CN105624043B - 一种开放式培养池规模培养产油微藻的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种开放式培养池规模培养产油微藻的方法。以产油微藻油球藻Graesiella sp.WBG‑1为藻种，经过逐级扩大培养，接种到200m²开放式培养池，在自然光温条件下进行规模培养，利用pH在线控制系统控制外源CO₂通入藻液，将藻液pH维持在9.0~10.0的范围内，培养结束后，使藻液静置，藻细胞自然沉降到池底，排出上清液，得到浓缩了50倍以上的浓藻浆，再经过离心脱水，藻泥的生物质干重达到25%以上；总脂含量平均达到生物质干重的31.55%，总脂产率平均2.32 g m^‑2 d^‑1，中性脂占总脂的88.89%，对外源CO₂的利用率平均达到65.77%。

Description

一种开放式培养池规模培养产油微藻的方法

技术领域

本发明属于微藻生物质能源领域，更具体涉及一种开放式培养池规模培养产油微藻Graesiella sp.WBG-1的培养方法。

背景技术

微藻生物柴油被认为是有望解决未来交通运输燃油问题的可再生能源之一(Chisti 2008,Trends in Biotechnology 26(3):126-131；Wijffels and Barbosa 2010,Science 329(5993):796-799)。微藻培养是获取生物柴油原料的基本环节，产油微藻规模培养技术的研发在微藻生物柴油产业化进程中具有极其重要的作用(Sheehan,Dunnahayet al.1998,A look back at the US Department of Energy's Aquatic SpeciesProgram:Biodiesel from Algae；Avagyan 2008,Clean Technologies andEnvironmental Policy 10(4):313-317；Eriksen 2008,Biotechnology Letters 30(9):1525-1536)。一般来说，微藻培养具有开放式及封闭式两类(Stephens,Ross et al.2010,Trends in Plant Science)，其中的开放式培养池培养技术被认为是利用太阳光能资源大规模培养微藻生产生物柴油原料的主要方法之一(Sheehan,Dunnahay et al.1998,A lookback at the US Department of Energy's Aquatic Species Program:Biodiesel fromAlgae)，不但因为开放式培养池培养技术已在螺旋藻等藻类的规模生产上取得了成功，还因为开放式培养池具有比封闭反应器更为低廉的造价、较低的运行费用和简单的操作方法。

然而，相比于螺旋藻、盐藻的开放式培养，利用开放系统培养产油微藻还面临一些技术难题：

(1)缺乏生长快、生物质产量高、油脂含量高、适合开放池规模培养的产油微藻藻种。

尽管国内外文献资料中已报道的产油微藻很多(Gouveia and Oliveira 2009,Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 36(2):269-274；Griffithsand Harrison 2009,Journal of Applied Phycology 21(5):493-507；Liu,Chen etal.2011,Progress in Natural Science:Materials International 21(4):269-276)，但真正适合于开放池规模培养的产油藻种却是寥寥无几(Sheehan,Dunnahay et al.1998,Alook back at the US Department of Energy's Aquatic Species Program:Biodieselfrom Algae；Benvenuti,Bosma et al.2015,Biotechnology for Biofuels 8:100)。适合于开放池大规模培养的产油微藻不但需要生长快、油脂含量高，更需要微藻对光、温、pH等环境条件的变化具有很强的适应能力(Gouveia and Oliveira 2009,Journal ofIndustrial Microbiology and Biotechnology 36(2):269-274；Griffiths andHarrison 2009,Journal of Applied Phycology 21(5):493-507)。

(2)开放池培养产油微藻易发生生物污染。

生物污染是微藻开放池培养的最大障碍之一。常见的污染生物大致有四类：浮游动物、杂藻、溶藻细菌和病毒(Wang,Zhang et al.2013,Bioresource Technology 128:745-750)。浮游动物(轮虫、纤毛虫等)污染主要是吞噬(摄食)藻细胞，细菌污染主要通过分泌物抑制或分解藻细胞，而杂藻和病毒侵染机制较为复杂，主要包括营养竞争、化感作用、分泌物抑制以及病毒致死等(Rego,Redondo et al.2015,Bioelectrochemistry 103:60-64)。对产油微藻危害最大的是浮游动物(轮虫、纤毛虫等)的摄食，导致藻细胞密度和生物质产量大幅降低，甚至引起培养的崩溃(McBride,Lopez et al.2014,IndustrialBiotechnology 10(3):221-227)。截至目前，还没有行之有效的方法可以完全控制生物污染(Wang,Zhang et al.2013,Bioresource Technology 128:745-750；Zhou,Li etal.2015,Applied Microbiology And Biotechnology 99(3):1531-1541)。

(3)大规模培养产油微藻油脂含量低。

很多产油微藻在实验室条件下油脂含量高达生物质干重的50％以上，甚至更高，但将其培养规模扩大之后油脂含量大幅下降。Li et al(2013,Biotechnology andBioengineering 110(1):97-107)报道一株凯氏拟小球藻在实验室条件下油脂含量约为干重的55.3％，但在室外250L反应器中培养时，油脂含量仅约为干重的25％；即使是布朗葡萄藻(一株公认的产油微藻，总脂含量可达干重的60％以上)，在室外2000L培养池中培养时油脂含量也仅为干重的19％(Ashokkumar and Rengasamy 2012,Bioresource Technology104(2012):394-399)。由此看来，产油微藻大规模培养过程中的油脂积累特性及其生理调控技术还需要更多更深入的研究。

(4)微藻采收难度大，能耗高。

目前的微藻采收方法包括过滤、离心、气浮等(Brennan and Owende 2010,Renewable and Sustainable Energy Reviews 14(12):557-577)。根据目前的报道，产油微藻多为单细胞藻类，过滤法并不适合产油微藻的采收，而离心、气浮采收方法虽然可以用于产油微藻的采收，但其能耗成本在微藻生物柴油生产总成本中的比例过高(Schenk,Thomas-Hall et al.2008,Bioenergy Research 1(1):20-43；Brennan and Owende 2010,Renewable and Sustainable Energy Reviews 14(12):557-577)，显著降低了微藻生物柴油能量的产出/投入比例，甚至不能实现能量的净产出，严重阻碍了微藻生物柴油的产业化。

鉴于上述困难，产油微藻室外大规模培养且获得高油脂含量的成功案例未见报道，也未形成一套成熟的大规模产油微藻培养工艺路线。目前公开的报道中，在室外培养产油微藻，培养体积约在1000L～2000L的水平，最终达到的油脂含量也仅为干重的20％(Rodolfí,Chini Zittelli et al.2009,Biotechnology and Bioengineering 102(1):100-112；Ashokkumar and Rengasamy 2012,Bioresource Technology 104(2012):394-399；Li,Pribyl et al.2013,Biotechnology and Bioengineering 110(1):97-107)，与培养初始的油脂含量相差无几，即大量培养过程中并没有显著的油脂的积累过程。因此，发展微藻生物柴油，亟待建立适合于产油微藻规模培养的技术方法。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种开放式培养池规模培养产油微藻Graesiellasp.WBG-1的培养方法，方法易行，培养方便，通过增加藻液静置沉降过程，使离心处理的水量减少到原来的1/50以下，显著降低了采收环节的能耗；控制了藻液中生物质的密度，使单位生物质获得更多的光能，实现了开放池大规模培养条件下油球藻Graesiella sp.WBG-1细胞油脂的大量积累，总脂含量达到干重的30％以上。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

其技术构思是：针对上述产油微藻开放式规模培养面临的技术难题，申请人首先通过大量的藻种资源采集、分离、室内外培养，筛选到一株生长快、油脂含量高、藻细胞个体大、环境适应性强的产油微藻Graesiella sp.WBG-1，为大规模培养提供优质藻种。针对产油微藻规模培养过程中易发生生物污染的问题，申请人首先利用液体过滤器(HFL-0820，10μm滤芯)对培养用水进行过滤(前处理)，去除或减少培养用水中的生物污染源，尽量避免生物污染源通过培养用水进入培养系统；其次，利用油球藻Graesiella sp.WBG-1细胞大(8～12μm)、对原生动物摄食具有抵抗能力的特性，一定程度上减小了开放池培养中藻细胞被原生动物吞食的风险；并且利用油球藻Graesiella sp.WBG-1耐受高pH环境的特性，在培养过程中维持藻液高pH(9.0～10.0)，从而一定程度上减少了生物污染，尤其是原生动物污染的发生。培养液高pH有助于抑制原生动物的生长，这一点在微藻大规模培养中已经多次证实(Becher 1994；Liu and Lu 1990；Wang,Zhang et al.2013)。通过综合应用以上技术措施，申请人解决了微藻开放池培养过程中原生动物污染的技术难题。

申请人通过精细地调节和优化氮源浓度，控制藻液中生物质的密度，使单位生物质获得更多的光能，实现了开放池大规模培养条件下油球藻Graesiella sp.WBG-1细胞油脂的大量积累，总脂含量达到干重的30％以上。

申请人利用油球藻Graesiella sp.WBG-1细胞较大的特点，发明了自然沉降+离心脱水的采收工艺，通过增加藻液静置沉降过程，使离心处理的水量减少到原来的1/50以下，显著降低了采收环节的能耗。

通过上述4个方面的技术措施，申请人解决了产油微藻开放池大规模培养所面临的主要技术难题，建立了一套完整的、适合于产油微藻开放池大规模培养的工艺路线，并将该工艺用于培养油球藻Graesiella sp.WBG-1生产生物柴油原料。利用该培养方法，在室外200m²培养池培养油球藻Graesiella sp.WBG-1，油脂含量达到干重30％以上，生产的微藻油脂适合于生物柴油的炼制。

一种开放式培养池规模培养产油微藻的方法，其步骤是：

1、藻种的扩大培养：

所使用的藻种是油球藻Graesiella sp.WBG-1，该藻种已于2015年8月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山)，保藏编号为CCTCC NO：M2015486。油球藻Graesiella sp.WBG-1具有以下特征：细胞为球形至椭球形，直径8～12μm，细胞中可见一蛋白核，色素体杯状，周生，细胞表面无鞭毛、突起等结结构。培养藻种从实验室2000mL三角瓶开始，依次经过2000mL三角瓶、室外50L培养箱、室外5m²培养池、室外20m²培养池逐级扩大培养，得到足量的油球藻Graesiella sp.WBG-1藻种液。在室外光温条件下逐级扩大培养的过程中，藻细胞逐步适应了自然光照与温度的变化，实验期间光照强度变化范围0～2600μmol m^-2s^-1、藻液温度变化范围20～35℃。

2、反应器准备与配制培养基：

室内2000mL三角烧瓶和培养用水(1000mL)经过121℃、20min湿热灭菌，冷却到室温(20～25℃，以下相同)后，按照表1加入所需的母液，配制成培养基。

室外培养反应器(50L培养箱，5m²、20m²和200m²培养池)的准备包括清洗及表面消毒两个过程，经过清洗和表面消毒的反应器中注入经过过滤的清洁培养用水，50L培养箱注入40L水，5m²、20m²和200m²培养池注入培养用水，使水深达到15-25cm。上述清洗用水和培养用水均通过液体过滤器(HFL-0820，10μm滤芯)过滤获得。根据注入的水量，按照表1加入所需的母液，配制成培养基。

所用培养基成分见表1。除碳酸氢钠直接称量干粉配制培养基外，其他各组分先配制成浓缩母液并煮沸消毒，再按所需数量添加到反应器中，得到所需培养基。当培养基体积较大时(200m²开放池)，硝酸盐、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙等亦可按照终浓度称量干粉加入。硝酸盐可以是硝酸钠(NaNO₃)、硝酸钾(NaNO₃)、硝酸镁(Mg(NO₃)₂)、硝酸钙(Ca(NO₃)₂)等，不同硝酸盐分子量不同，培养基组成中硝酸盐的浓度统一以硝酸根(NO₃ ^-)的浓度计量。

表1培养基组成及配制方法

3、接种与培养：

按照藻种扩大培养所述，逐级扩大培养，反应器提前清洗、消毒并配制好足量培养基，前一级培养为后一级培养提供藻种，接种时加入藻种液的体积不小于培养基体积的1/10，保证足够的接种量。

室外50L培养箱以过滤除菌的压缩空气进行搅拌；开放式培养池以调速电机带动叶轮搅拌器进行搅拌。培养过程中每天取样，监测藻液OD、生物质干重，并在显微镜下观察细胞形态。

对于藻种扩大培养，依据自然光照的强弱和温度的高低，培养时间在4～6天范围内变化，待藻液OD值达到1.0以上，即可为下一级培养供应藻种。

对于产油微藻的规模培养(200m²开放池，图1)，从接种到完成油脂的积累，整个培养周期为12～18天。

4、培养过程中藻液pH控制和CO₂供给：

利用在线pH控制器(Jenco IP-600-9TH.pH)—传感器(Jenco 6311)系统将藻液pH控制在一定范围内。藻液pH随着细胞光合作用消耗二氧化碳而逐渐升高，当pH传感器检测的藻液pH达到设定范围的上限时，pH控制器接通二氧化碳气体通道，二氧化碳气体经过管道流入安置在池底的微孔管状气体分散器，管状气体分散器的管壁上布满微孔，微孔的孔径小于100微米，CO₂通过管壁上的微孔形成细小的气泡进入藻液，CO₂气泡在藻液中上升的过程中逐渐被藻液吸收，藻液pH随之下降。当藻液pH下降到设定值的下限，pH控制器切断二氧化碳气体通道，停止通入二氧化碳。通过以上过程的不断循环，藻液的pH被维持在一定的范围内，同时，向培养液中补充碳源，供微藻光合作用使用。所述的pH为9.0～10.0范围内的任意值。

5、微藻的采收：

200m²培养池培养结束时停止搅拌，藻液静置6小时以上，使细胞沉降到池底；上清液从排水口自然排出，从而获得浓缩50倍以上的浓藻浆，再经过离心机脱水，采收生物质。沉降浓缩-离心采收的采收工艺极大减少了离心水处理量，也相应地减少了能耗成本。

通过以上技术措施，以产油微藻油球藻Graesiella sp.WBG-1为藻种，经过逐级扩大培养，接种到200m²开放式培养池，在自然光温条件下进行规模培养，利用pH在线控制系统控制外源CO₂通入藻液，将藻液pH维持在9.0～10.0范围内的任意值，培养结束后，使藻液静置，藻细胞自然沉降到池底，排出上清液，得到浓缩了50倍以上的浓藻浆，再经过离心脱水，藻泥的生物质干重达到25％以上；总脂含量平均达到生物质干重的31.55％，总脂产率平均2.32g m^-2d^-1，中性脂占总脂的88.89％，对外源CO₂的利用率平均达到65.77％。

作为本发明的一个优选方案，2000mL三角瓶培养藻种时，光照强度设置为50～100μmol m^-2s^-1，温度范围25～30℃，再逐级扩大培养。

作为本发明的一个优选方案，所述油球藻Graesiella sp.WBG-1在室外50L培养箱及5m²、20m²、200m²培养池培养前，先用毛刷彻底清洗反应器内表面和搅拌器，再喷施84消毒液(爱福特牌，有效氯1000mg L^-1)对反应器内表面消毒，然后使用过滤的清洁水将反应器内表面、通气管和搅拌器冲洗干净，将反应器内积水排除干净后，向反应器中放入经过过滤的清洁培养用水。上述清洗用水和培养用水均通过液体过滤器(HFL-0820，10μm滤芯)过滤获得。

作为本发明的一个优选方案，所述步骤5中培养结束时关闭搅拌机，藻液静置过夜(12小时以上)，排出上清液后获得浓缩藻液，再以离心法采收生物质。

作为本发明的一个优选方案，当利用所述方法进行油球藻Graesiella sp.WBG-1藻种液制备时，培养基中硝酸盐浓度(以硝酸根计)为0.073～0.219g L^-1；当进行油球藻Graesiella sp.WBG-1大规模开放式培养池(200m²)培养时，培养基中硝酸盐浓度(以硝酸根计)为0.036～0.146g L^-1。

作为本发明的一个优选方案，利用200m²培养池培养时，培养液pH控制在9.0～10.0范围内的任意值，当培养液pH高于10.0时，用二氧化碳气体将pH调节到优选的范围。

本发明与现有技术相比，其有益效果和优点在于：

1、本发明建立了一套完整的、利用开放池分批培养产油微藻的方法，该方法经过多次的开放式培养池培养验证，可操作性强、技术成熟、效果稳定。

2、利用所述方法，在200m²培养池中培养油球藻Graesiella sp.WBG-1，藻细胞油脂含量达到33.42％，其中88.89％的组份为中性脂(三酰甘油TAGs)(图2)，同时，脂肪酸以C16及C18等适合于炼制生物柴油的脂肪酸为主，C16及C18总和占总脂肪酸量的75％以上(图3)。相比于已有产油微藻开放式光自养培养的报道，本发明在更大规模(200m²，40000L)上获得了更高的油脂含量(总脂含量达到干重的30％以上)，获得的微藻生物质适合于作为微藻生物柴油的原料(见实施例3)。

3、以外源CO₂为碳源培养产油微藻，CO₂利用效率达到65％以上(见实施例3)，在利用烟道气CO₂为碳源培养产油微藻方面具有应用潜力。

4、利用油球藻Graesiella sp.WBG-1细胞大(8～12μm)、易沉降的特点，本发明采用自然沉降浓缩、离心采收的工艺路线，藻细胞经过自然沉降，浓缩50倍以上，之后进行离心处理的浓缩藻浆体积是原藻液体积的1/50以下(图4)，采收能耗大幅降低。

附图说明

图1为一种室外200m²开放式培养池培养油球藻Graesiella sp.WBG-1的培养现场图。

图2为一种油球藻Graesiella sp.WBG-1的总脂薄层层析图。薄层板基质为硅胶GF254，上样量20-40μg，展层剂为正己烷/乙醚/乙酸＝7/3/0.1，最后以碘蒸汽显色。图中最大的椭圆斑点为中性脂TAG。

图3为一种200m²开放式培养池培养油球藻Graesiella sp.WBG-1的总离子流色谱图。以含有0.5％NaOH的甲醇溶液对总脂提取物进行酯化，酯化样品气相色谱分离，质谱检测。图中横轴为保留时间，纵轴为总离子流丰度，波峰处标示了对应的脂肪酸及其离子丰度。

图4为一种油球藻Graesiella sp.WBG-1的自然沉降。左边量筒中是混合均匀的藻液，右边量筒是经过12小时静置的藻液，细胞全部沉降到量筒底部，液面高度约为30cm。

具体实施方式

根据下列实施例，可以更好的理解本发明专利。实施例中，所描述的培养基组成、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当限制权利要求书中所详细描述的本发明的范围。

实施例1：

产油微藻扩大培养包括2000ml三角瓶—50L培养箱—5m²培养池—20m²培养池培养(藻种扩大培养)，一种开放式培养池规模培养产油微藻Graesiella sp.WBG-1的培养方法，其步骤是：

(1)三角瓶及其培养用水准备：

2000ml三角瓶及其培养用水(1000ml)经121℃、20min高温湿热灭菌，冷却至室温，备用。

(2)50L培养箱及其培养用水的准备：

先用毛刷彻底清洗培养箱内表面，再喷施84消毒液(爱福特牌，有效氯1000mg L^-1)对培养箱内表面消毒，然后使用过滤的清洁水将培养箱内表面冲洗干净，排出积水，将经过煮沸消毒的通气管和砂芯气体分散器放入培养箱中，注入40L经过过滤的清洁水，接通气源开始通气(气流量3L min^-1)，通入的气体为空气与CO₂的混合气体，CO₂的比例为1.0％(V/V)，并经过0.22μm孔径滤膜过滤除菌。上述清洗用水和培养用水均通过液体过滤器(HFL-0820，10μm滤芯)过滤获得。

(3)开放池及其培养用水准备：

5m²、20m²培养池使用前，先用毛刷彻底清洗反应器内表面、搅拌器、CO₂气体分散器和通气管等所有可能接触到培养液的物体表面，再喷施84消毒液(爱福特牌，有效氯1000mgL^-1)对反应器内表面消毒，然后使用过滤的清洁水将反应器内表面、通气管和搅拌器冲洗干净，将反应器内积水排除干净后，向反应器中放入经过过滤的清洁水,水深15-25cm。上述清洗用水和培养用水均通过液体过滤器(HFL-0820，10μm滤芯)过滤获得。

(4)培养基配制：

按照表1所示的母液浓度分别配制6种浓缩母液，进行高压灭菌(121℃20min)后自然冷却到室温备用；培养前，向已注入清洁培养用水的三角瓶或反应器(50L培养箱，5m²,20m²培养池)中按表1所示逐个添加浓缩母液及碳酸氢钠，使用硝酸钠为氮源。当配制培养基体积较大时，硝酸钠、硫酸镁、氯化钙、磷酸氢二钾等药品按表1所示终浓度称量药品干粉加入；每添加一种母液(或干粉)后充分搅拌，再添加另一种母液(或干粉)，防止离子局部浓度过高而沉淀。

(5)2000mL三角瓶培养：

2000mL三角瓶和培养基(约1000mL)准备好以后，取上一次培养的藻种液(约300mL)加入2000mL三角瓶中，接种量控制在1/10以上，摇动三角瓶，使加入的藻种液与培养基混合均匀，将接种好的三角瓶放置在培养架上，温度范围25～30℃，光照强度控制在50～100μmol m^-2s^-1，光暗周期为14小时光照和10小时黑暗，每天人工摇动三角瓶4～6次，每天向三角瓶中充1次CO₂(流量2L min^-1，每次0.5～1分钟)，补充碳源同时控制藻液pH。培养4至6天即可为50L培养箱提供藻种。

(6)50L培养箱扩种培养：

将2000mL三角瓶中的藻种液接种到50L培养箱(含40L培养基)中，培养箱置自然光照下培养。培养过程中连续通入空气与CO₂的混合气体，CO₂的比例为1.0％(V/V)，气体流量为3.0L min^-1，通入的气体经过0.22μm孔径滤膜过滤除菌。每天取样测定藻液光密度(OD_540nm)，培养4至6天后藻液OD达到1.0以上，可用于下一级接种。

(7)5m²培养池扩种培养：

将培养箱培养的藻液约100L接种到5m²培养池中，调节搅拌器转速为20rpm。每天取样测定藻液光密度(OD_540nm)，培养4至6天后藻液OD达到1.0以上，可用于下一步培养的藻种。

pH控制和CO₂供给：利用在线pH控制器(Jenco IP-600-9TH.pH)—传感器(Jenco6311)系统将藻液pH控制在9.0～10.0范围内的任意值。藻液pH随着细胞光合作用消耗二氧化碳而逐渐升高，当pH传感器检测到藻液pH达到10.0，pH控制器接通二氧化碳气体通道，二氧化碳气体经过管道流入安置在池底的微孔管状气体分散器形成细小的气泡进入藻液，CO₂气泡在藻液中上升的过程中逐渐被藻液吸收，藻液pH随之下降。当藻液pH下降到9.0，pH控制器切断二氧化碳气体通道，停止通入二氧化碳。通过以上过程的不断循环，藻液的pH被维持在9.0～10.0范围内，同时，向培养液中补CO₂，为微藻光合作用提供所需的碳源。

(8)20m²开放池池扩种培养：

将5m²培养池培养的藻液约400L接种到20m²培养池中，调节搅拌器转速为20rpm。每天取样测定藻液光密度(OD_540nm)，培养4至6天后藻液OD值达到1.0以上，可用于下一步接种。

pH控制和CO₂供给：与5m²开放池扩种培养中pH控制和CO₂供给方法相同。

利用上述藻种扩大培养方法，可获得足量藻种，能够满足200m²开放池培养生产的需要。

实施例2：

不同硝酸盐培养油球藻Graesiella sp.WBG-1测定生物质产量和总脂含量。

按照实施例1所述方法，在5m²培养池中进行油球藻Graesiella sp.WBG-1的培养，培养基深度20cm，接种后藻液的生物质干重控制为0.05g L^-1。分别使用硝酸钠(NaNO₃)、硝酸钾(KNO₃)、硝酸镁(Mg(NO₃)₂)、硝酸钙(Ca(NO₃)₂)4种氮源，不同硝酸盐的浓度统一用硝酸根的浓度计量，全部为0.073g L^-1，每种硝酸盐重复培养3次，每次培养15天，培养过程中日平均光照强度在21～37molm^-2d^-1范围内，日平均水温在25～33℃范围内。

培养过程中每天取样测定生物质干重，培养15天，然后将藻液静置6小时，藻细胞自然沉到培养池底，将上清液排出培养池，剩下的浓藻液1500rpm离心10分钟采收生物质，真空冷冻干燥获得藻粉。采用0.45μm滤膜过滤法测定油球藻Graesiella sp.WBG-1生物质干重，采用正己烷/乙酸乙酯法(温小斌等.2012,中国油脂37(11):80-85)测定细胞总脂含量，结果见表2所示。

表2不同硝酸盐培养油球藻Graesiella sp.WBG-1的生物质产量和总脂含量

表2所呈现的结果说明，利用四种硝酸盐(硝酸钠、硝酸钾、硝酸镁、硝酸钙)分别培养油球藻Graesiella sp.WBG-1，油球藻生物质产量、生物质产率、总脂含量和总脂产率均没有显著差异(p＜0.05)，均可获得相同的效果。

实施例3：

不同初始氮源浓度培养油球藻Graesiella sp.WBG-1测定生物质产量和总脂含量。

按照实施例1所述方法，在5m²培养池中进行油球藻Graesiella sp.WBG-1的培养，使用硝酸钠为氮源，设置3种初始硝酸钠浓度0.05g L^-1、0.1g L^-1和0.2g L^-1，对应的硝酸根浓度分别是0.037g L^-1，0.073g L^-1和0.146g L^-1。培养基深度20cm，接种后藻液的生物质干重控制为0.05g L^-1，每个硝酸钠浓度重复培养3次，每次培养15天，培养过程中日平均光照强度在23～36mol m^-2d^-1范围内，日平均水温在25～32℃范围内。

培养过程中每天取样测定生物质干重，培养15天，然后藻液静置6小时，藻细胞自然沉到培养池底，将上清液排出培养池，剩下的浓藻液1500rpm离心10分钟采收生物质，真空冷冻干燥获得藻粉。采用0.45μm滤膜过滤法测定油球藻Graesiella sp.WBG-1生物质干重，采用正己烷/乙酸乙酯法(温小斌等.2012,中国油脂37(11):80-85)测定细胞总脂含量，结果见表3所示。

表3不同初始硝酸钠浓度培养油球藻Graesiella sp.WBG-1的生物质产量和总脂含量

从表3可以看出，油球藻Graesiella sp.WBG-1的生物质干重随硝酸钠(氮源)浓度的增加而增加，但总脂含量随着硝酸钠浓度的增加而降低。初始硝酸钠浓度0.1g L^-1(硝酸根浓度0.073g L^-1)的总脂产率最高，达到3.03g m^-2d^-1；硝酸钠浓度降低为0.05g L^-1(硝酸根浓度0.037g L^-1)，总脂含量可进一步提高，但生物质产率下降幅度较大，因而总脂产率比硝酸钠浓度0.1g L^-1有所降低；硝酸钠升高为0.2g L^-1(硝酸根浓度0.146g L^-1)后，生物质产率得到一定程度的提高，但总脂含量仅为干重的25.08％，致使总脂产率低于硝酸钠浓度0.1g L^-1的总脂产率。此外，初始硝酸钠浓度为0.05g L^-1、0.1g L^-1、0.2g L^-1时，培养结束时的总脂含量比培养开始时的总脂含量分别提高了89％，70％和52％，表明油球藻Graesiella sp.WBG-1在培养过程中具有显著的油脂积累。由此可见，在开放式培养池中培养油球藻Graesiella sp.WBG-1生产生物柴油的原料，适宜的初始硝酸钠浓度范围是0.05～0.2g L^-1，最适初始硝酸钠浓度是0.1g L^-1。

实施例4：

200m²开放式培养池培养油球藻Graesiella sp.WBG-1。

200m²开放式培养池培养包括培养池准备、培养基配制、接种、培养和采收等步骤，清洗培养池和配制培养基用水均经过液体过滤器(HFL-0820，10μm滤芯)过滤。

培养池准备：向200m²开放式培养池中注入少量过滤水，用毛刷沾水仔细刷洗池壁、池底、搅拌器叶片、CO₂气体分散器和通气管等所有可能接触到培养液的物体表面，不留死角，之后排尽污水，再用过滤水冲洗2或3遍，然后将水排干；向池壁、池底、叶轮搅拌器等接触培养液的表面喷施84消毒液(爱福特牌，有效氯1000mg L^-1)，连续喷施3次，然后用少量过滤水将池壁、池底、叶轮搅拌器冲洗干净，排干。

培养基配制：向培养池中注入过滤水，水深20cm，开启搅拌器。使用硝酸钠为氮源，硝酸钠浓度为0.1g L^-1，对应的硝酸根浓度为0.073g L^-1。根据注水体积及表1所示培养基组份终浓度计算出硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠等药品的需要量，称取干粉逐个加入水中，硫酸亚铁-EDTA(母液5)及微量元素(母液6)仍配制成浓缩母液，按照培养基体积及表1所示母液用量添加，每添加一种母液(或干粉)后充分搅拌，再添加另一种母液(或干粉)，防止离子局部浓度过高而沉淀。

接种及培养：将约4000L藻种液(20m²培养池培养)接种到200m²培养池中，调节搅拌器转速为25rpm。每天取样测定藻液光密度(OD_540nm)，同时测定藻液深度，培养15天。

培养过程中pH控制及CO₂补充：利用pH控制器(Jenco IP-600-9TH.pH)—传感器(Jenco 6311)系统将藻液pH控制在9.0～10.0范围内。藻液pH随着细胞光合作用消耗二氧化碳而逐渐升高，当pH传感器检测到藻液pH达到10.0，pH控制器接通二氧化碳气体通道，二氧化碳气体经过管道流入安置在池底的微孔管状气体分散器，管状气体分散器的管壁上布满微孔，微孔的孔径小于100微米，CO₂通过管壁上的微孔形成细小的气泡进入藻液，CO₂气泡在藻液中上升的过程中逐渐被藻液吸收，藻液pH随之下降。当藻液pH下降到9.0，pH控制器切断二氧化碳气体通道，停止通入二氧化碳。通过以上过程的不断循环，藻液的pH被维持9.0～10.0范围内，同时，向培养液中补CO₂，为微藻光合作用提供所需的碳源。

外源CO₂利用率的测定：准确称量装有CO₂钢瓶的重量，根据培养前后CO₂钢瓶重量变化计算出消耗CO₂的质量(M_CO2，kg)；根据微藻生物质干重的增加量(M_biomass，kg)，按照微藻生物质干重的碳元素含量50％(Grobbelaar J U,2004.Algal nutrition-mineralnutrition.In:Richmond A.(Eds):Handbook of microalgal culture:biotechnologyand applied phycology,97-115)，计算油球藻Graesiella sp.WBG-1对外源CO₂的利用率R_CO2：

式中M_biomass代表培养前后生物质的增加量，M_CO2代表培养过程中CO₂的消耗量。

生物质干重测定：培养过程中，每天从培养池中取藻液，0.45μm孔径滤膜过滤法测定藻液的生物质干重C_biomass(g L^-1)，同时测量并记录藻液的深度H(m)，根据生物质干重C_biomass、藻液深度H和培养池面积A(m²)计算生物质总量B(g)：

B＝1000×C_biomass×A×H

刚接种后测定的生物质总量就是培养初始的微藻生物质总量(B1)，培养结束前测定的生物质总量就是本次培养最终的微藻生物质总量(B2)。

生物质采收：培养结束后关闭搅拌机，藻液在培养池中静置12小时，藻细胞自然沉降到池底，之后通过培养池排水口自然排出上清液，得到浓缩藻浆。与原藻液相比，浓缩藻浆的生物质浓缩了50倍以上，生物质干重达到70g L^-1以上，体积缩小为原来的1/50以下；浓缩藻浆再经过离心机脱水，藻泥的生物质干重达到25％以上，最高达到35％(图4)。藻泥生物质干重越大，含水量就越小，越有利于微藻生物柴油加工过程中微藻油脂的提取。

生物质产率、油脂含量和产率分析计算：

根据培养初始的微藻生物质总量B1(g L^-1)，培养最终的微藻生物质总量B2(g L^-1)，培养池面积A(m²)和培养时间T(d)，计算生物质产率P_biomass(g m^-2d^-1)：

P_biomass＝(B2-B1)/(A×T)

采用正己烷/乙酸乙酯法(温小斌等.2012,中国油脂37(11):80-85)测定干藻粉的总脂含量：(1)称量干燥藻粉约50mg左右(重量计为m)，加入约10mg石英砂研磨破壁后转移入5mL带盖离心管；(2)加入4mL乙酸乙酯/正己烷的混合溶剂(1/1,V/V)，超声波15min，50℃提取30分钟，期间多次振荡混匀，10000r/min离心5分钟，收集上清液至50ml离心管中，重复提取一到两次，合并上清；(3)向上述获得的含有油脂的有机溶剂中加入等体积的纯水，振荡混匀后2000r/min离心1分钟加速分层，收集上层有机相至已烘干并准确称量净重的玻璃试管中(试管净重计为W1)；(4)氮气吹干溶剂，80℃干燥1h，准确称量玻璃试管重量，计为W2；(5)计算藻细胞的总脂含量C_lipid(％干重)：

式中m代表所称取的干燥藻粉的重量，W1是玻璃试管的重量、W2是玻璃试管和总脂提取物的总重量。

根据生物质产率P_biomass和对应的总脂含量C_lipid计算总脂产率P_lipid(g m^-2d^-1)：

P_lipid＝P_biomass×C_lipid

申请人利用200m²培养池进行了三次油球藻Graesiella sp.WBG-1的培养，培养过程中日平均光照强度在31～45mol m^-2d^-1范围内变化,日平均水温在23～29℃范围内变化。生物质产率、总脂含量、总脂产率和CO₂利用率见表4。

表4 200m²开放式培养池培养油球藻Graesiella sp.WBG-1

利用硅胶薄层层析法(常规分析方法)对抽提到的总脂肪进行定量分析(见图2)，其中中性脂(TAGs)在总脂中的比例达到88.89％(三次平均值)。利用甲醇(含0.5％NaOH)对上述总脂提取物进行酯化并进行脂肪酸组成的气相色谱分析(常规分析方法，见图3)，其中C16、C18等适合于炼制生物柴油的脂肪酸占总脂肪酸的75％以上(三次平均值)，各种脂肪酸组成见表5。

表5油球藻Graesiella sp.WBG-1脂肪酸组成及相对含量

200m²开放池培养油球藻Graesiella sp.WBG-1，生物质产率平均7.36g m^-2d^-1，总脂含量平均31.55％，总脂产率平均2.32g m^-2d^-1。藻油中性脂(合成生物柴油的主要原料)约占总脂的88.89％，其中C16和C18是主要的脂肪酸，占脂肪酸总量的76.07％，而柴油的主要成分就是C16和C18烷烃。由此可见，采用本发明技术规模培养产油微藻，可以获得大量的微藻油脂，而且生产的油脂非常适合作为生物柴油的原料。本发明以外源CO₂为碳源培养产油微藻，CO₂利用率达到65％以上，在利用烟道气CO₂为碳源培养产油微藻方面具有应用潜力。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院武汉植物园

<110> 中国石油化工股份有限公司

<120> 一株油球藻Graesiella sp. WBG-1及分离筛选方法和应用

<130> 一株油球藻Graesiella sp. WBG-1及分离筛选方法和应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1722

<212> DNA

<213> 油球藻

<400> 1

ctggtcttgt tctcagatta cgccatgcat gtctaagtat aaactgctta tactgtgaaa 60

ctgcgaatgg ctcattaaat cagttatagt ttatttggtg gtaccttact actcggataa 120

ccgtagtaat tctagagcta atacgtgcgt aaatcccgac ttctggaagg gacgtatata 180

ttagataaaa ggccgaccgg gctttgcccg acccgcggtg aatcatgata tcttcacgaa 240

gcgcatggcc ttgtgccggc gctgttccat tcaaatttct gccctatcaa ctttcgatgg 300

taggatagag gcctaccatg gtggtaacgg gtgacggagg attagggttc gattccggag 360

agggagcctg agaaacggct accacatcca aggaaggcag caggcgcgca aattacccaa 420

tcctgatacg gggaggtagt gacaataaat aacaataccg ggcatttcat gtctggtaat 480

tggaatgagt acaatctaaa tcccttaacg aggatccatt ggagggcaag tctggtgcca 540

gcagccgcgg taattccagc tccaatagcg tatatttaag ttgttgcagt taaaaagctc 600

gtagttggat ttcgggtggg ttctagcggt ccgcctatgg tgagtactgc tatggccttc 660

ctttctgtcg gggacgggct tctgggcttc actgtccggg actcggagtc gacgtggtta 720

ctttgagtaa ttagagtgtt caaagcaggc ttacgccctg aatactttag catggaataa 780

cacgatagga ctctggccta tcttgttggt ctgtaggact ggagtaatga ttaagaggga 840

cagtcggggg cattcgtatt tcattgtcag aggtgaaatt cttggattta tgaaagacga 900

actactgcga aagcatttgc caaggatgtt ttcattaatc aagaacgaag ttgggggctc 960

gaagacgatt agataccgtc gtagtctcaa ccataaacga tgccgactag ggattggcga 1020

atgttttttt aataacttcg ccagcacctt atgagaaatc aaagtttttg ggttccgggg 1080

ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag gaattgacgg aagggcacca ccaggcgtgg 1140

agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg aaaacttacc aggtccagac atagtgagga 1200

ttgacagatt gagagctctt tcttgattct atgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt 1260

ggtgggttgc cttgtcaggt tgattccggt aacgaacgag acctcagcct gctaaatagt 1320

cctagttgct ttttgcagct agctgacttc ttagagggac tattggcgtt tagtcaatgg 1380

aagtatgagg caataacagg tctgtgatgc ccttagatgt tctgggccgc acgcgcgcta 1440

cactgatgca ttcaacaagc ctatccttga ccgaaaggtc cgggtaatct ttgaaactgc 1500

atcgtgatgg ggatagatta ttgcaattat tagtcttcaa cgaggaatgc ctagtaagcg 1560

caagtcatca gcttgcgttg attacgtccc tgccctttgt acacaccgcc cgtcgctcct 1620

accgattggg tgtgctggtg aagtgttcgg attggcagct tagggtggca acacctcagg 1680

tctgccgaga agttcataaa ccctccacct agagagaagc at 1722

<210> 2

<211> 349

<212> DNA

<213> 油球藻

<400> 2

cctttgcgac tgcggaggga cattgattat taaaccacaa tgtgaacctc aacgttccgt 60

gccctggctt gccagtgggg cggctgggta ctacccggtc gtactcacag ctgggtgggc 120

attgttgcct gctcagtggc gccttggcat gatcatacac cagtgctaac cactgataaa 180

accaaactct gaagtttgat tgctattaac tggcaatctt aaccaaagac aactctcaac 240

aacggatatc ttggctctcg caacgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata cgtagtgtga 300

attgcagaat tccgtgaacc atcgaatctt tgaacgcata ttgcgctcg 349

<210> 3

<211> 303

<212> DNA

<213> 油球藻

<400> 3

agccttcggg caagagcatg tctgcctcag cgtcggttta caccctcacc cctccctttc 60

ttgggtgtgt tgatctttga tcaaccattg gggtggatct ggcttcccca atctgccttg 120

tagcggattg ggttggctga agcacagagg cttaagcaag gacccgatat gggcttcaac 180

tggataggta gcaacggctt gtgccgacta cacgaagttg ttgcctgtgg actttgctag 240

aggccaagca ggaacgtgct tatgcatgcc taaacttcga cctgagctca gcaagcagcc 300

cgt 303

Claims (3)

1.一种开放式培养池规模培养产油微藻的方法，其步骤是：

A、反应器准备与配制培养基：

室内2000mL三角烧瓶和培养用水经过湿热灭菌121℃、20min，冷却到室温后，加入培养基母液，配制成培养基；

室外培养反应器的准备：包括清洗及表面消毒两个过程，经过清洗和表面消毒的反应器中注入经过过滤的清洁培养用水，50L培养箱注入40L水，5m²、20m²和200m²培养池注入15-25cm深度的培养用水，根据注入的水量，按照下表加入所需的母液，配制成培养基；

所用培养基成分，除碳酸氢钠直接称量干粉配制培养基外，其余先配制成浓缩母液并煮沸消毒，再按所需数量添加到反应器中，得到所需培养基，配制的培养基体积为200m²开放池时，硝酸盐、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙按照终浓度称量干粉加入，硝酸盐是硝酸钠、或硝酸钾、或硝酸镁、或硝酸钙，不同硝酸盐分子量不同，培养基组成中硝酸盐的浓度统一以硝酸根的浓度计量；

培养基组成及配制方法

B、藻种的扩大培养：

以油球藻Graesiella sp.WBG-1为藻种，保藏编号为CCTCC NO：M2015486，培养藻种从2000mL三角瓶开始，依次经过2000mL三角瓶、室外50L培养箱、室外5m²培养池、室外20m²培养池逐级扩大培养，室外培养箱以过滤除菌的压缩空气进行搅拌；开放式培养池以调速电机带动叶轮搅拌器进行搅拌，藻液深度控制在10～30cm范围内，培养过程中每天取样，监测藻液OD、生物质干重，在显微镜下观察细胞形态；每一级扩大培养中接种量的体积不少于培养基体积的1/10；对于藻种扩大培养，依据自然光照的强弱和温度的高低，培养时间在4～6天，待藻液OD值达到1.0以上，即可为下一级培养供应藻种，从而得到油球藻Graesiellasp.WBG-1藻种液，在室外光温条件下逐级扩大培养的过程中，藻细胞逐步适应了自然光照与温度的变化，实验期间光照强度变化范围0～2600μmol m^-2s^-1、藻液温度变化范围20～35℃；

C、200m²开放式培养池接种与培养：

按照藻种扩大培养所述方法获得藻种液，200m²开放式培养池接种时加入藻种液的体积不小于培养基体积的1/10；200m²开放式培养池以调速电机带动叶轮搅拌器进行搅拌，藻液深度控制在10～30cm范围内，培养过程中每天取样，监测藻液OD、生物质干重，在显微镜下观察细胞形态；

对于200m²的产油微藻的规模培养，从接种到完成油脂的积累，整个培养周期12～18天；

D、培养过程中藻液pH控制和CO₂供给：

利用在线pH控制器—传感器系统将藻液pH控制在一定范围内，藻液pH随着细胞光合作用消耗二氧化碳逐渐升高，当pH传感器检测的藻液pH达到设定范围的上限时，pH控制器接通二氧化碳气体通道，二氧化碳气体经过管道流入安置在池底的微孔气体分散器形成细小的气泡进入藻液，CO₂气泡在藻液中上升的过程中逐渐被藻液吸收，藻液pH随之下降；当藻液pH下降到设定值的下限时，pH控制器切断二氧化碳气体通道，停止通入二氧化碳；通过以上过程的不断循环，藻液的pH控制在一定的范围内，向培养液中补充碳源，供微藻光合作用使用，所述的pH范围为9.0～10.0之间的任意值；

E、微藻的采收：

200m²培养池培养结束时停止搅拌，藻液静置6小时后细胞沉降到池底；上清液从排水口自然排出，获得浓缩50倍的浓藻浆，再经过离心机脱水，采收生物质。

2.根据权利要求1所述的一种开放式培养池规模培养产油微藻的方法，其特征在于：所述的2000mL三角瓶培养藻种时，光照强度设置为50～100μmol m^-2s^-1，温度范围25～30℃，再逐级扩大培养。

3.根据权利要求1所述的一种开放式培养池规模培养产油微藻的方法，其特征在于：所述的油球藻Graesiella sp.WBG-1藻种液制备时，培养基中硝酸盐的浓度为0.073～0.146gL^-1；进行油球藻Graesiella sp.WBG-1 200m²开放式培养池培养时，培养基中硝酸盐浓度为0.037～0.146g L^-1。