵水产动物的可口饵料，也是海洋生物制药的原料。
天然状态下新月菱形藻与多种其他微藻混杂生长在一起，种群数量极低，天然海水中的新月菱形藻密度很低，无法满足水产养殖业和海洋生物制药的需要。新月菱形藻的规模养殖、优良藻种的选育已成为海洋微藻生物技术的重大课题之一。新月菱形藻人工培养目前多采用异养培养并结合流加技术，但该方法需要无菌环境，培养条件苛刻；而且所用培养基都适合于绿藻如小球藻、盐藻等的生长，这些单细胞绿藻在培养过程中生长速度快，大量消耗培养基养分，同时还分泌胞外产物抑制新月菱形藻的生长，容易导致培养失败。
发明内容
本发明的目的是提供一种能使新月菱形藻快速生长的培养基。
本发明所提供的新月菱形藻培养基命名为ZBNC，其配方为：硝酸钠，180-220mg；磷酸二氢钾，18-22mg；硅酸钠，90-110mg；碳酸氢钠，400-500mg；柠檬酸铁，0.45-0.55mg；维生素B12，0.35-0.55μg；维生素B1，350-450μg；乙二胺四乙酸二钠，1.8-2.2mg；脲素，3.5-4.5mg，海水定容至1000m1。
培养基配方的优选方案为：硝酸钠，200mg；磷酸二氢钾，20mg；硅酸钠，100mg；碳酸氢钠，450mg；柠檬酸铁，0.5mg；维生素B12，0.4μg；维生素B1，400μg；乙二胺四乙酸二钠，2mg；脲素，4mg，海水定容至1000ml。
为了防止在培养过程中新月菱形藻受到绿藻等杂藻的污染，在培养基中还加有800-1000mg/L碘化钾。
海水在配置培养基前按如下步骤处理：1)用盐酸调节天然海水pH为2-4，静置12-24h；2)用NaOH调节pH到7.0-8.0。
本发明的第二个目的是提供一种应用本发明所提供的ZBNC培养基培养新月菱形藻的方法。
应用本发明所提供的ZBNC培养基培养新月菱形藻，包括如下步骤：1)用海水配置培养基；2)新月菱形藻藻种密度为3×105细胞/毫升，按与培养基体积比为1∶5-9的比例将新月菱形藻接种到培养基中，在19-25℃，光照强度3000-6000Lux，光照时间8-12h/天条件下通气培养。
培养过程的通气量为0.5m3/min；培养6-10天即可达到培养终点。优选培养条件为：温度为25℃；光照强度为5000Lux；光照时间为10h/天。
人工培养新月菱形藻主要涉及两方面的关键技术：即培养基的组成和绿藻污染的防治。本发明所提供的ZBNC培养基能使新月菱形藻细胞快速利用培养基的营养成分，达到细胞快速分裂，可利于新月菱形藻生物量的积累，比传统培养基高出1.2-1.4倍；在ZBNC培养基中加入碘化钾，能有效达到防治绿藻污染的目的，可以采用开放式的培养方式在短期内获得大量新月菱形藻及其目标产物，对水产养殖业和海洋生物制药有着十分重要的意义。
附图说明
图1为新月菱形藻的生长曲线
图2为不同培养基的新月菱形藻胞外多糖含量图
图3为新月菱形藻在ZBNC培养基的生长曲线
图4为新月菱形藻在不同浓度碘化钾ZBNC培养基中的生长曲线
具体实施方式
实施例1、新月菱形藻在ZBNC培养基中生长培养
1、ZBNC培养基的配制
1)取1L天然静置海水，加入1N盐酸调节海水pH为3，静置12h，除去沉淀物；然后加入1N NaOH调节至pH为7.5左右，静置除去沉淀物。
2)定量称取ZBNC配方中各种营养成分：硝酸钠(NaNO3)，200mg；磷酸二氢钾(KH2PO4)，20mg；硅酸钠(Na2SiO3)，100mg；碳酸氢钠(NaHCO3)，450mg；柠檬酸铁(FeC6H5O7·5H2O)，0.5mg；维生素B12，0.4μg；维生素B1，400μg；乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)，2mg；脲素(NH2)2CO，4mg。
3)将上述物质溶解在步骤1)所得海水中，并定容至1升，然后加入1000mg碘化钾。
2、新月菱形藻在ZBNC培养基中的培养
新月菱形藻藻种密度为3×105细胞/毫升，按新月菱形藻与ZBNC培养基体积比为1∶5的比例接种新月菱形藻到培养罐中，在温度为25℃、光照时间为10h/天、光强5000Lux条件下，以0.5m3/min通气量通气培养。
以培养基I和培养基II(培养基I、II为新月菱形藻常规培养基，配方见《海洋饵料生物培养》，湛江水产专科学校主编，农业出版社，1980年出版：100-101)作为对照，采用与上相同的培养条件。
新月菱形藻的生长曲线如图1所示，图中A为培养基I；B为培养基II；C为ZBNC培养基。从图中可以看出，新月菱形藻在ZBNC培养基中生长周期为8-10天，随初始培养的接种密度和比例不同而有差异。通常情况下当藻种密度为3×105cells/ml、接种比例为1∶5时，培养第2天即进入指数生长期，第5天藻细胞密度达最大值；接着是3-5天的稳定期，此时藻细胞分裂、生长变慢，密度变化不大；接着进入衰退期，藻体开始下沉，培养液变澄清并最终在底部形成藻泥，生长结束。而且，与在新月菱形藻常规培养基I、II相比，新月菱形藻在ZBNC培养基中提前4-8天进入对数期，生物量分别高出1.2、1.4倍。
实施例2、用ZBNC培养基培养的新月菱形藻胞外多糖含量分析
按照如下配方配制ZBNC培养基：硝酸钠，180mg；磷酸二氢钾，22mg；硅酸钠，110mg；碳酸氢钠，500mg；柠檬酸铁，0.55mg；维生素B12，0.35μg；维生素B1，450μg；乙二胺四乙酸二钠，1.8mg；脲素，3.5mg，海水定容至1L。碘化钾含量为800mg/L。
以ZBNC为培养基，在温度为25℃、光照时间为8h/天、接种量为1∶9、光强5000Lux条件下通气培养新月菱形藻8天，其他操作与实施例1相同。
按常规方法测定培养基中胞外多糖含量，结果如图2所示，图中1为培养基ZBNC；2为培养基I；3为培养基II。结果表明，与其他培养基相比，新月菱形藻在ZBNC培养基中胞外多糖含量有显著增加。
实施例3、用ZBNC培养基培养的新月菱形藻藻体脂肪酸的组成分析
按照如下配方配制ZBNC培养基：硝酸钠，220mg；磷酸二氢钾，18mg；硅酸钠，90mg；碳酸氢钠，400mg；柠檬酸铁，0.45mg；维生素B12，0.55μg；维生素B1，350μg；乙二胺四乙酸二钠，2.2mg；脲素，4.5mg，海水定容至1L，碘化钾含量为800mg/L。
以上述ZBNC为培养基，在温度为25℃、光照时间为12h/天、接种量为1∶9、光强5000Lux条件下通气培养新月菱形藻10天，其他操作与实施例1相同。
以培养基I、培养基II和培养基III(培养基I、II、III为新月菱形藻常规培养基，配方见《海洋饵料生物培养》，湛江水产专科学校主编，农业出版社，1980年出版：100-101)作为对照。培养结束后，收集藻体细胞，按常规方法测定藻体脂肪酸的组成，结果如表1所示，其中表中14:0表示十四碳酸；i-15:0表示十五碳酸；16:1(n-7)表示十六碳-9～烯酸；其余与此类似。
结果表明，新月菱形藻其藻体脂肪酸的组成以二十碳五烯酸(EPA)为主，以ZBNC为培养基能提高EPA含量，达到总脂肪酸的38.1％；其他脂肪酸组成与另外三种培养基培养结果基本一致。
表1.新月菱形藻在不同培养基中的藻体脂肪酸组成(占总脂肪酸百分比)
  脂肪酸组成   培养基ZBNC   培养基I   培养基II  培养基III
  14:0i-15:015:016:016:1(n-7)i-17:016:2(n-6)16:216:2(n-4)16:4(n-1)18:018:1(n-9)18:1(n-7)18:2(n-6)18:3(n-6)20:4(n-6)20:3(n-3)20:4(n-3)20:5(n-3)   6.30.20.910.413.904.708.14.70.52.10.82.10.70.31.30.438.1   6.50.50.414.518.30.70.44.57.60.71.11.50.92.20.50.41.40.436.2   1.25.80.314.615.63.40.24.77.90.41.21.40.82.30.20.70.81.135.1  7.74.21.68.417.13.80.14.87.60.71.41.30.72.10.40.80.70.934.3
  22:5(n-3)   3.4   1.4   2.5  2.7
实施例4、含碘化钾ZBNC培养基对新月菱形藻培养过程中绿藻污染的防治作用
按实施例1的培养基配方配制ZBNC培养基，一种加入碘化钾使其浓度为1000mg/L，另一种不加碘化钾，按实施例1的培养方式接种培养。新月菱形藻的生长曲线如图3所示，新月菱形藻的生长指标如表2所示。
结果表明，新月菱形藻在不加碘化钾的ZBNC培养基中培养时，接种5天后，培养体系受到绿藻污染，新月菱形藻生长速度缓慢，藻体细胞密度下降；在ZBNC培养基中加入1000mg/L的碘化钾时，可有效预防绿藻类的污染，对已污染的新月菱形藻培养物中单细胞绿藻也能有效遏制，具体表现为单细胞绿藻类种群数量增长停止并逐渐减少，存活的单细胞绿藻多附着在容器液面上方的器壁上。此外，碘化钾的加入还能促进新月菱形藻的生长，迅速形成生长优势，进一步抑制单细胞绿藻等杂藻的生长。800mg/L碘化钾的加入还可大大缩短接种后新月菱形藻细胞分裂的潜伏期，整个生长周期由8-10天缩短为6-8天，生物量增加10％-15％。
表2.新月菱形藻的生长指标
  评价指标   ZBNC+碘化钾1000mg/L   ZBNC
  潜伏期生长周期   1(小时)6-8天   48(小时)8-10天
  生物量   1.7-1.9g/L   1.5-1.7g/L
实施例5、不同浓度碘化钾对ZBNC培养新月菱形藻的影响
按实施例1的培养基配方配制ZBNC培养基，然后分别加入200，400，600，800，1000，1200，1400和1600mg/L的碘化钾，按实施例1的培养方式接种培养。
新月菱形藻在不同碘化钾浓度的生长曲线如图4所示，图中B为200；C为400；D为600；E为800；F为1000；G为1200；H为1400；I为1600mg/L。结果表明，1000mg/L浓度的碘化钾对新月菱形藻生物量积累最为显著。
按常规方法测定藻体脂肪酸的组成，结果如表3所示，表中表示方法与实施例3相同。结果表明，碘化钾加入ZBNC培养基后，新月菱形藻的多不饱和脂肪酸含量没有显著的变化；碘化钾浓度为1000mg/L时，EPA含量略有增加。
表3  碘化钾对ZBNC培养新月菱形藻多不饱和脂肪酸含量的影响
  脂肪酸组成   ZBNC   ZBNC+800mg/L   ZBNC+1000mg/L
  14:0i-15:015:016:016:1(n-7)i-17:016:2(n-6)16:216:2(n-4)   6.30.20.910.413.904.708.1   5.51.51.413.516.32.71.43.56.6   2.23.81.312.612.72.41.25.27.4
  16:4(n-1)18:018:1(n-9)18:1(n-7)18:2(n-6)18:3(n-6)20:4(n-6)20:3(n-3)20:5(n-3)22:5(n-3)   4.70.52.10.82.10.70.31.30.438.1   1.70.91.71.91.20.70.21.50.338.9   0.61.11.31.32.10.40.51.10.240.1
  22:5(n-3)   3.4   1.4   2.5

Claims (10)

1、一种新月菱形藻培养基，其配方为：硝酸钠，180-220mg；磷酸二氢钾，18-22mg；硅酸钠，90-110mg；碳酸氢钠，400-500mg；柠檬酸铁，0.45-0.55mg；维生素B12，0.35-0.55μg；维生素B1，350-450μg；乙二胺四乙酸二钠，1.8-2.2mg；脲素，3.5-4.5mg；海水定容至1000ml。
2、根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述硝酸钠为200mg；所述磷酸二氢钾为20mg；所述硅酸钠为100mg；所述碳酸氢钠为450mg；所述柠檬酸铁为0.5mg；所述维生素B12为0.4μg；所述维生素B1为400μg；所述乙二胺四乙酸二钠为2mg；所述脲素为4mg。
3、根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述培养基中还含有800-1000mg/L碘化钾。
4、根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述海水按如下步骤处理：
1)用盐酸调节天然海水pH为2-4，静置12-24h；2)用NaOH调节pH到7.0-8.0。
5、一种新月菱形藻的培养方法，包括如下步骤：1)用海水配置培养基，配方为：硝酸钠，180-220mg；磷酸二氢钾，18-22mg；硅酸钠，90-110mg；碳酸氢钠，400-500mg；柠檬酸铁，0.45-0.55mg；维生素B12，0.35-0.55μg；维生素B1，350-450μg；乙二胺四乙酸二钠，1.8-2.2mg；脲素，3.5-4.5mg；海水定容至1000ml；
2)新月菱形藻藻种密度为3×105细胞/毫升，按与培养基体积比为1∶5-9的比例将新月菱形藻接种到培养基中，在19-25℃，光照强度3000-6000Lux，光照时间8-12h/天条件下通气培养。
6、根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于：步骤1)中所述硝酸钠为200mg；所述磷酸二氢钾为20mg；所述硅酸钠为100mg；所述碳酸氢钠为450mg；所述柠檬酸铁为0.5mg；所述维生素B12为0.4μg；所述维生素B1为400μg；所述乙二胺四乙酸二钠为2mg；所述脲素为4mg。
7、根据权利要求5或6所述的培养方法，其特征在于：步骤1)所述培养基中还含有800-1000mg/L碘化钾。
8、根据权利要求5或6所述的培养方法，其特征在于：所述海水在配置培养基前按如下步骤处理：1)用盐酸调节天然海水pH为2-4，静置12-24h；2)用NaOH调节pH到7.0-8.0。
9、根据权利要求5或6所述的培养方法，其特征在于：步骤2)所述通气培养的通气量为0.5m3/min。
10、根据权利要求5或6所述的培养方法，其特征在于：步骤2)所述培养温度为25℃；光照强度为5000Lux；光照时间为10h/天。
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