CN114763516A - 烟气汞胁迫下利用植物激素促进微藻固碳和生产脂肪酸的方法 - Google Patents
烟气汞胁迫下利用植物激素促进微藻固碳和生产脂肪酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种烟气汞胁迫下利用植物激素促进微藻固碳和生产脂肪酸的方法，包括以下步骤：将产油微藻接种至培养基上，在特定条件下培养至对数期，得到微藻，将微藻接种至灭菌后的废水中，在特定条件下培养至对数期且在培养过程中光照时通入含有CO2的气体，得到驯化微藻，将驯化微藻接种至废水中，再加入一定浓度的吲哚‑3‑乙酸，继续在特定条件下培养且在培养过程中光照时通入含有CO2的废气。微藻会将废水中氮、磷营养盐及烟气中CO2等转化成生物质，本发明的方法实现烟气污染物如汞胁迫下，微藻生物质产量、微藻固碳能力、净化废水能力及脂肪酸产量的同步提高。
Description
技术领域
本发明属于固碳技术领域，具体来说涉及一种烟气汞胁迫下利用植物激素促进微藻固碳和生产脂肪酸的方法。
背景技术
由于全球温室效应及能源危机加剧，微藻资源化固碳技术已成为国际CO2减排和新能源开发领域的前沿研究热点，具有广阔的应用前景。微藻是地球上广泛存在的微生物，因其生长速度快、固碳效率高、油脂含量高、易于大规模培养等优势，被视为新一代的甚至能完全替代传统石化柴油的生物柴油原材料。研究表明，微藻通过光合自养过程，不但可以吸收水中营养盐，用于处理生活污水、农业废水等；还可以吸收利用CO2，用于捕集燃煤电厂、煤化工厂、工业炉窑等排放烟气中CO2。因此，建立微藻固碳耦合净化废水体系，既可以节省微藻培养所需的氮、磷、碳等营养源，又可降低碳排放，同时实现废水、废气及微藻的资源化利用，对于缓解温室效应和发展低碳经济具有重要意义。
但是，目前微藻固碳产业尚处于起步阶段，存在一些技术瓶颈。例如，1)烟气CO2成分复杂，含有汞等污染物，对微藻生长有抑制作用。为了缓解污染物的毒性，通常是开发新的藻种；然而，仅培养具有抗毒性的藻种不利于微藻的大规模产业化应用。2)由于微藻生物柴油具有“碳中和”的特性，而且其污染物排放水平较石化柴油要低，所以，近年来微藻生产生物柴油被广泛关注。然而，用于生产生物柴油的原料供应不足，阻碍了生物柴油的进一步推广应用。因此，尚需提高微藻生物质产量。3)通常情况下，微藻在全营养条件下培养可以获得比较快的生长速率，但是含油量并不高。研究者发现贫氮条件下刺激脂质含量提高的同时，往往伴随着细胞生长的停滞和生物量的减少，这将导致脂质产率无法有效提高。因此，高生物质产量和高脂肪酸产量往往难以同时获得。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种烟气汞胁迫下利用植物激素促进微藻固碳和生产脂肪酸的方法，该方法在废水培养微藻，通过驯化微藻藻种、确定最优植物激素浓度、并于废水培养微藻体系中添加少量的植物激素，调整光合作用关键基因，缓解烟气污染物汞对微藻的毒性作用，促进微藻的光合作用，提高微藻固碳能力和脂肪酸产量，方法高效、简单、易于操作。
本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。
一种烟气汞胁迫下利用植物激素促进微藻固碳和生产脂肪酸的方法，包括以下步骤：
1)将产油微藻以5～10mgdw·L-1的密度接种至培养基上，在特定条件下培养至对数期，得到微藻，其中，所述特定条件：pH为7.0-8.0，温度为25～30℃，光照强度为3000-6000Lux，光照时间为8-14h；
在所述步骤1)中，所述培养基为BG11培养基。
在所述步骤1)中，所述产油微藻为小球藻、栅藻或螺旋藻。
在所述步骤1)中，培养过程中，每隔10～45天进行转接并继续在所述特定条件下培养。
在所述步骤1)中，所述培养于空气环境中进行。
2)将步骤1)所得微藻以5～10mgdw·L-1的密度接种至灭菌后的废水中，在所述特定条件下培养至对数期，得到驯化微藻，其中，在光照时通入CO2气体以使CO2气体占培养环境气氛体积的5～20％；
在所述步骤2)中，所述废水为过滤后的市政废水、生活污水或啤酒废水。
3)将步骤2)所得驯化微藻以5～10mgdw·L-1的密度接种至废水中，再加入吲哚-3-乙酸，以使吲哚-3-乙酸的浓度为Z mg/L，Z＝0.1-10，在所述特定条件下培养至对数期，获得生物量，最大生物量时的Z为Y，其中，在光照时通入CO2气体以使CO2气体为培养环境气氛体积的5～20％；
在所述步骤3)中，培养至对数期后，通过测试获得吸光度，最大吸光度所对应的Z为Y。
在上述技术方案中，在680nm波长下测试所述吸光度。
4)将步骤2)所得驯化微藻以5～10mgdw·L-1的密度接种至废水中，再加入吲哚-3-乙酸，以使吲哚-3-乙酸的浓度为Y mg/L，继续在所述特定条件下培养，其中，在光照时通入含有CO2的废气。
在上述技术方案中，培养环境气氛中气体的流速为0.05-0.2vvm。
上述驯化微藻在提高脂肪酸产量、生物量密度、固碳速率、PsbA基因的表达量和/或对废水氮营养的去除率中的应用。
本发明的方法简单、便于操作，实现烟气污染物如汞胁迫下，微藻生物质产量、微藻固碳能力、净化废水能力及脂肪酸产量的同步提高。
本发明利用植物激素作为微藻生长的刺激因素，上调微藻光合作用的关键基因，当废气中含有汞时，缓解污染物汞对微藻的毒性作用。
微藻会将废水中氮、磷营养盐及烟气中CO2等转化成生物质，并从中提取油脂作为生物柴油的原料，减低微藻油脂的生产成本，真正实现减污降碳。
附图说明
图1为实施例1、实施例2和对比例1的生物量密度(图中藻生物量密度)和固碳速率(图中最大固碳速率)；
图2为实施例1、实施例2和对比例1的脂肪酸含量和PsbA相对表达量；
图3为实施例3、实施例4和对比例2的生物量密度(图中藻生物量密度)和固碳速率(图中最大固碳速率)；
图4为实施例3、实施例4和对比例2的脂肪酸含量和PsbA相对表达量。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
BG11培养基的配方如下：NaNO3 1500mg/L，K2HPO4·3H2O 40mg/L，MgSO4·7H2O75mg/L，Na2CO3 20mg/L，CaCl2 27mg/L,柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁6mg/L，Na2EDTA 1mg/L，微量元素A5溶液1mL。微量元素A5溶液由以下成分组成：H3BO3 2.86mg/L，MnCl2·4H2O 1.81mg/L，ZnSO4·7H2O 0.222mg/L，CuSO4·5H2O 0.079mg/L，CoCl2·6H2O 0.050mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.39mg/L。
基于常见市政废水氮、磷营养盐特点，下述实施例中所使用的废水为模拟过滤后的市政废水，其成分如下：CH3COONa(150mg/L)，NH4Cl(150mg·L-1)，KH2PO4(13mg·L-1)，FeSO4·7H2O(0.55mg·L-1)，CaCl2·2H2O(6mg·L-1)，MgSO4·7H2O(66mg·L-1)，微量元素A5(1mg·L-1)。
本发明的方法于培养箱(型号：CHP-160，厂家：天津津立仪器设备科技发展有限公司)中的锥形瓶中进行，当通入CO2气体时，向锥形瓶内放入一根气管，从气管的顶部输入CO2气体并在锥形瓶内液体中曝气。
在本发明的技术方案中，光照可为自然光源和人工光源的一种或两种结合。
本发明涉及的测试方法具体包括：
(1)测试生物量(干重)和微藻的生物量密度
取培养至对数期的驯化微藻V毫升加入至25毫升比色管中，使用超纯水，定容至25毫升，得到梯度浓度的藻液，其中，V＝0、1、2.5、5、7.5、10、12.5、15和20。做两组相同的梯度浓度的藻液。
第一组梯度浓度的藻液使用抽滤装置用0.22微米水系滤膜过滤，将过滤藻液后的滤膜在105℃烘箱中烘干至恒重记为M1，滤膜在使用前于105℃烘至恒重记为M0。通过M1-M0＝微藻干重，获得微藻干重。N＝(M1-M0)/V，N记为微藻的生物量密度(单位：mgdw·L-1)。
第二组梯度浓度的藻液使用紫外分光光度计，在680nm波长下，测定其吸光度。
根据第一组梯度浓度的藻液获得的微藻的生物量密度和第二组梯度浓度的藻液获得的吸光度，建立不同浓度藻液在680nm波长下的吸光度与微藻的生物量密度的关系。
在下述实施例和对比例测试生物量密度时，取3毫升藻液，在680nm波长下，使用紫外分光光度计测定其吸光度。通过前期建立的吸光度与微藻的生物量密度的关系，确定微藻的生物量密度。
(2)微藻生长速率
微藻生长速率(GR，mgdw/(L·day))的计算方法如下：
其中，Ni+1为第ti+1天时的微藻的生物量密度(mgdw/L)，Ni为第ti天时的微藻的生物量密度(mgdw/L)。
(3)固碳速率
微藻固定CO2速率(mgCO2/(L·day))R(固碳速率)的计算方法如下：
R＝GR×C×44/12
其中，C为通过使用元素分析仪测得驯化微藻的生物量中碳元素重量百分比。
本发明的方法结束后，测试微藻的脂肪酸含量的方法参见：Kong,W.W.,Kong,J.,Lyu,H.H.,Ma,J.,Yuan,P.,Wang,Z.Z.,Shen,B.X.,Feng,S.Integrating municipalwastewater treatment with CO2 fixation and fatty acid production bycultivating Tetradesmus obliquus.J.Clean.Prod.2021b,320,128916.。
微藻对废水氮营养的去除率(％)(TN去除率)计算方法如下：
其中，C0为初始时的废水氮营养盐浓度，Cf为结束时的废水氮营养盐浓度。废水氮营养盐浓度根据《水和废水监测分析方法》，采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定。
小球藻来源：购于中国科学院水生生物研究所。
实施例1～4
一种烟气汞胁迫下利用植物激素促进微藻固碳和生产脂肪酸的方法，包括以下步骤：
1)将产油微藻以6mgdw·L-1的密度接种至灭菌后的培养基上，培养基为BG11培养基，于空气环境下，在特定条件下培养至对数期，得到微藻，其中，特定条件：培养基的pH为8，培养的温度为25℃，光照强度为4000Lux，光照时间为10h(每日9:00-19:00)，产油微藻为小球藻，培养过程中，每隔15天进行转接并继续在特定条件下培养；
2)将步骤1)所得微藻以6mgdw·L-1的密度接种至灭菌后的废水中，在与步骤1)中相同的特定条件下培养至对数期，得到驯化微藻，其中，在光照时通入CO2气体以使CO2气体占培养环境气氛体积的10％(培养环境气氛中除去CO2气体后剩余的气体为氮气)，培养环境气氛中气体的流速为0.1VVm；
3)将步骤2)所得驯化微藻以6mgdw·L-1的密度接种至废水中，再加入吲哚-3-乙酸，以使吲哚-3-乙酸的浓度为Z mg/L，Z＝0.1-10，Z值详见表1，在与步骤1)中相同的特定条件下培养至对数期，获得生物量，最大生物量时的Z为Y，其中，在光照时通入CO2气体以使CO2气体为培养环境气氛体积的10％(培养环境气氛中除去CO2气体后剩余的气体为氮气)，培养环境气氛中气体的流速为0.1vvm；
不同Z值对应的生物量如表1所示。
表1
经过测试，获得Z＝2mg/L所对应的生物量为最大值，即Y＝2mg/L。又再取Y＝1mg/L用于对比。
4)将步骤2)所得驯化微藻以6mgdw·L-1的密度接种至废水中，再加入吲哚-3-乙酸，以使吲哚-3-乙酸的浓度为Y mg/L，继续在特定条件下培养，其中，在光照时通入含有CO2的废气，培养环境气氛中气体的流速为0.1vvm，废气为CO2和氮气的混合气体且废气中含有Dμg·m-3Hg，废气中CO2气体所占体积为10％。
D值和Y值如表2所示。
表2
| 实施例 | D | Y | 编号 |
| 实施例1 | 10 | 1 | Hg10+IAA1 |
| 实施例2 | 10 | 2 | Hg10+IAA2 |
| 实施例3 | 30 | 1 | Hg30+IAA1 |
| 实施例4 | 30 | 2 | Hg30+IAA2 |
对比例1(Hg10)
烟气汞胁迫下微藻固碳和生产脂肪酸的方法，包括以下步骤：
1)将产油微藻以6mgdw·L-1的密度接种至灭菌后的培养基上，培养基为BG11培养基，于空气环境下，在特定条件下培养至对数期，得到微藻，其中，特定条件：培养基的pH为8，培养的温度为25℃，光照强度为4000Lux，光照时间为10h(每日9:00-19:00)，产油微藻为小球藻，培养过程中，每隔15天进行转接并继续在特定条件下培养；
2)将步骤1)所得微藻以6mgdw·L-1的密度接种至灭菌后的废水中，在与步骤1)中相同的特定条件下培养至对数期，得到驯化微藻，其中，在光照时通入CO2气体以使CO2气体占培养环境气氛体积的10％(培养环境气氛中除去CO2气体后剩余的气体为氮气)，培养环境气氛中气体的流速为0.1vvm；
3)将步骤2)所得驯化微藻以6mgdw·L-1的密度接种至废水中，在特定条件下培养，其中，在光照时通入含有CO2的废气，培养环境气氛中气体的流速为0.1vvm，废气为CO2和氮气的混合气体且废气中含有10μg·m-3Hg，废气中CO2气体所占体积为10％。
对比例2(Hg30)
烟气汞胁迫下微藻固碳和生产脂肪酸的方法，包括以下步骤：
1)将产油微藻以6mgdw·L-1的密度接种至灭菌后的培养基上，培养基为BG11培养基，于空气环境下，在特定条件下培养至对数期，得到微藻，其中，特定条件：培养基的pH为8，培养的温度为25℃，光照强度为4000Lux，光照时间为10h(每日9:00-19:00)，产油微藻为小球藻，培养过程中，每隔15天进行转接并继续在特定条件下培养；
2)将步骤1)所得微藻以6mgdw·L-1的密度接种至灭菌后的废水中，在与步骤1)中相同的特定条件下培养至对数期，得到驯化微藻，其中，在光照时通入CO2气体以使CO2气体占培养环境气氛体积的10％(培养环境气氛中除去CO2气体后剩余的气体为氮气)，培养环境气氛中气体的流速为0.1vvm；
3)将步骤2)所得驯化微藻以6mgdw·L-1的密度接种至废水中，在特定条件下培养，其中，在光照时通入含有CO2的废气，培养环境气氛中气体的流速为0.1vvm，废气为CO2和氮气的混合气体且废气中含有30μg·m-3Hg，废气中CO2气体所占体积为10％。
对实施例1～4步骤4)以及对比例1～2步骤3)所得液体进行测试，每天测试生物量获得生物量密度，最大生物量密度以及最大生物量密度时的固碳速率如图1和3所示。最大生物量密度时的脂肪酸含量和PsbA基因的表达量如图2和4所示。
如图1所示，在废气中CO2气体所占体积为10％且含10μg·m-3Hg的条件下，小球藻可以利用废水中的营养盐及CO2气体，生产生物量。分别加入0(对比例1)、1(实施例1)、2(实施例2)mg·L-1IAA时，小球藻最大生物量密度分别为991.85、1085.04和1169.57mgdw·L-1；最大生物量密度时的微藻生长速率分别为102.11、117.17和126.28(mgdw·(L·day)-1)；最大生物量密度时的固碳速率分别为177.09、203.22和219.02mgCO2·(L·day)-1；实施例1、2步骤4)以及对比例1步骤3)的废水中TN去除率分别为95.40％、95.82％和99.43％。相比于对比例1，添加1(实施例1)、2(实施例2)mg·L-1IAA时，小球藻最大生物量密度分别提高了9.40％和17.92％，最大生物量密度时的微藻生长速率分别提高了14.75％和23.67％，最大生物量密度时的固碳速率分别提高了14.76％和23.68％。
如图2所示，在废气中CO2气体所占体积为10％且含10μg·m-3Hg的条件下，实施例1和实施例2均可上调PsbA基因的表达量，实施例2可显著提高小球藻的脂肪酸含量。对比例1、实施例1和实施例2，小球藻PsbA相对表达量分别为8184.47、82477.16和904639.52，小球藻脂肪酸含量分别为23229.63、15445.81和112639.81μg·g-1。相比于对比例1，实施例1和实施例2的小球藻PsbA相对表达量分别提高了907.73％和10953.12％，实施例2小球藻脂肪酸含量提高了384.90％。
如图3所示，在废气中CO2气体所占体积为10％且含30μg·m-3Hg的条件下，小球藻可以利用废水中的营养盐及CO2气体，生产生物量。分别加入0(对比例2)、1(实施例3)、2(实施例4)mg·L-1IAA时，小球藻最大生物量密度分别为934.19、1085.04和1075.94mgdw·L-1；最大生物量密度时的微藻生长速率分别为101.62、126.60和128.78mgdw·(L·day)-1；最大生物量密度时的固碳速率分别为176.25、219.57和223.35mgCO2·(L·day)-1；实施例3、4步骤4)以及对比例2步骤3)的废水中TN去除率分别为94.29％、94.43％和96.24％。相比于对比例2，实施例3和实施例4时，小球藻最大生物量密度分别提高了16.14％和15.17％，最大生物量密度时的微藻生长速率分别提高了24.59％和26.72％，最大生物量密度时的小球藻固碳速率分别提高了24.59％和26.72％。
如图4所示，在废气中CO2气体所占体积为10％且含30μg·m-3Hg的条件下，实施例3和实施例4均可上调PsbA基因的表达量，实施例4可显著提高小球藻的脂肪酸含量。对比例2、实施例3和实施例4的小球藻PsbA相对表达量分别为6765.05、115556.68和750917.71，小球藻脂肪酸含量分别为43929.12、34040.42和72564.81μg·g-1。相比于对比例2，实施例3和实施例4的小球藻PsbA相对表达量分别提高907.73％和10953.12％，实施例4小球藻脂肪酸含量提高了65.19％。
由图2和4可知，IAA处理后的微藻，PsbA基因的表达量显著提高，由于PsbA基因是光合系统II中关键蛋白—D1蛋白合成的关键基因，因此，PsbA基因的表达量的提高增加了叶绿素D1蛋白的合成，促进光合系统II的修复，维持和促进微藻正常的光合作用，进而提高了微藻生物量和固碳速率。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种烟气汞胁迫下利用植物激素促进微藻固碳和生产脂肪酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将产油微藻以5～10mgdw·L-1的密度接种至培养基上，在特定条件下培养至对数期，得到微藻，其中，所述特定条件：pH为7.0-8.0，温度为25～30℃，光照强度为3000-6000Lux，光照时间为8-14h；
2)将步骤1)所得微藻以5～10mgdw·L-1的密度接种至灭菌后的废水中，在所述特定条件下培养至对数期，得到驯化微藻，其中，在光照时通入CO2气体以使CO2气体占培养环境气氛体积的5～20％；
3)将步骤2)所得驯化微藻以5～10mgdw·L-1的密度接种至废水中，再加入吲哚-3-乙酸，以使吲哚-3-乙酸的浓度为Z mg/L，Z＝0.1-10，在所述特定条件下培养至对数期，获得生物量，最大生物量时的Z为Y，其中，在光照时通入CO2气体以使CO2气体为培养环境气氛体积的5～20％；
4)将步骤2)所得驯化微藻以5～10mgdw·L-1的密度接种至废水中，再加入吲哚-3-乙酸，以使吲哚-3-乙酸的浓度为Y mg/L，继续在所述特定条件下培养，其中，在光照时通入含有CO2的废气。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤1)中，所述培养基为BG11培养基。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤1)中，所述产油微藻为小球藻、栅藻或螺旋藻。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步骤1)中，培养过程中，每隔10～45天进行转接并继续在所述特定条件下培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步骤1)中，所述培养于空气环境中进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述步骤2)中，所述废水为过滤后的市政废水、生活污水或啤酒废水。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述步骤3)中，培养至对数期后，通过测试获得吸光度，最大吸光度所对应的Z为Y。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在680nm波长下测试所述吸光度。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，培养环境气氛中气体的流速为0.05-0.2vvm。
10.如权利要求1所述方法获得的驯化微藻在提高脂肪酸产量、生物量密度、固碳速率、PsbA基因的表达量和/或对废水氮营养的去除率中的应用。
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|---|---|
| CN114763516B (zh) | 2024-01-30 |
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