CN110387332A - 一种利用人工市政污水培养小球藻积累并提取蛋白质的研究方法 - Google Patents

一种利用人工市政污水培养小球藻积累并提取蛋白质的研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种利用人工市政污水培养小球藻积累并提取蛋白质的研究方法，主要包括如下步骤：1)小球藻的扩大培养；2)人工市政污水的配制与灭菌处理；3)小球藻的接种与培养；4)蛋白质标准曲线的绘制；5)蛋白质的测定。小球藻能够在人工市政污水中快速生长，通过超声破碎的微藻细胞在经过碱热法的双重作用后，可以测定的小球藻蛋白质含量达到63％。该体系在对市政污水实施净化处理的同时能够迅速积累生物量并获得具有经济效益的微藻蛋白质。

Description

一种利用人工市政污水培养小球藻积累并提取蛋白质的研究 方法
技术领域
本发明涉及微藻生物处理技术领域，具体涉及一种利用人工市政污水培养小球藻积累并提取蛋白质的研究方法。
背景技术
随着经济的不断发展和城市规模的不断扩大，市政污水中氮磷等营养物质的污染问题也逐渐凸显。根据最新的《2015年环境统计年报》[1]，我国废水排放总量达到735.3亿吨，比 2014年增加2.7％；总氮、氨氮和总磷排放量分别为461.33万吨、229.91万吨和54.68万吨；其中城镇生活污水和工业废水中氨氮排放量共占氨氮排放总量的67.7％。针对市政污水的脱氮除磷处理，常规物化方法存在运行成本高、净化效率低、能耗大等缺点，并可能引起二次污染；传统生物处理法净化效果稳定，但活性污泥的最终处理仍然是一个难题[2]。通过微藻生物技术，利用富含氮磷营养盐的市政污水培养微藻，能够更好地将水质净化与生物质生产有机结合起来，在降低微藻生物技术成本的同时可以提高微藻生物质产率。
微藻是一种广泛存在于生态系统中的自养型微生物，具有光合作用效率高、生长周期短、油脂含量高、不占用耕地等优点，在生长过程中能够吸收市政污水中的氮磷、碳水化合物等成分来合成自身所需物质，并向周围释放O2，最终还可收获微藻作为合成高附加值产物的原料[3]。其中，蛋白质即为微藻培养的高价值有用物质之一。蛋白质的测定方法主要有凯氏定氮法、等电点沉淀法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法等[4]。本专利采用考马斯亮蓝法测定微藻蛋白质，原理为：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，其最大光吸收在 465nm；而考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后变为青色，在595nm波长下有最大光吸收。在一定的蛋白质浓度范围内(0～1000μg/mL)，蛋白质-色素结合物在595nm波长下的吸光度值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用人工市政污水培养小球藻积累并提取测定小球藻中蛋白质含量的研究方法。并在此基础上进一步优化蛋白质的测定条件。
本发明的技术方案如下：利用人工市政污水培养小球藻积累并提取蛋白质的研究方法，包括如下步骤：
1)小球藻的扩大培养：
(1)将小球藻Chlorella sp.1602以10％的接种体积(V藻液/V培养基)接种于装有200mLBG-11 培养基的250mL锥形瓶中，
(2)在温度28℃、光强4000lux条件下下通入5％的CO2合成气体，扩大培养5-10天；
2)人工市政污水的配制与灭菌处理：
(1)由于实际市政污水受外界因素影响波动较大，现根据实际市政污水的水质参数人工配制市政污水以提高实验指标的可控性和复现性；
(2)将人工市政污水培养基在121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却后使用；
所述步骤2)中人工市政污水原始水质为：NH4 +-N、NO3 --N、PO4 3--P及COD的质量浓度分别为49.4mg/L、13.4mg/L、9.5mg/L和783mg/L。
3)小球藻的接种与培养：
(1)取处于对数生长期生长良好的小球藻Chlorella sp.1602，控制初始接种生物质浓度为 30mg/L，将小球藻分别接种于12个装有200mL人工市政污水培养基的250mL锥形瓶中；
(2)在温度28℃、光强4000lux、全天光照的条件下培养微藻，每天定时振摇3次；
4)测定小球藻蛋白质含量：
所述步骤4)测定小球藻蛋白质的具体步骤如下：
(1)根据考马斯亮蓝法测定并绘制蛋白质的标准曲线；
(2)培养5天后取小球藻样品9mL，以5000r/min的转速离心10min，除去上清液，在藻渣沉淀中加入9mL浓度为0.02M的PBS磷酸盐缓冲液(pH＝7)进行重悬；
(3)利用超声波破碎仪对小球藻细胞进行破碎，设置破碎条件为：功率200W，工作3s，间隔3s，工作时间5min；
(4)取1mL经过超声波细胞破碎后的小球藻藻液，加入0.5mL浓度为10mol/L的NaOH，再加入1.5mL去离子水，摇匀后将样品分别置于60℃和100℃条件下消解30、45、60、90、 120、150min，每个样品设置三个平行；
(5)冷却后使用台式离心机以5000r/min的转速将样品离心10min，将上清液pH值调至中性；
(6)取0.2mL上清液并定容至1mL，加入5mL考马斯亮蓝溶液，以1mL去离子水加入5mL考马斯亮蓝为空白调零，放置5min，在595nm处利用紫外分光光度计测定吸光度，最后根据标准曲线计算蛋白质含量(％)。
与现有技术相比，本发明具有的优点：
本发明利用人工市政污水培养小球藻5天后，通过细胞破碎、碱热法的双重作用，在60℃条件下消解120min更有利于小球藻Chlorella sp.1602蛋白质的提取与测定。
本发明将人工市政污水作为小球藻Chlorella sp.1602的培养基质，在实现废水净化的同时获取具有高附加价值的微藻蛋白质，并进一步探究了碱热法提取微藻蛋白质的优化条件，是一种实现微藻蛋白质生产与测定的高效方法。
附图说明
图1为考马斯亮蓝法测定蛋白质的标准曲线；
图2为利用人工市政污水培养的小球藻在60℃和100℃条件下消解30、45、60、90、120、 150min后提取测定出的蛋白质含量。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步说明。本发明的实施例是为了更好地使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何限制。
本发明利用人工市政污水培养小球藻积累并提取蛋白质的研究方法，包括如下步骤：
1)小球藻的扩大培养：
(1)将小球藻Chlorella sp.1602以10％的接种体积(V藻液/V培养基)接种于装有200mLBG-11 培养基的250mL锥形瓶中，
(2)在温度28℃、光强4000lux条件下下通入5％的CO2合成气体，扩大培养5-10天；
上述步骤1)中(1)所述的BG-11培养基组成如下表1所示：
表1 BG-11培养基组成成分和含量
其中微量元素(Trace elements solution)储存液配方为：H3BO3 286mg、MnCl2·4H2O 186 mg、ZnSO4·7H2O 22.2mg、CuSO4·5H2O 7.9mg、Na2MoO4·2H2O 39mg、CO(NO3)2·6H2O 4.9 mg，加蒸馏水定容至100mL。
2)人工市政污水的配制与灭菌处理：
(1)由于实际市政污水受外界因素影响波动较大，现根据实际市政污水的水质参数人工配制市政污水以提高实验指标的可控性和复现性；
(2)将人工市政污水培养基在121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却后使用；
上述步骤2)中人工市政污水组成成分和含量如表2所示：
表2人工市政污水组成成分和含量
微量元素(Trace elements solution)储存液配方为：H3BO3 286mg、MnCl2·4H2O186mg、 ZnSO4·7H2O 22.2mg、CuSO4·5H2O 7.9mg、Na2MoO4·2H2O 39mg、CO(NO3)2·6H2O4.9mg，加蒸馏水定容至100mL。
3)小球藻的接种与培养：
(1)取处于对数生长期生长良好的小球藻Chlorella sp.1602，控制初始接种生物质浓度为 30mg/L，将小球藻分别接种于12个装有200mL人工市政污水培养基的250mL锥形瓶中；
(2)在温度28℃、光强4000lux、全天光照的条件下培养微藻，每天定时振摇3次；
4)蛋白质标准曲线的绘制：
(1)首先用牛血清白蛋白配制含蛋白质100μg/mL的蛋白质标准溶液；
(2)称取100μg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，存于棕色瓶中；
(3)分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL蛋白质标准溶液，并分别以蒸馏水补充至1 mL，然后加入5mL考马斯亮蓝溶液，充分振荡摇匀后放置5min，在595nm处用紫外分光光度法测定，绘制吸光度与蛋白质含量的标准曲线；
5)小球藻蛋白质的测定：
(1)培养5天后取小球藻样品9mL，以5000r/min的转速离心10min，除去上清液，在藻渣沉淀中加入9mL浓度为0.02M的PBS磷酸盐缓冲液(pH＝7)进行重悬；
(2)利用超声波破碎仪对小球藻细胞进行破碎，设置破碎条件为：功率200W，工作3s，间隔3s，工作时间5min；
(3)取1mL经过超声波细胞破碎后的小球藻藻液，加入0.5mL浓度为10mol/L的NaOH，再加入1.5mL去离子水，摇匀后将样品分别置于60℃和100℃条件下消解30、45、60、90、 120、150min，每个样品设置三个平行，具体详见表3为实施例1至12中12个样品工艺条件；
(4)冷却后使用台式离心机以5000r/min的转速将样品离心10min，将上清液pH值调至中性；
(5)取0.2mL上清液并定容至1mL，加入5mL考马斯亮蓝溶液，以1mL去离子水加入5mL考马斯亮蓝为空白调零，放置5min，在595nm处利用紫外分光光度计测定吸光度，最后根据标准曲线计算蛋白质含量(％)。
本发明具体实施例按照上述步骤1)至步骤5)进行，实施例1至实施例12工艺参数见表3：
表3实施例1至12工艺参数
如图2所示为利用人工市政污水培养微藻5天后，在60℃和100℃条件下将样品消解30、 45、60、90、120、150min后所获得的蛋白质含量，可以看出在60℃条件下消解120min更有利于小球藻Chlorella sp.1602蛋白质的提取与测定，在此条件下小球藻的蛋白质含量达到 63.03％；本发明将人工市政污水作为小球藻的培养基质，在实现废水净化的同时促进了小球藻的生长及高附加值化学品的积累，并进一步探究了小球藻Chlorellasp.1602蛋白质提取与测定的优化条件。
应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
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[4]李宁.几种蛋白质测定方法的比较[J].山西农业大学学报(自然科学版),2006, 26(2):132-134。

Claims (3)

1.一种利用人工市政污水培养小球藻积累并提取蛋白质的研究方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)小球藻的扩大培养：
(1)将小球藻Chlorella sp.1602以10％的接种体积(V藻液/V培养基)接种于装有200mL BG-11培养基的250mL锥形瓶中，
(2)在温度28℃、光强4000lux条件下下通入5％的CO2合成气体，扩大培养5-10天；
2)人工市政污水的配制与灭菌处理：
(1)由于实际市政污水受外界因素影响波动较大，现根据实际市政污水的水质参数人工配制市政污水以提高实验指标的可控性和复现性；
(2)将人工市政污水培养基在121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却后使用；
3)小球藻的接种与培养：
(1)取处于对数生长期生长良好的小球藻Chlorella sp.1602，控制初始接种生物质浓度为30mg/L，将小球藻分别接种于12个装有200mL人工市政污水培养基的250mL锥形瓶中；
(2)在温度28℃、光强4000lux、全天光照的条件下培养微藻，每天定时振摇3次；
4)测定小球藻蛋白质含量。
2.根据权利要求1所述的一种利用人工市政污水培养小球藻积累并提取蛋白质的研究方法，其特征在于，所述步骤2)中人工市政污水原始水质为：NH4 +-N、NO3 --N、PO4 3--P及COD的质量浓度分别为49.4mg/L、13.4mg/L、9.5mg/L和783mg/L。
3.根据权利要求1所述的一种利用人工市政污水培养小球藻积累并提取蛋白质的研究方法，其特征在于，所述步骤4)测定小球藻蛋白质的具体步骤如下：
(1)根据考马斯亮蓝法测定并绘制蛋白质的标准曲线；
(2)培养5天后取小球藻样品9mL，以5000r/min的转速离心10min，除去上清液，在藻渣沉淀中加入9mL浓度为0.02M的PBS磷酸盐缓冲液(pH＝7)进行重悬；
(3)利用超声波破碎仪对小球藻细胞进行破碎，设置破碎条件为：功率200W，工作3s，间隔3s，工作时间5min；
(4)取1mL经过超声波细胞破碎后的小球藻藻液，加入0.5mL浓度为10mol/L的NaOH，再加入1.5mL去离子水，摇匀后将样品分别置于60℃和100℃条件下消解30、45、60、90、120、150min，每个样品设置三个平行；
(5)冷却后使用台式离心机以5000r/min的转速将样品离心10min，将上清液pH值调至中性；
(6)取0.2mL上清液并定容至1mL，加入5mL考马斯亮蓝溶液，以1mL去离子水加入5mL考马斯亮蓝为空白调零，放置5min，在595nm处利用紫外分光光度计测定吸光度，最后根据标准曲线计算蛋白质含量(％)。
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