CN110668571A - 利用人工市政污水构建藻菌共培养体系积累生物量并测定体系中吲哚乙酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用人工市政污水构建藻菌共培养体系积累生物量并测定体系中吲哚乙酸含量的方法,主要包括如下步骤:1)微藻的扩大培养;2)人工市政污水培养基的配制与灭菌处理;3)微藻和活性污泥的接种与培养;4)生物质干重的测定;5)吲哚乙酸含量的测定。微藻‑活性污泥共培养体系中的微生物能够在人工市政污水培养基中快速生长并积累生物量,其生物质干重比微藻单独培养体系提高了27%;通过乙酸乙酯多次抽提后利用高效液相色谱法对体系中的吲哚乙酸含量进行测定,测得微藻‑活性污泥共培养体系中的吲哚乙酸含量为0.035mg/L。该方法证明微藻与活性污泥中的微生物能够根据其彼此之间的协同作用而进行共生培养,为利用藻菌相互关系获取更大经济效益奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及微藻生物技术领域,具体涉及一种利用人工市政污水构建藻菌共培养体系积累生物量并测定体系中吲哚乙酸含量的方法。
背景技术
目前,市政污水的污染问题逐渐凸显[1],而通过微藻生物技术,利用富含氮磷营养盐的市政污水培养微藻,能够更好地将水质净化与生物质生产有机结合起来,在降低微藻生物技术成本的同时可以提高微藻生物质产率。
然而在实际运用过程中,大规模的无菌培养是非常困难且昂贵的,细菌的存在对于微藻产率来说是非常关键的影响因素[2]。有些微藻-细菌共生系统在处理污染物、积累生物量等方面被证明非常有效,混合体系中的物质交换能为各自的生长提供有力的条件,有利于分摊来自环境的压力,对抗多变的外部环境或外来物种的侵袭[3]。植物激素吲哚乙酸(IAA)等生长调节剂就是藻菌共培养过程中分泌的促生长因子之一[4],对微藻的生长发育起到重要作用。本专利选取市政污水为主要污染物以及营养来源,以市政污水处理厂的活性污泥为主要细菌来源,结合筛选培养的优势微藻,构建微藻-活性污泥共培养体系以积累生物量,并采用高效液相色谱法测定共培养体系中的吲哚乙酸,为合理利用藻菌相互关系获取更大经济效益奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种利用人工市政污水构建藻菌共培养体系积累生物量并测定体系中吲哚乙酸含量的方法。
本发明的技术方案如下:利用人工市政污水构建微藻-活性污泥共培养体系积累生物量并测定体系中吲哚乙酸含量的研究方法,包括如下步骤:
1)微藻的扩大培养:
(1)将栅藻Scenedesmus sp.以10%的接种体积(V藻液/V培养基)接种于装有200mL BG-11培养基的250mL锥形瓶中;
(2)在温度28℃、光强4000lux条件下下通入5%的CO2合成气体,扩大培养7-10天;
2)人工市政污水的配制与灭菌处理:
(1)由于实际市政污水受外界因素影响波动较大,现根据实际市政污水的水质参数人工配制市政污水以提高实验指标的可控性和复现性;
(2)将人工市政污水培养基在121℃条件下高压蒸汽灭菌20min,冷却后使用;
所述步骤2)中人工市政污水原始水质为:NH4 +-N、NO3 --N、PO4 3--P及COD的质量浓度分别为49.4mg/L、13.4mg/L、9.5mg/L和783mg/L。
3)微藻与活性污泥的接种与培养:
(1)取处于对数生长期生长良好的栅藻Scenedesmus sp.和市政污水厂活性污泥,构建微藻- 活性污泥共培养体系,控制栅藻Scenedesmus sp.与活性污泥的初始接种干重比为1:1,即将初始接种生物质浓度分别为15mg/L的栅藻和活性污泥接种于3个装有200mL人工市政污水培养基的250mL锥形瓶中;
(2)取处于对数生长期生长良好的栅藻Scenedesmus sp.作为对照,控制初始接种生物质浓度为30mg/L,将栅藻接种于3个装有200mL人工市政污水培养基的250mL锥形瓶中;
(3)在温度28℃、光强4000lux、全天光照的条件下对微藻-活性污泥体系培养7天,每天定时振摇3次;
4)生物质干重的测定:
(1)将孔径为0.45μm的混合纤维滤膜置于105℃烘箱中烘干至恒重(W1);
(2)培养7天后对微藻-活性污泥混合培养体系取样10mL进行真空抽滤;
5)吲哚乙酸含量的测定:
所述步骤5)测定体系中吲哚乙酸含量的具体步骤如下:
(1)通过高效液相色谱法测定并绘制吲哚乙酸的标准曲线;
(2)培养7天后取样品10mL,以5000r/min的转速离心15min后弃去沉淀,取一定量的上清液以0.22μm滤膜过滤以除去残留的细胞碎片,之后逐滴加入4N的HCl将pH调至 2-3;
(3)在上清液中加入等体积的乙酸乙酯提取液,涡旋混匀,并置于摇床中室温振荡30min,然后以5000r/min离心10min,收集有机相,以此方法重复提取3次,合并有机相;
(4)用高纯氮气将有机相合并液吹干后,用500μL甲醇溶剂溶解干燥粗提物,再次以0.22 μm滤膜过滤;
(5)利用Waters高效液相色谱仪测定吲哚乙酸IAA;
(6)色谱条件为:色谱柱:4.6mm×15cm,5μm的Agilent C-18反向柱,检测器为紫外检测器。每次进样量为20μL,流动相为甲醇:1%冰醋酸水溶液40:60(vol/vol),流速为lml/min。检测波长为280nm,出峰时间约为6min。
与现有技术相比,本发明具有的优点:
本发明将人工市政污水作为微藻-活性污泥体系的培养基质,在实现废水净化的同时积累生物质,培养7天后,藻菌体系中的生物质干重比无菌微藻单独培养体系提高了27%;
本发明利用人工市政污水构建藻菌共生体系,并进一步测定了体系中的植物激素吲哚乙酸含量,证明了微藻与活性污泥中的细菌之间可以形成共生关系,细菌分泌的植物激素能够促进微藻的生长。
附图说明
图1为培养7天后初始接种藻菌干重比分别为1:0、1:1和0:1的微藻-活性污泥共培养体系中总生物质干重的积累情况;
图2为高效液相色谱法测定吲哚乙酸的标准曲线;
图3为培养7天后初始接种藻菌干重比分别为1:0、1:1和0:1的微藻-活性污泥共培养体系中提取并测定出的吲哚乙酸含量。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步说明。本发明的实施例是为了更好地使本领域的技术人员更好地理解本发明,并不对本发明作任何限制。
本发明利用人工市政污水构建微藻-活性污泥共培养体系积累生物量并测定体系中吲哚乙酸含量的研究方法,包括如下步骤:
1)栅藻的扩大培养:
(1)将栅藻Scenedesmus sp.以10%的接种体积(V藻液/V培养基)接种于装有200mL BG-11培养基的250mL锥形瓶中;
(2)在温度28℃、光强4000lux条件下下通入5%的CO2合成气体,扩大培养7-10天;上述步骤1)中(1)所述的BG-11培养基组成如下表1所示:
表1 BG-11培养基组成成分和含量
其中微量元素(Trace elements solution)储存液配方为:H3BO3 286mg、MnCl2·4H2O 186 mg、ZnSO4·7H2O 22.2mg、CuSO4·5H2O 7.9mg、Na2MoO4·2H2O 39mg、CO(NO3)2·6H2O 4.9 mg,加蒸馏水定容至100mL。
2)人工市政污水的配制与灭菌处理:
(1)由于实际市政污水受外界因素影响波动较大,现根据实际市政污水的水质参数人工配制市政污水以提高实验指标的可控性和复现性;
(2)将人工市政污水培养基在121℃条件下高压蒸汽灭菌20min,冷却后使用;
上述步骤2)中人工市政污水组成成分和含量如表2所示:
表2 人工市政污水组成成分和含量
微量元素(Trace elements solution)储存液配方为:H3BO3 286mg、MnCl2·4H2O186mg、 ZnSO4·7H2O 22.2mg、CuSO4·5H2O 7.9mg、Na2MoO4·2H2O 39mg、CO(NO3)2·6H2O4.9mg,加蒸馏水定容至100mL。
3)微藻与活性污泥的接种与培养:
(1)取处于对数生长期生长良好的栅藻Scenedesmus sp.和市政污水厂活性污泥,构建微藻 -活性污泥共培养体系,控制栅藻Scenedesmus sp.与活性污泥的初始接种干重比为1:1,即将初始接种生物质浓度分别为15mg/L的栅藻和活性污泥接种于3个装有200mL人工市政污水培养基的250mL锥形瓶中;
(2)取处于对数生长期生长良好的栅藻Scenedesmus sp.作为对照,控制初始接种生物质浓度为30mg/L,将栅藻接种于3个装有200mL人工市政污水培养基的250mL锥形瓶中;
(3)在温度28℃、光强4000lux、全天光照的条件下对微藻-活性污泥体系培养7天,每天定时振摇3次;
4)生物质干重的测定:
(1)将孔径为0.45μm的混合纤维滤膜置于105℃烘箱中烘干至恒重(W1);
(2)培养7天后,分别对微藻-活性污泥初始接种藻菌干重比为1:0、1:1以及0:1的样品取样10mL进行真空抽滤,每组样品设置三个平行,具体详见表3为实施例1至3中3个样品工艺条件;;
(3)再次将抽滤后的滤膜烘干至恒重并计为W2,并以滤膜抽滤去离子水的重量差(W0)作为空白,以扣除环境因素对测量过程造成的误差,并计算生物质浓度(mg/L):
表3 实施例1至3工艺参数
如图1所示为利用人工市政污水构建微藻-活性污泥共培养体系所获得的生物质积累情况,可以看出当藻菌比例为1:1时,生物量的积累更具有优势,培养至第7天时藻菌共培养体系获得的总生物质浓度达到810mg/L,比无菌微藻单独培养体系提高了27%。
5)吲哚乙酸标准曲线的绘制:
(1)首先精确称取吲哚乙酸对照品10mg,用甲醇定容至100mL,配制浓度为100μg/mL 的吲哚乙酸标准溶液;
(2)准确移取0、0.1、0.2、0.5、0.7、1.0mL吲哚乙酸标准溶液于100mL容量瓶中,加入乙醇定容至刻度,利用液相色谱法进行测定,绘制峰面积与吲哚乙酸含量的标准曲线;
6)吲哚乙酸含量的测定:
(1)培养7天后分别对微藻-活性污泥初始接种藻菌干重比为1:0、1:1以及0:1的样品取样10mL,每组样品设置三个平行,具体详见表4为实施例4至6中3个样品工艺条件。接下来以5000r/min的转速离心15min后弃去沉淀,取一定量的上清液以0.22μm滤膜过滤以除去残留的细胞碎片,之后逐滴加入4N的HCl将pH调至2-3;
(2)在上清液中加入等体积的乙酸乙酯提取液,涡旋混匀,并置于摇床中室温振荡30min,然后以5000r/min离心10min,收集有机相,以此方法重复提取3次,合并有机相;
(3)用高纯氮气将有机相合并液吹干后,用500μL甲醇溶剂溶解干燥粗提物,再次以0.22 μm滤膜过滤;
(4)利用Waters高效液相色谱仪测定吲哚乙酸IAA;
(5)色谱条件为:色谱柱:4.6mm×15cm,5μm的Agilent C-18反向柱,检测器为紫外检测器。每次进样量为20μL,流动相为甲醇:1%冰醋酸水溶液40:60(vol/vol),流速为lml/min。检测波长为280nm,出峰时间约为6min。
表4 实施例4至6工艺参数
如图3所示为利用人工市政污水构建微藻-活性污泥共培养体系培养微生物7天后,所测得体系中的吲哚乙酸含量。可以看出控制初始藻菌接种比例为1:1时,体系中检测到的吲哚乙酸含量最高,是纯藻无菌体系的2.16倍,相应地,吲哚乙酸的存在也有利于微藻与细菌之间共生关系的形成,促进了生物质的积累。本发明将人工市政污水作为构建微藻-活性污泥共生体系的培养基质,在实现废水净化的同时促进了生物质的积累,并进一步测定了体系中的吲哚乙酸含量,该方法证明微藻与活性污泥能够根据其彼此之间的协同作用而进行共生培养,为合理利用藻菌相互关系获取更大经济效益奠定了基础。
应当理解的是,这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明,对本领域技术人员来说,可以加以改进或变换,而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
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Claims (3)
1.利用人工市政污水构建藻菌共培养体系积累生物量并测定体系中吲哚乙酸含量的方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
1)微藻的扩大培养:
(1)将栅藻Scenedesmus sp.以10%的接种体积(V藻液/V培养基)接种于装有200mL BG-11培养基的250mL锥形瓶中;
(2)在温度28℃、光强4000lux条件下下通入5%的CO2合成气体,扩大培养7-10天;
2)人工市政污水的配制与灭菌处理:
(1)由于实际市政污水受外界因素影响波动较大,现根据实际市政污水的水质参数人工配制市政污水以提高实验指标的可控性和复现性;
(2)将人工市政污水培养基在121℃条件下高压蒸汽灭菌20min,冷却后使用;
3)微藻与活性污泥的接种与培养:
(1)取处于对数生长期生长良好的栅藻Scenedesmus sp.和市政污水厂活性污泥,构建微藻-活性污泥共培养体系,控制栅藻Scenedesmus sp.与活性污泥的初始接种干重比为1:1,即将初始接种生物质浓度分别为15mg/L的栅藻和活性污泥接种于3个装有200mL人工市政污水培养基的250mL锥形瓶中;
(2)取处于对数生长期生长良好的无菌栅藻Scenedesmus sp.作为对照,控制初始接种生物质浓度为30mg/L,将栅藻分别接种于3个装有200mL人工市政污水培养基的250mL锥形瓶中;
(3)在温度28℃、光强4000lux、全天光照的条件下对微藻-活性污泥体系培养7天,每天定时振摇3次;
4)生物质干重的测定:
(1)将孔径为0.45μm的混合纤维滤膜置于105℃烘箱中烘干至恒重(W1);
(2)培养7天后对微藻-活性污泥混合培养体系取样10mL进行真空抽滤;
5)吲哚乙酸含量的测定。
2.根据权利要求1所述的利用人工市政污水构建藻菌共培养体系积累生物量并测定体系中吲哚乙酸含量的方法,其特征在于,所述步骤2)中人工市政污水原始水质为:NH4 +-N、NO3 --N、PO4 3--P及COD的质量浓度分别为49.4mg/L、13.4mg/L、9.5mg/L和783mg/L。
3.根据权利要求1所述的利用人工市政污水构建藻菌共培养体系积累生物量并测定体系中吲哚乙酸含量的方法,其特征在于,所述步骤5)测定体系中吲哚乙酸含量的具体步骤如下:
(1)通过高效液相色谱法测定并绘制吲哚乙酸的标准曲线;
(2)培养7天后取样品10mL,以5000r/min的转速离心15min后弃去沉淀,取一定量的上清液以0.22μm滤膜过滤以除去残留的细胞碎片,之后逐滴加入4N的HCl将pH调至2-3;
(3)在上清液中加入等体积的乙酸乙酯提取液,涡旋混匀,并置于摇床中室温振荡30min,然后以5000r/min离心10min,收集有机相,以此方法重复提取3次,合并有机相;
(4)用高纯氮气将有机相合并液吹干后,用500μL甲醇溶剂溶解干燥粗提物,再次以0.22μm滤膜过滤;
(5)利用Waters高效液相色谱仪测定吲哚乙酸IAA;
(6)色谱条件为:色谱柱:4.6mm×15cm,5μm的Agilent C-18反向柱,检测器为紫外检测器。每次进样量为20μL,流动相为甲醇:1%冰醋酸水溶液40:60(vol/vol),流速为lml/min。检测波长为280nm,出峰时间约为6min。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN113481141A (zh) * | 2021-08-04 | 2021-10-08 | 华东理工大学 | 一种利用污泥提取液耦合co2定向培养富集高价值微藻生物质的方法及定向培养微藻装置 |
CN113481141B (zh) * | 2021-08-04 | 2024-02-13 | 华东理工大学 | 一种利用污泥提取液耦合co2定向培养富集高价值微藻生物质的方法及定向培养微藻装置 |
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