CN109628315A - 一种培养小球藻并提升其生物量和油脂产率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种培养小球藻并提升其生物量和油脂产率的方法，包括如下步骤：(1)微藻培养：将碳酸氢钠添加至灭菌小球藻培养液中，接种小球藻后将培养液置于光培养箱中培养7‑10天，并向培养液中通入二氧化碳‑氮气混合气，控制培养温度25‑28℃，白色荧光照明100‑150μmol m‑2s‑1；(2)生物量监测：绘制小球藻干重标准曲线，培养过程中每天监测小球藻培养液的680nm处的吸光度(OD680)，根据标准曲线转换成干重；(3)油脂提取：收集培养后的藻液，冻干后使用加入氯仿‑甲醇溶液提取油脂，向提取液中持续通入氮气，使溶剂挥发，直至试管恒重，计算藻粉的油脂含量。本方法可以明显提升小球藻的生物量和油脂产量。

Description

一种培养小球藻并提升其生物量和油脂产率的方法
技术领域
本发明涉及一种微藻培养方法，具体涉及通过同时补充碳酸氢钠和二氧化碳来培养小球藻，以增强小球藻中的生物量和油脂产量。
背景技术
由于微藻的快速生长周期、高光合效率和高脂质含量，微藻被视为生产生物燃料和固定CO2的优质原料。
微藻是可利用CO2作为碳源的自养单细胞光合微生物。然而，由于CO2进入水中的溶解速率有限，CO2向光合生物质的转化是十分低效的。因此，大量注入的CO2会流失到大气中，导致藻类无法吸收足够的CO2。此外，藻类培养基的pH会随着CO2浓度的增加而显着降低，这也限制了微藻的生长。加入NaHCO3可作为解决上述问题的方案。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足，并基于上述生化机理，提供一种培养小球藻并提升其生物量和油脂产率的方法
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种培养小球藻并提升其生物量和油脂产率的研究方法，包括如下步骤：
A.微藻培养：
将小球藻接种于含有一定浓度碳酸氢钠的BG11培养基的容器内，接种量控制为使初始OD680为0.1(根据干重标准曲线，其生物量浓度记为c0)，然后置于光培养箱中培养7-10天(培养天数记为t)，通入过滤灭菌后的二氧化碳-氮气混合气，二氧化碳-氮气混合气由1％二氧化碳和99％氮气组成，温度25-28℃，白色荧光照明100-150μmol m-2s-1；
B.生物量监测：
(1)取不同质量小球藻稀释为不同生物量浓度的藻液若干份，分别测试吸光度(OD680)，并将藻液经过0.45μm滤膜，干燥滤膜后计算不同藻液的生物量浓度；将吸光度和生物量浓度制成微藻生物量标准曲线。培养过程中每天监测微藻培养液的吸光度，根据标准曲线转换成微藻干重。
(2)培养期最后一天测量培养液的OD680，根据干重标准曲线，转换为微藻生物量浓度，记为ct；
微藻的生物量产率为：
C.油脂提取：收集培养后的藻液，离心后冷冻干燥制成藻粉；向质量为mB的藻粉加入氯仿-甲醇溶液(氯仿:甲醇＝2:1)提取，将提取液转移至新的重为mT的试管中，通入氮气使溶剂挥发直至试管恒重，恒重后的试管质量记为mL。
藻粉油脂含量：
微藻产油量：PL(mg L-1d-1)＝cL×PB。
与现有技术相比，本发明的技术方案所带来的有益效果是：
1.本发明同时补充CO2和NaHCO3以达到协同效应。一方面，这可以提高CO2的利用效率。在这种情况下，藻类将消耗来自NaHCO3的CO2，其在溶液中产生OH-。OH-离子将增加介质中CO2的溶解度。另一方面，这还可以减少未溶解的CO2的损失。同时补充HCO3 -抵消CO2降低pH的问题。同时，产生的OH-和CO2再生成HCO3 -。因此，培养基可以始终保持最佳的碳浓度并且减小pH波动，这有利于微藻的生物量积累。此外，加入NaHCO3将提升微藻培养液中的Na+浓度，Na+一方面可以促进HCO3 -透过微藻原生质膜被微藻利用并转换成生物量，另一方面可以促进藻细胞合成相容性溶质以抵抗培养液渗透压的升高，后者是一些油脂合成的前体物，可能导致藻细胞油脂含量增加。这样，藻细胞总质量和油脂含量的同时提升可以导致微藻生物量和油脂产量的提升。
2.在本发明的实施例中通过在小球藻培养过程中加入碳酸氢钠并同时通入1％二氧化碳-氮气混合气，和未加入碳酸氢钠和二氧化碳-氮气混合气的培养相比，本发明可以分别提升生物量和油脂产量25.1倍和28.2倍。因此,同时通入碳酸氢钠和二氧化碳可以明显提升小球藻的生物量和油脂产量。
3.发明中的二氧化碳可以来自化工和发电厂产生的废烟气，碳酸氢钠可以来自于化学固碳产物，如果结合本发明申明的培养模式，不需要额外添加有机碳源且能生产具有成本效益的生物质，是一种可持续发展的双重战略。
附图说明
图1是实施例1和实施例2中使用的小球藻Chlorella sorokiniana UTEX 1602的生物量干重标准曲线。
图2是实施例1中小球藻Chlorella sorokiniana UTEX 1602在培养过程中的生物量浓度变化曲线，其中：
(1)0g/L表示小球藻在未加入碳酸氢钠并通入1％二氧化碳-氮气混合气的培养；
(2)1g/L表示小球藻在加入1g/L碳酸氢钠并通入1％二氧化碳-氮气混合气的培养；
(3)空白表示小球藻在未加入碳酸氢钠且未通入二氧化碳-氮气混合气的培养。
图3是实施例2中小球藻Chlorella sorokiniana UTEX 1602在培养过程中的生物量浓度变化曲线，其中：
(1)0g/L表示小球藻在未加入碳酸氢钠并通入1％二氧化碳-氮气混合气的培养；
(2)4g/L表示小球藻在加入4g/L碳酸氢钠并通入1％二氧化碳-氮气混合气的培养；
(3)空白表示小球藻在未加入碳酸氢钠且未通入二氧化碳-氮气混合气的培养。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了更好地使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。
实施例1
1)藻种培养：
(1)将小球藻Chlorella sorokiniana UTEX 1602接种于250mL圆柱容器内，其中含有200mL的BG11培养基，置于光培养箱中培养5天，通入过滤灭菌后的1％二氧化碳-氮气混合气，温度25℃，白色荧光照明120μmol m-2s-1
BG11培养基组成为下表所示：
(2)取培养后的小球藻藻种，稀释为体积为100mL的不同生物量浓度的藻液若干份，分别取少量测试样测量藻液的吸光度，测量后将测试样倒回藻液中，并将藻液经过已恒重的0.45μm醋酸酯滤膜，之后将所有滤膜放入烘箱干燥至恒重；
将吸光度和生物量浓度数据绘制成图，线性拟合后得到微藻生物量标准曲线。
2)培养实验：将对数期的藻种接种于含有1g/L的碳酸氢钠的BG11培养基的250mL锥形瓶内，接种量控制为使初始OD680为0.1，然后置于光培养箱中培养8天，通入过滤灭菌后的1％二氧化碳-氮气混合气，通气速率为20mL min-1温度25℃，白色荧光照明120μmol m-2s-1；
3)油脂提取：
(1)收集培养后的藻液，在5000rpm转速下离心10min，然后用蒸馏水重悬小球藻生物质，再重复上述操作三次；
(2)将离心后的微藻生物质放入冷冻离心机，在-80℃下冷冻干燥24h；
(3)将100mg藻粉转移至10mL具塞试管中，向干燥的藻粉中加入2mL氯仿-甲醇溶液(氯仿:甲醇＝2:1)，混匀震荡提取30min之后，在5000rpm转速下离心10min，收集上清液，并向沉淀中加入2mL氯仿-甲醇溶液，重复上述操作四次，合并上清液；
(4)向上清液中加入2mL 0.9％氯化钠溶液，混合均匀之后，在5000rpm转速下离心5min，将下层提取液转移至新的已称重的试管中；
(5)向收集的提取液中持续通入氮气，使溶剂挥发，直至试管恒重。
4)该实施例中小球藻的最终生物量产率达到342mg L-1d-1，油脂含量达到29.5％，油脂产率达到101mg L-1d-1，和不加入碳酸氢钠的培养相比提升20.8％，是不加入碳酸氢钠和二氧化碳的28.2倍。
实施例2
1)藻种培养：本实施例采用的藻种为Chlorella sorokiniana UTEX 1602，藻种培养方法同实施例1；
2)培养实验：将对数期的藻种接种于含有2g/L的碳酸氢钠的BG11培养基的250mL锥形瓶内，接种量控制为使初始OD680为0.1，然后置于光培养箱中培养8天，通入过滤灭菌后的1％二氧化碳-氮气混合气，温度28℃，白色荧光照明120μmol m-2s-1；
3)油脂提取：本实施例油脂提取方法同实施例1；
4)该实施例中小球藻的最终生物量产率达到251mg L-1d-1，油脂含量达到20.5％，油脂产率达到51.7mg L-1d-1，和不加入碳酸氢钠的培养相比提升13.1％，是不加入碳酸氢钠和二氧化碳的26.4倍。
本发明并不限于上文描述的实施方式。以上对具体实施方式的描述旨在描述和说明本发明的技术方案，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，并不是限制性的。在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，本领域的普通技术人员在本发明的启示下还可做出很多形式的具体变换，这些均属于本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种培养小球藻并提升其生物量和油脂产率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)微藻培养：将碳酸氢钠添加至灭菌小球藻培养液中，接种小球藻后将培养液置于光培养箱中培养7-10天，并向培养液中通入二氧化碳-氮气混合气，控制培养温度25-28℃，白色荧光照明100-150μmol m-2s-1；
(2)生物量监测：绘制小球藻干重标准曲线，培养过程中每天监测小球藻培养液的680nm处的吸光度(OD680)，根据标准曲线转换成干重；
(3)油脂提取：收集培养后的藻液，冻干后使用加入氯仿-甲醇溶液提取油脂，向提取液中持续通入氮气，使溶剂挥发，直至试管恒重，计算藻粉的油脂含量。
2.根据权利要求1所述的一种培养小球藻并提升其生物量和油脂产率的研究方法，其特征在于，步骤(1)中加入0.25-4g/L的碳酸氢钠。
3.根据权利要求1所述的一种培养小球藻并提升其生物量和油脂产率的研究方法，其特征在于，步骤(1)中二氧化碳-氮气混合气由1％二氧化碳和99％氮气组成，二氧化碳-氮气混合气进入培养液之前利用0.22μm滤膜除去微生物。
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