CN104673672B - 一株循环利用校园污水的栅藻sdec-13的培养方法和应用 - Google Patents

一株循环利用校园污水的栅藻sdec-13的培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株循环利用校园污水的栅藻SDEC‑13的培养方法和应用。取校园污水经六层纱布过滤处理未经其他灭菌、稀释等繁琐操作直接投入使用，一次利用后再次收集，循环使用直至其不能维持栅藻SDEC‑13的生长。本发明利用校园污水作为替代培养基循环利用培养栅藻SDEC‑13，大大降低了满足微藻生长所需水及营养物质的成本消耗，并且生产的生物质具有产高品质蛋白及油脂的潜能，此外还能便捷经济的处理校园污水，使得校园污水最终能达标排放，因此此方法的应用兼具环境与经济效益，值得推广使用。

Description

一株循环利用校园污水的栅藻SDEC-13的培养方法和应用
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，特别涉及一株循环利用校园污水的栅藻SDEC-13的培养方法和应用。
背景技术
微藻资源丰富，不会因收获而破坏生态系统，可大量培养而不占用耕地。另外，它的光合作用效率高，生长周期短，单位面积年产量是粮食的几十倍乃至上百倍。而且微藻脂类含量在20％至70％，是陆地植物远远达不到的，不仅可生产生物柴油或乙醇，还有望成为生产氢气的新原料，因此微藻作为极具潜力的生物能源引起广泛的关注和研究。然而由于微藻的培养成本高，使其成为制约微藻开发的两大瓶颈问题之一。
应对培养成本高这一问题，研究者提出了利用污水作为替代培养基来培养微藻这一概念。近年来由于人类经济活动的迅速发展，氮磷等营养物质大量排入水体，造成水体富营养化，导致藻类异常繁殖及水质恶化。利用污水作为培养微藻的替代培养基能极大程度上节省为满足微藻生长所需而提供的水资源及氮磷营养物质的消耗成本，同时能够有效的去除污水中的氮磷等营养物质起到污水净化的作用，研究表明由于微藻生长速度快，繁殖代谢旺盛等特点，其污水净化效率高，并且相比其他传统的物化方法，利用微藻处理污水这一生物净水方法具有处理成本低且没有二次污染等问题的阻碍。
因此，研究者提出处理污水与生产生物质耦合这样的理念，即微藻将污水作为资源利用，消耗其中的氮磷等营养物质来合成自身所需的物质及生物质能源，实现污水处理由处理系统向生产系统的转化，这一理念的实现兼具环境效益与经济效益。
本发明就是基于以上背景涉及一种循环利用校园污水作为替代培养基培养栅藻SDEC-13同时积累生物质的新方法。
发明内容
本发明针对微藻生产生物柴油培养成本高的问题，提供了一种利用校园污水作为替代培养基并循环利用来培养栅藻SDEC-13的新方法。该方法既降低微藻培养成本，又可以实现污水资源化利用同时能够积累油脂，蛋白，多糖等有价值的生物质。最终校园污水可以循环使用两次来作为栅藻SDEC-13的培养基，经两次利用后，氮磷得到高效去除，出水可 达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)一级A限值即TN<15mg·L-1，TP<0.5mg·L-1。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一株循环利用校园污水的栅藻SDEC-13的培养方法，包括如下步骤：
1)栅藻SDEC-13于BG-11培养基中富集培养；
2)将富集培养后的栅藻栅藻SDEC-13接种于装有校园污水的生物反应器中，初始接种密度达0.76*106个/mL，生物量浓度约为0.11g/L，688nm下吸光度为0.2；
3)将步骤(2)中接种完毕的生物反应器置于人工气候室中培养，培养条件为：温度24-30℃，光照强度2000–4000Lux，连续光照，曝气量180-230mL/min，培养时间16天；
4)将步骤3)培养的栅藻SDEC-13进行离心，收获生物质，离心后的藻泥置于冷冻干燥器中处理20h后，得SDEC-13干藻粉；收集离心后的藻液上清液待用；
5)将步骤4)中的藻液上清液作为校园污水再次使用，重复步骤2)，将得到的生物反应器再次置于人工气候室中培养，培养条件为：温度24-30℃，光照强度2000–4000Lux，连续光照，曝气量180-230mL/min，培养时间10天；
6)将步骤5)培养的栅藻SDEC-13进行离心，收获生物质，离心后的藻泥置于冷冻干燥器中处理20h后，得SDEC-13干藻粉。
优选的是，步骤1)中，所述的BG-11培养基成分和用量如下：NaNO31500mg·L-1，K2HPO422.5～84.3mg·L-1，MgSO4·7H2O 75mg·L-1，CaCl2·2H2O 36mg·L-1，柠檬酸6mg·L-1，柠檬酸铁铵6mg·L-1，EDTANa21mg·L-1，Na2CO320mg·L-1，H3BO32.86mg·L-1，MnCl2·4H2O1.86mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.22mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.39mg·L-1，CuSO4·5H2O0.08mg·L-1，Co(NO3)2·6H2O 0.05mg·L-1，pH：6.9-7.5。
优选的是，步骤2)中，所述校园污水的初始水质为：TN：37.6–47.8mg/L，NH4 +-N：27.2–34.2mg/L，TP 2.40–2.91mg/L，COD：240.2–368.8mg/L，pH：8.5-8.9。
本发明还提供了一种循环利用校园污水的栅藻SDEC-13培养基，所述栅藻SDEC-13培养基为校园污水，初始水质参数(mg/L)为：TN：37.6–47.8mg/L，NH4 +-N：27.2–34.2mg/L，TP2.40–2.91mg/L，COD：240.2–368.8mg/L，pH：8.5-8.9，接种密度为生物量0.1g/L，接种后的藻细胞密度为0.11g/L，688nm下吸光度为0.2。
优选的是，所述的校园污水经六层纱布过滤。
上述的栅藻SDEC-13，为Scenedesmus quadricauda SDEC-13，其保藏编号为CCTCCNO：M 2014498，保藏日期为2014年10月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏 中心，保藏地址是中国湖北省武汉市武汉大学。
优选的是，所述栅藻SDEC-13培养基为校园污水，初始水质参数(mg/L)为：TN：37.6–47.8mg/L，NH4 +-N：27.2–34.2mg/L，TP 2.40–2.91mg/L，COD：240.2–368.8mg/L，pH：8.5-8.9，接种密度为生物量0.1g/L，接种后的藻细胞密度为0.11g/L，688nm下吸光度为0.2。
优选的是，所述的校园污水经六层纱布过滤。
优选的是，所述的培养基培养循环利用校园污水的栅藻SDEC-13，得到循环利用校园污水的栅藻SDEC-13藻粉。
本发明还提供了一种培养权利要求1的循环利用校园污水的栅藻SDEC-13的培养方法，包括如下步骤：
1)栅藻SDEC-13于BG-11培养基中富集培养；
2)将富集培养后的栅藻栅藻SDEC-13接种于装有校园污水的生物反应器中，初始接种密度达0.76*106个/mL，生物量浓度约为0.11g/L，688nm下吸光度为0.2；
3)将步骤(2)中接种完毕的生物反应器置于人工气候室中培养，培养条件为：温度24-30℃，光照强度2000–4000Lux，连续光照，曝气量180-230mL/min，培养时间16天；
4)将步骤3)培养的栅藻SDEC-13进行离心，收获生物质，离心后的藻泥置于冷冻干燥器中处理20h后，得SDEC-13干藻粉；收集离心后的藻液上清液待用；
5)将步骤4)中的藻液上清液作为校园污水再次使用，重复步骤2)，将得到的生物反应器再次置于人工气候室中培养，培养条件为：温度24-30℃，光照强度2000–4000Lux，连续光照，曝气量180-230mL/min，培养时间10天；
6)将步骤5)培养的栅藻SDEC-13进行离心，收获生物质，离心后的藻泥置于冷冻干燥器中处理20h后，得SDEC-13干藻粉。
优选的是，步骤1)中，所述的BG-11培养基成分和用量如下：NaNO31500mg·L-1，K2HPO422.5～84.3mg·L-1，MgSO4·7H2O 75mg·L-1，CaCl2·2H2O 36mg·L-1，柠檬酸6mg·L-1，柠檬酸铁铵6mg·L-1，EDTANa21mg·L-1，Na2CO320mg·L-1，H3BO32.86mg·L-1，MnCl2·4H2O1.86mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.22mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.39mg·L-1，CuSO4·5H2O0.08mg·L-1，Co(NO3)2·6H2O 0.05mg·L-1，pH：6.9-7.5。
优选的是，步骤2)中，所述校园污水的初始水质为：TN：37.6–47.8mg/L，NH4 +-N：27.2–34.2mg/L，TP 2.40–2.91mg/L，COD：240.2–368.8mg/L，pH：8.5-8.9。
上述的循环利用校园污水的栅藻SDEC-13在处理校园污水和/或积累生物质的用途。
更优选的是，所述处理为净化。
上述的循环利用校园污水的栅藻SDEC-13在制备生物柴油和/或油脂中的用途。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：
1、本发明提供了一种培养栅藻SDEC-13的替代培养基—校园污水，提供了一种污水资源化高效利用的新途径，大大降低了栅藻SDEC-13的培养成本，同时积累了栅藻SDEC-13的生物质，校园污水培养的栅藻SDEC-13具有较高的油脂产率并体现出较高品质的生物柴油特性，此外还含有较高的蛋白含量。
2、本发明提出了循环利用校园污水培养栅藻SDEC-13的新方法，最终获得较高的氮磷去除率，使得校园污水能达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)一级A的排放标准。不仅经济方便的解决了污水处理问题，另外循环利用污水来培养栅藻SDEC-13大大降低了微藻的培养成本，兼具环境效益与经济效益。
附图说明
图1：栅藻SDEC-13在校园污水两次利用中的生长曲线。
图2：栅藻SDEC-13在校园污水第一次利用时的氮浓度及pH的变化情况。
图3：栅藻SDEC-13在校园污水第一次利用时磷浓度的变化情况。
图4：栅藻SEDC-13在校园污水两次利用中的油脂积累特性。
具体实施方式
以下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件进行选择。
实施例1：
实施例1 本发明藻株的扩大培养
(1)所使用培养基：BG-11培养基成分如表1所示，配置完毕用NaOH或HCL来调节pH值控制在7.1左右，120℃条件下高压灭菌30分钟后方可投入使用。
表1 BG11培养基成分
化学成分 用量(mg·L-1)
(1)NaNO3 1500
(2)K2HPO4 40
(3)MgSO4·7H2O 75
(4)CaCl2·2H2O 36
(5)柠檬酸 6
(6)柠檬酸铁铵 6
(7)EDTANa2 1
(8)Na2CO3 20
(9)H3BO3 2.86
(10)MnCl2·4H2O 1.86
(11)ZnSO4·7H2O 0.22
(12)Na2MoO4.2H2O 0.39
(13)CuSO4.5H2O 0.08
(14)Co(NO3)2.6H2O 0.05
母液为1L蒸馏水，用1M NaOH或者HCl调节pH到7.1后灭菌、备用。
(2)培养条件：将保藏的栅藻SDEC-13倾入锥形瓶中按体积比1:3的比例加入BG-11培养液，放置于光照培养箱中培养，温度为25±1℃，全光照，光照强度2000-3000Lux，大约七天后肉眼观察到藻液颜色由浅绿变为深绿色，经显微计数确定细胞密度达107个/mL以上时即可。
实施例2 栅藻SDEC-13对于校园污水的循环利用
取回的校园污水是流经化粪池之后的，经过六层纱布过滤后可直接投入使用，测得校园污水初始水质为：TN：37.6–47.8mg/L，NH4 +-N：27.2–34.2mg/L，TP 2.40–2.91mg/L，COD：240.2–368.8mg/L，pH：8.5-8.9。按照预设的比例接种实例1中扩大培养后的栅藻SDEC-13于装有校园污水的生物反应器中，使其初始生物量浓度约为0.11g/L，吸光度约为0.2(688nm)。
1.培养条件：人工气候室中培养，温度为24-30℃，光照为2000-4000Lux的连续光照，曝气量为180-230mL/min。第一次培养16天后栅藻SDEC-13的生长开始进入衰亡期，因此16天时立即离心收获，获得的上清液继续循环使用，按照(1)中的接种密度进行接种同样的培养条件下开始栅藻SDEC-13新一轮的培养。第二次培养持续10天，10天时立即进行离心收获。获得的上清液再次投入使用，再次进行接种培养，发现污水经两次使用后不能再继续维持栅藻SDEC-13的生长。
2.水质指标及生物量的测定：每日同一时间取混合均匀的藻液30mL进行水质指标及其生长状况的监测。用吸光度和生物量浓度来表征栅藻SDEC-13的生长状况。10mL藻液于紫外分光光度计中688nm下测定吸光度，其余20mL藻液于离心机中4000r/min的转速下离心分层，底泥去除后置于烘干箱中60℃下恒温烘干称重测定生物量浓度(g/L)，上清液用来测定水质指标。离心后的上清液经0.45μm的滤膜过滤后分别用来测定氮磷浓度。氨氮 的检测采用纳氏试剂光度法(HJ 535-2009)，硝氮测定采用采用紫外分光光度法(HJ/T346-2007)，总磷的测定采用钼酸铵分光光度法(GB 11893-89)。
3.生物量结果分析：如图1所示，相对于在二次利用的校园污水中栅藻SDEC-13在校园污水一次利用时的生长更快，周期更长且没有明显的停滞期，获得的最高生物量比二次利用校园污水的获得量的三倍还多，这归因于二次利用的校园污水中氮磷等营养物质远低于原始校园污水中的含量。但一次利用校园污水获得的生物量大约为1.09g/mL与BG-11中的获得量相当，虽然栅藻SDEC-13在校园污水中的生长周期比BG-11中短。
4.水质指标监测分析：表2显示了两次利用校园污水的始终浓度及相应的去除率，一次利用时氨氮及总磷去除较快，最终几乎全部去除，如图2及图3所示，硝氮去除率达70％。二次利用校园污水时，通过外加K2HPO4补充磷源，满足栅藻SDEC-13生长对于磷的需求，而氮源仅有硝氮，经过对校园污水的两次利用，氮磷均得到较好的去除，氮浓度约为4mg/L，磷浓度不足0.1mg/L，最终校园污水能满足《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)一级A标准而达标排放。
表2：两次利用校园污水的氮磷浓度及去除率
实施例3 栅藻SDEC-13的油脂积累特性
1.栅藻SDEC-13藻粉的获得
当校园污水对栅藻SDEC-13的两次培养分别开始进入衰亡期时，对藻液进行离心收获，收获后的藻泥经过冷冻干燥获得干藻粉。
2.栅藻SDEC-13油脂含量的测定
称取0.1g干藻粉于50mL离心管中，加入10mL氯仿/甲醇(2:1)溶液，用超声破碎仪破碎10min，然后4000r/min离心分离10min，保留有机相，将有机相转移到60mL分液漏斗中，整个提取过程重复两次。根据分离的有机相体积，投加0.9％的氯化钠溶液(1:5)，充分摇匀1min，并静置分层15min，回收下层油脂提取溶液并测量其体积，取5mL回收溶液于10mL玻璃试管中，用氮气吹干，将玻璃管放置于80℃烘箱中烘至衡重(约30分钟)。方程计算油脂含量：
式中：LW—基于干重下的油脂含量，g/g；
m1—藻粉干重，g；
m0—10mL玻璃管干重，g；
m2—带有油脂的10mL玻璃管干重，g；
V—低相油脂的体积，mL。
结果如图4所示，本发明所得结果为栅藻SDEC-13在校园污水中两次利用后的油脂产量相差甚微均高于27％，虽然二次利用的校园污水中氮磷含量较低，但并没有影响油脂的积累，而油脂产率相差较大，约为一次利用校园污水培养栅藻SDEC-13获得的油脂产率的1/3，这是由于二次利用的校园污水中氮磷等营养物质远低于第一次利用时的含量，导致两次培养后获得的生物量差距很大。由油脂积累结果分析可知，校园污水可循环使用作为替代培养基培养栅藻SDEC-13生产生物质能源。
3.栅藻SDEC-13脂肪酸甲酯成分分析
提取脂肪酸甲酯方法：取0.1g藻粉于离心管中，加入2mL浓度为5％的NaOH甲醇溶液或硫酸甲醇溶液，将其置于恒温水浴锅中60℃水浴1小时后，冷却。向反应后的溶液中加入正己烷1mL，静置30min后，提取上层溶液100uL置于干净的试剂瓶中，再将25uL内标物(2mg/L,十七烷酸甲酯)加入试剂瓶中，待测。
采用气相色谱-质谱联用仪测定脂肪酸甲酯，采用全扫描模式，扫描范围为50-300amu。参数设置如下，色谱柱：VF-23ms，采用程序升温的方法：150℃保留1min，然后以1°C/min升温至165℃；进样口温度：220℃。
脂肪酸甲酯成分分析显示(如表3)，栅藻SDEC-13在BG-11及校园污水两次利用中获得的脂肪酸成分基本相同，主要成分为C16-C18，其中棕榈酸(C16:0)的含量最高，占所有成分的60％左右。其次的主要成分为油酸(C18:1)，油酸由于具有氧化稳定性及低温流动性等优点是生物柴油最理想的组成成分，表3中显示在校园污水中获得的油酸含量远高于BG-11中的获得量，因此校园污水适合作为做为培养基来生产高品质的生物柴油。
表3 栅藻SDEC-13在BG-11及校园污水两次利用中的脂肪酸成分
SFA＝饱和脂肪酸(14:0,16:0)；MUFA＝单不饱和脂肪酸(16:1,18:1)；PUFA＝多不饱和脂肪酸(18:2,18:3).
实施例4 栅藻SDEC-13的蛋白组成分析
称取60mg干藻粉用氨基酸分析仪测定栅藻SDEC-13的氨基酸组成成分。分析结果如表4所示，通过氨基酸含量加和可知栅藻SDEC-13的蛋白含量依次是BG-11>一次利用>二次利用，这说明蛋白含量与所用培养基中氮磷等营养物质的含量成正比。但三种培养基培养栅藻SDEC-13获得的蛋白含量均高于30％，相差不大。栅藻SDCE-13在三种培养基中都含有八种必需氨基酸。其中六种必需氨基酸含量均高于粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)1973年规定的标准值。此外，求得栅藻SDEC-13必需氨基酸指数(EAAI)均高于1，据相关文献报道的EAAI大于0.95时获得的蛋白具有高品质，因此栅藻SDEC-13也可被作为产高品质蛋白的来源。相比BG-11培养基栅藻SDEC-13生活在两次利用的校园污水中，蛋白含量稍有逐渐降低的趋势，但是蛋白品质并未受到影响。其中EAAI按下式计算：
式中aai：在测试蛋白质某种必须氨基酸占必须氨基酸总量的比例，
AAi：在参考蛋白中某种必须氨基酸占必需氨基酸总量的比例，
n：表示必需氨基酸的种数。
表4 栅藻SDEC-13在BG-11及两次利用的校园污水中的蛋白组成分析
TAA：氨基酸总和，EAA：必需氨基酸总量，其包括Thr、Met、Ile、Leu、Phe、Lys、Trp、Val八种必需氨基酸。EAAI表示必需氨基酸指数。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (3)

1.一株循环利用校园污水的栅藻SDEC-13的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)栅藻SDEC-13于BG-11培养基中富集培养；
2)将富集培养后的栅藻SDEC-13接种于装有校园污水的生物反应器中，初始接种密度达0.76× 106个/mL，生物量浓度约为0.11g/L，688nm下吸光度为0.2；
3)将步骤2)中接种完毕的生物反应器置于人工气候室中培养，培养条件为：温度24-30℃，光照强度2000–4000Lux，连续光照，曝气量180-230mL/min，培养时间16天；
4)将步骤3)培养的栅藻SDEC-13进行离心，收获生物质，离心后的藻泥置于冷冻干燥器中处理20h后，得SDEC-13干藻粉；收集离心后的藻液上清液待用；
5)将步骤4)中的藻液上清液作为校园污水再次使用，重复步骤2)，将得到的生物反应器再次置于人工气候室中培养，培养条件为：温度24-30℃，光照强度2000–4000Lux，连续光照，曝气量180-230mL/min，培养时间10天；
6)将步骤5)培养的栅藻SDEC-13进行离心，收获生物质，离心后的藻泥置于冷冻干燥器中处理20h后，得SDEC-13干藻粉；
所述的栅藻SDEC-13为Scenedesmus quadricauda SDEC-13，其保藏编号为CCTCC NO：M2014498，保藏日期为2014年10月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的BG-11培养基成分和用量如下：NaNO3 1500mg·L-1，K2HPO4 22.5～84.3mg·L-1，MgSO4·7H2O 75mg·L-1，CaCl2·2H2O36mg·L-1，柠檬酸6mg·L-1，柠檬酸铁铵6mg·L-1，EDTANa2 1mg·L-1，Na2CO3 20mg·L-1，H3BO3 2.86mg·L-1，MnCl2·4H2O 1.86mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.22mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.39mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.08mg·L-1，Co(NO3)2·6H2O 0.05mg·L-1，pH：6.9-7.5。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述校园污水的初始水质为：TN：37.6–47.8mg/L，NH4 +-N：27.2–34.2mg/L，TP 2.40–2.91mg/L，COD：240.2–368.8mg/L，pH：8.5-8.9。
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