CN104263649A - 一种大规模微藻培养的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大规模微藻培养的方法，属于微藻培养生产技术领域。该方法首先在实验室内进行微藻保种扩种培养，然后在室外光生物反应器内大规模培养微藻种质藻液；进而利用光生物反应器培养的微藻种质藻液接种至室外跑道式培养池，在跑道式培养池内进行大规模的微藻培养；最后从跑道式培养池收获微藻生物质，生产基于微藻生物质的产品。本发明将室外光生物反应器和跑道式培养池结合，该方法能够大规模培养微藻，相比单纯的跑道式反应池和单纯的光生反应器培养微藻，本发明显著降低了生产成本，并开发了一整套完整的工艺路线。

Description

一种大规模微藻培养的方法
技术领域
本发明属于微藻培养生产技术领域，具体涉及一种可用于生产生物能源、生物材料、食品、饲料、保健品和药品的大规模微藻培养的方法。
背景技术
微藻作为宝贵的生物资源，至今还没有得到充分利用的一个重要原因就是没有经济的生产系统。目前，用于微藻培养的方法有跑道式培养法、光生物反应器培养法等，然而，跑道式培养法所需的跑道式培养池仅能培养少数几个在选择性培养基中生长的藻种，例如螺旋藻和盐藻等微藻品种；而光生物反应器培养法中用到的封闭的光生物反应器系统能培养大多微藻品种，但是建造成本和运行成本很高。这种情况很大程度上限制了微藻产业的发展。
跑道式养殖池最初设计于上世纪六十年代,目前技术比较成熟，被广泛地用于螺旋藻、小球藻、杜氏盐藻和雨生红球藻的养殖，然而，由于跑道式培养池是一个开放的培养设施,其中培养的微藻很容易受到外来物种的污染；同时，培养池的温度等培养条件很难控制，不能为微藻提供理想的培养条件。光生物反应器可以提供封闭的培养环境和可以调控的培养条件，理论上可以比较好地培养绝大多数的微藻品种,是多年来业界研发的重点，但是目前光生物反应器还存在建造和使用成本高的问题，仅适用于高附加值微藻产品的生产，在微藻产业中的应用有一定的局限性。
跑道式培养池之所以能够在微藻产业中得到广泛的应用原因在于所培养的微藻品种自身能够克服污染问题。螺旋藻能够在高度碱性的培养基中生长，而其它生物物种无法适应碱性环境。小球藻生长速度快，能够对其它物种形成竞争性抑制。杜氏盐藻能在高盐含量的培养基中生长，其它物种无法在这种培养基中生存。雨生红球藻只是在积累虾青素阶段在培养池内培养，因为时间比较短，仅有几天时间，污染问题可以忽略。然而对于大多数种类的微藻来说，跑道式培养池无法连续进行纯种培养。培养过程中，藻液会受到外来原生物和其它藻类的污染，既无法保证产量和质量，也无法持续维持原来的微藻品种。
光生物反应器的设计和建造是微藻生物技术领域的难点之一。虽然经过多年研究发展，各种类型的反应器被设计和建造，甚至被用于商业化生产微藻产品，但是一直没有大规模的成熟稳定的造价低廉的光生物反应器设施出售。没有合适的光生物反应器系统已经成了微藻产业发展的瓶颈。光生物反应器可以提供封闭的培养环境和可以调控的培养条件，理论上可以比较好地培养绝大多数的微藻品种,是多年来业界研发的重点，但是目前光生物反应器还存在建造和使用成本高的问题，仅适用于高附加值微藻产品的生产，在微藻产业中的应用有一定的局限性，对于大规模微藻培养的方法还没有形成一整套成熟的工艺路线。
发明内容
为此，本发明提出了一种大规模微藻培养的方法，该方法采用光生物反应器和跑道式培养池联合进行微藻培养的技术，能有效降低微藻大规模的培养成本，并形成了一整套完整的大规模培养微藻的工艺路线。
其技术解决方案包括：
一种大规模微藻培养的方法，包括以下步骤：
a微藻的实验室保种扩种培养，首先选取适宜微藻生长需要的液体培养基，向其中加入凝胶，制作成固体培养基；其次，选取经过纯化无菌的微藻藻种，将其接种到所述固体培养基中，封口培养；最后依次进行微藻藻种的初始扩大培养、中继培养，在中继培养之后对微藻藻种进行质量控制，筛选出优质微藻藻种；
b将步骤a所得优质微藻藻种放入室外光生物反应器内进行大规模培养，得微藻种植液；
c将步骤b所得微藻种植液接种到室外跑道式培养池，在跑道式培养池内进行大规模微藻培养，直至藻液变为深红色时，收集整池藻液；
d接c，对整池藻液进行下游处理，进行分离，采收藻细胞并提取虾青素。
作为本发明的一个优选方案，所述步骤c中，微藻种植液在跑道式培养池内为批培养方式或半连续培养方式。
作为本发明的另一个优选方案，步骤a中，优质微藻藻种的筛选通过外观和显微镜观察鉴定。
步骤b中，将优质微藻藻种放入室外气升管道式光生物反应器内进行大规模培养，控制温度为12-28℃，pH 7.0-8.0，通气量在100L/min，培养5-7天。
步骤c中，跑道式培养池内的pH为8.0，培养时间为7-10天。
步骤d中将整池藻液进行离心分离，弃上清液，收集红色的红球藻沉淀；然后将所述红球藻沉淀稀释后，依次进行高压均质、喷雾干燥法后得到干藻粉；最后，将所得干藻粉与等体积的食用油混合，提取虾青素。
本发明提出了一种大规模微藻培养的方法，其首先在实验室内进行微藻保种扩种培养，然后在室外光生物反应器内大规模培养微藻种质藻液；进而利用光生物反应器培养的微藻种质藻液接种至室外跑道式培养池，在跑道式培养池内进行大规模的微藻培养；最后从跑道式培养池收获微藻生物质，生产基于微藻生物质的产品。
本发明将室外光生物反应器与跑道式培养池结合进行微藻的大规模培养，其具有以下优点：(1)有效屏蔽外来生物和防止污染，能够实现单种和纯种微藻培养；(2)能够有效控制和调整温度、光线、搅拌、pH值、溶氧和培养基等培养条件；(3)微藻培养能够获得更高的培养密度，减小微藻采收难度；(4)培养环境清洁卫生，尤其适用于高附加值药用和食用微藻代谢产物的生产；(5)有较高的比表面积，光能利用效率高，节约培养占地面积；(6)CO2利用率高，可以实现CO2减排；(6)建设成本低，维护运行成本低，远远低于单纯是光生物反应器的维护成本，仅是光生物反应器的十分之一、技术成熟稳定，工程上易于放大。
将室外光生物反应器和跑道式培养池结合，该方法能够大规模培养微藻，相比单纯的跑道式反应池和单纯的光生反应器培养微藻，本发明显著降低了生产成本，并开发了一整套完整的工艺路线。
具体实施方式
本发明所选原料均可通过商业渠道得到。
本发明，一种大规模微藻培养的方法，具体包括以下步骤：
第一步、微藻的实验室扩大培养
1、配制微藻保种固体培养基
根据微藻的生长需要，选用适宜的液体培养基，加入琼脂糖凝胶，高温灭菌后在无菌工作台上利用无菌培养皿制作无菌固体培养基，待培养基温度下降至常温凝固后用封口膜密封后在温度为4℃保存。
2、微藻藻种的保存
将经过纯化无菌的微藻藻种在无菌操作台内接种到上述步骤1制作的固体培养基上保种培养，培养可以在装有照明光源的培养箱内，需要保种培养的时候，将载有微藻藻种的培养皿移到无菌操作台，用无菌签转移微藻到空白的固体培养基培养皿，然后用封口膜封口后再放到培养箱培养，保种培养的时间间隔可以根据微藻生长速度来确定。
3、藻种的初始扩大培养
配置液体培养基，分别分装到大、中、小三类三角培养瓶内，分装的液体体积大约为10-20mL、100-300mL和500-1000mL，用铝箔和棉塞将三角瓶封口后高温灭菌待用；初始扩种第一步在无菌操作台内用无菌棉签将微藻从固体培养基转移少许到小三角培养瓶，在有光源的摇床培养箱内培养；经过几天到几个星期的培养，培养液颜色变深后，再经无菌操作转移到中培养瓶和大培养瓶进行培养。
4、藻种的中继培养
配置液体培养基到容量为10L或20L的透明桶内，高温灭菌待用，将大培养瓶内的藻液经无菌操作转移到灭菌后的培养桶内培养，向桶内通入无菌的混有二氧化碳的空气，提供适量的光照，控制培养室内的温度，对于易于沉降的藻类，辅助以摇床设施防止藻类沉降。
5、藻种扩大过程的质量控制
在藻种液体扩大培养过程中，要十分注意控制微藻种液的质量。可以通过外观和显微镜观察鉴定藻种的质量，外观观察是看藻液的颜色是否正常、是否存在沉淀和附壁的现象；对大多说经济微藻来说，沉淀和附壁是不正常的，说明藻种生长不良，应该放弃藻种并高温灭活，显微观察是观察微藻的微观形态是否正常，是否有外来的藻类或者微生物污染，一旦发现藻种污染，应该立即放弃藻液并做高温灭活处理。
第二步、微藻的光生物反应器培养
1、光生物反应器的准备
光生物反应器在接种之前，进行清洗消毒；反应器的液体接触部分可以用化学试剂漂白液或高锰酸钾溶液等进行消毒，反应器的气体管路用臭氧或二氧化氮等气体消毒剂消毒，消毒后，通入无菌水清洗；最后接通反应器的监测和控制设备，通入过滤除菌的空气，加入过滤除菌的培养剂，校验反应器的监测控制设备。
2、小规模光生物反应器的接种
将数桶经过质量检查的藻种无菌导入准备好的光生物反应器内，观察和记录反应器的监测结果和控制设备的有效性，设置方应器的控制参数。
3、光生物反应器的微藻扩大培养
接种后的小规模反应器经过几天的培养后，达到适宜的培养浓度，就可以转移藻液到大规模反应器培养，藻液转移前，要先准备好大规模的反应器，转移过程采用无菌操作，保证藻液不受到外来的生物污染，转移后的小规模反应器清洗备用。
4、光生物反应器的微藻半连续培养
大规模的反应器经过几天的培养后，达到了微藻生产能力的最高水平，这时候，微藻在光生物反应器中的培养可以采用半连续的方式。
第三步、微藻的跑道式培养池培养
1、跑道式培养池准备
将跑道式培养池在接种前进行彻底的清洗和消毒，
首先将培养池用水管冲洗，去除残留藻液等残留物，然后通入自来水至满池，启动培养池的转轮，加入一定量的消毒剂如漂白液或高锰酸钾等消毒；消毒后，用过滤除菌的自来水再次冲洗培养池；最后再次通入过滤除菌的自来水，开动培养池转轮，加入培养基的无机盐成分，启动培养池的监测和控制设备。这里需要控制的参数时培养基的深度、培养池转轮的转速pH等。
2、跑道式培养池接种
将在大规模反应器半连续培养的藻液转移到培养池，转移过程中控制微藻液的培养条件，保证转移过程中微藻的健康，跑道式培养池接种需要控制的参数之一是培养池的接种浓度，微藻池接种浓度对微藻培养的生产效率有很大的影响。
3、跑道式培养池微藻培养
微藻在培养池的培养维持一定的培养条件，可控制的参数包括转轮的转速和pH等，转轮的转速影响溶氧的去除和培养液的有效搅拌，微藻在培养池内的培养可以是批式培养或者半连续培养。
第四步、微藻的采收和产品加工
1、微藻的采收和浓缩
微藻采收和浓缩可以采用多种形式，如自然沉降，离心沉降，絮凝和过滤等，自然沉降可以在培养池内进行，也可以转移到专门的沉降池进行，初级沉降后，利用离心机等设备对藻浆液继续进行浓缩。
2、微藻的下游处理
浓缩后的微藻可以干燥成藻粉产品或继续提取有价值的生物产品或不经过干燥程序，先行从湿藻生物质中提取生物制品。
下面结合具体实施例做进一步说明：
实施例1：
本发明，一种大规模微藻培养的方法，其具体包括以下步骤：
步骤1、雨生红球藻的实验室扩大培养
首先本发明优选选用适宜微藻生长的BBM培养基配方配置微藻液体培养基，在液体培养中加入1％的琼脂糖凝胶制作固体培养基；
其次，在培养箱内保种培养微藻，培养温度20℃，光照强度大约30uE/m2/s；
然后，从固体培养基转移微藻到装有20mL培养基的200ml培养瓶中，在摇船培养箱内培养约14-21天，培养温度20℃，光照强度大约30uE/m2/s，摇床约40rpm；
最后，挑选藻液颜色变绿的培养瓶，外观观察藻液没有沉淀和附壁现象，转入装有200mL培养基的1L培养瓶培养，显微观察藻液是否健康，是否污染，如果藻液污染，则放弃该瓶的藻种扩大培养，1L培养瓶以同于200mL培养瓶的培养条件进行培养。7-14天后，将变绿的藻种扩大到含有1L培养基的5L的培养瓶内培养，培养条件是：培养温度20℃，光照强度大约80uE/m2/s，摇床约30rpm，藻种在5L的培养瓶内培养大约7天后，转入容量为20L的透明桶内培养，其培养条件是：培养温度25℃，光照强度大约100uE/m2/s，通气率0.2v/v/min，通入的气体含3％CO2，培养大约7天后，抽样检查藻液质量和浓度，健康藻液浓度达到0.3g/L的藻液可以作为藻种接种光生物反应器培养。
步骤2、雨生红球藻的光生物反应器培养
根据中试需要，本发明中建造了1000L和8000L的两种室外气升管道式，首先对1000L的光生物反应器按照上述方法进行清洗消毒，液体消毒剂利用50ppm有效氯的漂白液，气体消毒剂用10mg/L的臭氧气体，消毒清洗后加入上述BBM无菌培养基900L；开通反应器控制单元，设置温度控制在25℃，pH 7.4，通气量25L/min；无菌转移5桶20L的健康藻液进入光生物反应，保持培养条件不变，在室外培养5-7天，微藻浓度达到0.5g/L以上。
利用相同方法和试剂清洗和消毒8000L光生物反应器，然后加入7000L无菌培养基。设置控制条件：温度控制在25℃，pH控制在7.4，通气量在100L/min，保持培养条件5-7天，微藻浓度达到0.5g/L以上，保持培养条件不变，每天释放出3000L藻液，然后再注入3000L的无菌培养基。
步骤3、雨生红球藻的跑道池培养
根据中试需要，我们设计和建造了100m2跑道式培养池，按照上文所述方法先对培养池进行清洗和消毒，加入自来水40吨，启动转轮10rpm，加入10％有效氯的漂白液10L，4-5小时后，放掉消毒液，用自来水冲洗培养池，加入27吨无菌自来水，加入雨生红球藻变红培养的培养基成分，启动转轮10rpm，设置pH控制在8.0；倒入3000L来自光生物反应器的藻液，开始雨生红球藻的变红培养，经过7-10天的培养，藻液转成深红色后收获整池藻液，藻液收获后，清洗藻池并开始冲洗消毒工作。
步骤4、对雨生红球藻进行下游处理
为了收获微藻生物质，可将红球藻在藻池内自然沉降一晚上，第二天清晨去除藻池上清液后用污泥泵抽取下层的微藻沉淀液约3-5吨，将沉淀液转移到5吨的化工桶内让微藻继续沉降8小时，去除桶内上清液，用三足式离心机离心沉降下层微藻沉淀，获得藻泥约80-100公斤，将藻泥利用喷雾干燥机干燥获得藻粉9-11公斤。
采用本发明的培养方法，在中试水平进行培养雨生红球藻生产虾青素的试验，取得了良好的效果。经过综合，认为新工艺的虾青素的生产成本可以比单纯利用反应器生产的成本降低在90％倍以上，可以比利用传统跑道池培养或者跑道池和其它类型的光生物反应器培养成本降低60％以上。

Claims (6)

1.一种大规模微藻培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a微藻的实验室保种扩种培养，首先选取适宜微藻生长需要的液体培养基，向其中加入凝胶，制作成固体培养基；其次，选取经过纯化无菌的微藻藻种，将其接种到所述固体培养基中，封口培养；最后依次进行微藻藻种的初始扩大培养、中继培养，在中继培养之后对微藻藻种进行质量控制，筛选出优质微藻藻种；
b将步骤a所得优质微藻藻种放入室外光生物反应器内进行大规模培养，得微藻种植液；
c将步骤b所得微藻种植液接种到室外跑道式培养池，在跑道式培养池内进行大规模微藻培养，直至藻液变为深红色时，收集整池藻液；
d接c，对整池藻液进行下游处理，进行分离，采收藻细胞并提取虾青素。
2.根据权利要求1所述的大规模微藻培养的方法，其特征在于：所述步骤c中，微藻种植液在跑道式培养池内为批培养方式或半连续培养方式。
3.根据权利要求1所述的大规模微藻培养的方法，其特征在于：步骤a中，优质微藻藻种的筛选通过外观和显微镜观察鉴定。
4.根据权利要求1所述的大规模微藻培养的方法，其特征在于：步骤b中，将优质微藻藻种放入室外气升管道式光生物反应器内进行大规模培养，控制温度为12-28℃，pH 7.0-8.0，通气量在100L/min，培养5-7天。
5.根据权利要求1所述的大规模微藻培养的方法，其特征在于：步骤c中，跑道式培养池内的pH为8.0，培养时间为7-10天。
6.根据权利要求1所述的大规模微藻培养的方法，其特征在于：步骤d中将整池藻液进行离心分离，弃上清液，收集红色的红球藻沉淀；然后将所述红球藻沉淀稀释后，依次进行高压均质、喷雾干燥法后得到干藻粉；最后，将所得干藻粉与等体积的食用油混合，提取虾青素。
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