CN107988082A - 一种藻菌共生系统培养基的优化方法及其培养基 - Google Patents
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Abstract
一种藻菌共生系统培养基的优化方法，包括以下步骤：S1构建藻菌共生体系，确定最优菌藻比例；S2确定培养基中影响藻菌共生体系营养成分产量的主要影响因子；S3确定菌藻共生系统的优化培养基：建立等高线和响应曲面，并分别求解获得生物量、总蛋白和总脂的最佳培养基；S1包括步骤：S1.1确定藻种和菌种；S1.2配置驯化BG11培养基；S1.3培养不同比例的菌藻共生体；S1.4分析比对不同比例的藻菌共生体产出的生物量、总脂、总蛋白含量和脂肪酸种类，筛选出最优菌藻比例；S2包括步骤：S2.1确定不同配比的培养基；S2.2向不同配比的培养基中接入菌藻(最优菌藻比例)进行培养，并通过分析藻菌共生体的生物量、总脂含量、总蛋白含量、脂肪酸种类来确定主要影响因子。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种藻菌共生体培养基的优化方法及其培养基。
背景技术
藻菌共生体系中能产生高附加值的产物，这些都是高价值的营养成分和化工原料。并且目前涉猎此类该方面的研究都是针对单一微藻中的某一成分，如生物量或是脂类或是蛋白质，因此探求藻菌共生体在此方向上有着广阔的应用前景。
虽然目前微藻的培养技术已经趋于成熟，但是微藻的培养技术并不能完全复制在藻菌共生系统中，由于培养技术不成熟导致的生产成本高，效率低是限制藻菌共生体培养的主要因素，降低藻菌共生体培养成本的途径有两种，一是降低培养基原料材料的成本，二是提高各个营养组分的产量，因此能找出对应藻菌共生体系中不同的营养成分的不同培养基的最佳配比，是很有必要的。
发明内容
本发明的目的是针对现有的技术存在上述问题，提出了一种藻菌共生系统培养基的优化方法及其培养基，用于提高藻菌共生培养时各个营养组分的产量，降低藻菌共生体的培养成本。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种藻菌共生系统培养基的优化方法，包括以下步骤：
S1构建藻菌共生体系，确定最优菌藻比例：S1.1确定藻种和菌种：提供小球藻和赤芝菌株；S1.2配置驯化BG11培养基：BG11培养基、2％麦芽糖和0.5％酵母膏，pH5；S1.3培养不同比例的菌藻共生体：将小球藻和驯化好的赤芝菌按照不同比例接入到驯化BG11培养基中进行培养；S1.4分析比对不同比例的藻菌共生体产出的生物量、总脂、总蛋白含量和脂肪酸种类，筛选出最优菌藻比例；
S2确定培养基中影响藻菌共生体系营养成分产量的主要影响因子：S2.1确定不同配比的培养基；S2.2向不同配比的培养基中接入菌藻(最优菌藻比例)进行培养，并通过分析藻菌共生体的生物量、总脂含量、总蛋白含量、脂肪酸种类来确定主要影响因子；
S3确定菌藻共生系统的优化培养基：S3.1根据主要影响因子设计不同配比的培养基，并获得在不同配比培养基下的菌藻共生体的生物量、总脂含量、总蛋白含量；S3.2建立等高线和响应曲面，确定影响菌藻共生系统生物量的因素交互作用，获得生物量模型方程，并求解得到藻菌共生系统获得生物量的最佳培养基；S3.3建立等高线和响应曲面，确定影响菌藻共生系统总蛋白含量的因素交互作用，获得总蛋白模型方程，并求解得到藻菌共生系统获得总蛋白的最佳培养基；S3.4建立等高线和响应曲面，确定影响菌藻共生系统总脂含量的因素交互作用，获得总脂模型方程，并求解得到藻菌共生系统获得总脂的最佳培养基。
一种用于藻菌共生系统的优化培养基，其配方包括：酵母膏：5.688g/L-6.748g/L，NaNO3：1.703g/L-1.977g/L，K2HPO4：0.047g/L-0.052g/L。
与现有技术相比，本发明具有的优势是：通过本发明进行优化得到的培养基能够提高藻菌共生培养时各个营养组分的产量，降低藻菌共生体的培养成本，其中赤芝菌、小球藻在接种比例为1:20时藻菌球易于结合，并且数量上较多，成球率较好，继续培养可以得到颗粒较大的藻菌球；从营养物质的检验上来看，藻菌共生体中总脂含量、总蛋白含量高于单一的微藻，从脂肪酸丰富的程度上来看，藻菌共生体中会包含更多的不同种类的脂肪酸，藻菌共生体的优势很明显。
附图说明
图1至图6是本发明第一阶段中藻菌共生组GC谱图。
图7至图11是本发明第一阶段中单一微藻组GC谱图。
图12至图14是本发明第一阶段中藻菌共生组MS谱图。
图15和16是本发明第一阶段中单一微藻组MS谱图。
图17至图28是本发明第二阶段中PB实验GC谱图。
图29至图31是本发明第二阶段中PB实验MS谱图。
图32和图33是本发明第三阶段中K2HPO4与酵母膏对生物量提取影响的等高线和响应曲面。
图34和图35是本发明第三阶段中NaNO3与酵母膏对生物量提取影响的等高线和响应曲面。
图36和图37是本发明第三阶段中NaNO3与K2HPO4对生物量提取影响的等高线和响应曲面。
图38和图39是本发明第三阶段中NaNO3与K2HPO4对总蛋白含量提取影响的等高线和响应曲面。
图40和图41是本发明第三阶段中酵母膏与NaNO3对总蛋白含量提取影响的等高线和响应曲面。
图42和图43是本发明第三阶段中酵母膏与K2HPO4对总蛋白含量提取影响的等高线和响应曲面。
图44和图45是本发明第三阶段中酵母膏与K2HPO4对总脂含量提取影响的等高线和响应曲面。
图46和图47是本发明第三阶段中酵母膏与NaNO3对总脂含量提取影响的等高线和响应曲面。
图48和图49是本发明第三阶段中NaNO3与K2HPO4对总脂含量提取影响的等高线和响应曲面。
图50至图53是本发明在第三阶段中的BBD实验GC谱图。
图54至图58是本发明在第三阶段中的BBD实验MS谱图。
图59是本发明的藻菌共生系统培养基的优化方法的流程示意图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
本发明提供一种藻菌共生系统培养基的优化方法，该优化方法包括构建菌藻共生体系、PB实验和BBD实验三个阶段，三个阶段所用的藻种、菌种以及测定方法为：
生物量的测定方法：将三角锥形瓶中的藻菌共生体液直接加入到50mL离心管中，在4000r/min的条件下离心8min—10min，弃上清液，之后用蒸馏水洗涤再离心，重复两次；然后放入80℃干燥箱中烘至恒重后称取干重量，称取三次取平均值，以获得藻菌共生体生物量。
总脂的提取方法：取0.1g藻菌共生体干粉研磨后加入无水乙醚和石油醚的混合溶剂(无水乙醚和石油醚的体积比为1：2)，水浴超声振荡10min，在20℃环境下抽提4h(适当振荡混匀)，抽提结束后加入质量分数为10％NaOH沉淀细胞，然后在4000r/min的条件下离心15min取上层清液，再放入60℃水浴锅中迅速蒸去多余的溶剂至溶液恒重；在蒸去多余的溶剂的溶液中加入等体积的饱和NaOH-甲醇溶液(0.4mol/L，加热使NaOH完全溶解)皂化过夜，为避免高温氧化，置于4℃冷藏室中进行；然后用HCl稀溶液(浓盐酸与去离子水以9:1体积比稀释)调节pH值至1-2，再加入少量去离子水离心分离取上层油层；最后放入在40℃烘箱中蒸去多余的溶剂至油液恒重，以获得藻菌共生体总脂。
总蛋白含量的测定方法：将考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95％乙醇中，加入100mL 85％磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL制得考马斯亮蓝试剂备用；取剩余藻菌共生体干粉研磨加入4mL0.15mol/L NaCl，水浴超声10min，在8000r/min的条件下离心10min取上层清液；取1mL藻菌可溶性蛋白液加入5mL考马斯亮蓝试剂混匀，在25℃下保温10min，静置5min，于波长595nm下测定其吸光度值。
脂肪酸种类的检测方法：采用毛细管气相色谱-质谱联用法(GC-MS)进行检测，色谱条件：100m×0.25mm×0.20um毛细管柱，载气为氦气，流速为0.5mL·min＾-1,压力280kPa。喷嘴和检测器都设为260℃，分流比为30:1，进样量1μL，升温程序为柱温140℃，保持5min，以4℃·min＾-1升至240℃，保持20min。
第一阶段：构建菌藻共生体系，确定最佳菌藻比例
1、提供藻种和菌种：小球藻(FACHB-8)和赤芝(Ganoderma lucidum)菌株都购于中国科学院武汉水生生物研究所；
2、配置驯化BG11培养基：小球藻、赤芝藻菌共生体系构建培养在驯化BG11培养基中，驯化BG11培养基：BG11培养基、2％麦芽糖和0.5％酵母膏，pH5，其中BG11培养基配方如表1-1所列：
表1-1 BG11(Blue-Green Medium)
上述A5配方如表1-2所列：
表1-2 A5(Trace mental solution)
3、菌藻共生培养的具体步骤如下：
小球藻光照培养：将装有小球藻藻液的试管摇匀，在无菌操作下直接转入玻璃三角锥形瓶(20ml-50ml)内，封好瓶口在光照培养箱内培养，培养温度为25℃，光照条件2000Lux，时间设置12Hr昼/12Hr夜。
小球藻扩大培养：取5-10ml藻液加入10-20ml新鲜培养基进行活化，在无菌的三角锥形瓶内培养15天左右，至藻种生长状态好，进行扩大培养，转接比例1:5(藻液：培养基)，培养时每日摇动三角锥形瓶2次。
藻菌共生培养：将足够浓度的小球藻和驯化好的赤芝菌共同在驯化的BG11培养基中培养，并且每天将其放入恒温摇床中培养2h，恒温摇床转速为160r/min，温度为26℃。
藻菌共生光照培养：将其放入光照培养箱内继续培养，主要观察藻菌球是否能形成以及形成状态。
4、利用已知小球藻生长曲线y＝20.918x+1.6156，将浓缩后的小球藻(7.53×10＾8spores/L)与赤芝菌(1×10＾5spores/L)按不同比例接入驯化BG11培养基中培养，并分析比对不同比例的藻菌共生体产出的生物量、总脂、总蛋白含量和脂肪酸种类，筛选出最优菌藻比例。此外为比较藻菌共生体系与单一微藻间营养物质的差异，同时设置单一微藻的对照组，并对每一组的单一微藻组的生物量、总脂、总蛋白含量、脂肪酸种类进行分析。
小球藻与赤芝菌共生组接种比例和实验结果(生物量、总脂、总蛋白含量分析)如表1-3所示，其中菌藻比例1:1为菌液1mL，藻液14μL。
表1-3 藻菌共生组
从藻菌共生组在培养过程中观察菌藻比例超过1:20后藻菌球比较难成形。藻类在培养基中比例过大，易导致赤芝菌无法生长、培养时间越长也越容易造成藻类因繁殖过快空间不足营养不够而快速死亡。菌藻比例小于1:10，因藻菌浓度太低也不易于两者结合或是藻菌结合的较为松散不易成球。培养过程中菌藻比例在1:10、1:20时藻菌球长势较好，从实验数据上来看菌藻比例为1:20在生物量、总脂含量、总蛋白含量上都要好于1:10。
小球藻接种比例和实验结果(生物量、总脂、总蛋白含量分析)如表1-4所示：
表1-4 单一微藻组
通过藻菌共生组与单一微藻组进行比较，除了在生物量上单一微藻量稍大于藻菌共生系统，其余两项总脂含量、总蛋白含量都是少于藻菌共生体系，从实验结果上可以看出藻菌共生体系总体比单一微藻效果要好，说明藻菌共生体系确是存在着一定的优势。因此本实验采用菌藻比例为1:20的共生体系作为最佳体系进入Plackett-Burman(PB)实验。
脂肪酸种类检测分析
藻菌共生组通过气相色谱质谱联用仪分析具有明显的特征峰，峰值也都较大，从出峰的数量上来看菌藻比例达到1:50及以上时出峰数量开始减少，菌藻比例在1:1、1:10、1:20时出峰数较多。从峰值大小上来看藻菌比例达到1:50及以上时峰值减小，菌藻比例1:1、1:10、1:20峰值较大。藻菌共生组GC谱图结果如图1～6所示，从图1至图6依次为藻菌共生组1—组6。
单一微藻组只接种不同比例的藻液不接种赤芝菌液，通过气相色谱质谱联用仪分析对比于藻菌共生组，单一微藻组出峰数量上是总体少于藻菌共生组的，峰值大小都相对较小，因此藻菌共生体系在脂肪酸含量与种类上是存在着较大优势的。单一微藻组GC谱图结果如图7～11所示，从图7至图11依次为单一微藻组1—组5。
脂肪酸种类对比
藻菌共生组主要出峰时间分别为15min、19min、45min，这三个时间段主要的脂肪酸有9-Hexadecenoic acid，(Z)-(C16H30O2)；6,9-Octadecadienoic acid(C18H32O2)；Docosanoic acid(C22H44O2)；9,12-Octadecadienoic(Z，Z)-(C18H32O2)。这四种脂肪酸在每一个藻菌共生体样品中都又出现，还有一种脂肪酸1-Octadecene(C18H36)在菌藻比1:10和1:20中有检出。三个时间段的代表谱图如图12～14所示。
单一微藻组主要出峰时间分别为15min、45min，这两个时间段主要的脂肪酸有6,9-Octadecadienoic acid(C18H32O2)；9,12-Octadecadienoic(Z，Z)-(C18H32O2)。两个时间段的代表谱图依次如图15和16所示。
由此可得，藻菌在生长过程中能够发挥协同作用，且适当比例的藻菌共生系统能发挥出更大的价值，不仅是脂肪酸形成较单一微藻容易，种类也更为丰富。
第二阶段：Plackett-Burman(PB)实验，确定培养基中影响藻菌共生体营养组分产量的主要影响因子
1.通过Design Expert软件分析确定PB实验培养基配方如表2-1所示，一共12组，其中-1为原始培养条件，1为原始培养条件的1.5倍。
表2-1 PB实验培养基
2.向不同配比的培养基中接种入菌藻(最优菌藻比例)进行培养，并通过菌藻共生体的营养组分的产量来确定影响营养成分产量的主要影响因子。
在本发明的第一阶段中从生物量、总脂含量、总蛋白含量以及脂肪酸种类的丰富程度在不同比例藻菌共生体培养中筛选出了最佳菌藻比例1:20，因驯化BG11培养基中成分较多影响因子也较为复杂，所以在确定菌藻比例后通过软件Design Expert筛选试验设计的方法(PB实验)筛选出实验组数，最终筛选出12组不同配比的培养基，接种入菌藻(1:20)进行培养，来确定影响藻菌共生体生物量、总脂含量、总蛋白含量、脂肪酸种类的主要影响因子。生物量、总脂、总蛋白含量分析如下表所示：
表2-2 PB实验结果
表2-3生物量
从表2-3中可以得出在藻菌共生体生物量大小受酵母膏、K2HPO4的影响较大，两者对实验的贡献值较为明显，贡献值达到了20％左右，因此酵母膏、K2HPO4是影响藻菌共生体中生物量大小的主要影响因子。
表2-4总脂
从表2-4中可以得出在藻菌共生体总脂含量大小受酵母膏、NaNO3的影响较大，两者对实验的贡献值较为明显，贡献值也达到了20％左右，因此酵母膏、NaNO3是影响藻菌共生体中总脂含量大小的主要影响因子。
表2-5总蛋白
从表2-5中可以得出在藻菌共生体总蛋白含量大小受酵母膏、K2HPO4的影响较大，两者对实验的贡献值较为明显，酵母膏贡献值达到了38.17％，K2HPO4贡献值为10.83％。因此酵母膏、K2HPO4是影响藻菌共生体中总蛋白含量大小的主要影响因子。
通过对藻菌共生体中的生物量、总脂、总蛋白含量三者的分析中可以得出酵母膏、K2HPO4、NaNO3这三个因子是影响藻菌共生体中营养成分的主要因素。
脂肪酸种类检测分析
本阶段的PB实验通过气相色谱质谱联用仪分析藻菌共生体中脂肪酸，分析谱图如下图17～28所示，其中A-L依次为PB实验组1—组12，因各样品出峰值都较大，所以将纵坐标值范围设的加大，谱图出峰时间各组都较为稳定，集中在15min，19min，45min这三个时间段。其中F、G、I、J组出峰较为明显，峰值也较大。
PB实验主要出峰时间分别为15min、19min、45min，这三个时间段主要的脂肪酸有9-Hexadecenoic acid，(Z)-(C16H30O2)；6,9-Octadecadienoic acid(C18H32O2)；Docosanoic acid(C22H44O2)；9,12-Octadecadienoic(Z，Z)-(C18H32O2)。这四种脂肪酸在组2、组4、组6、组7、组8、组9、组10、组11中都有检出。三个时间段的代表谱图如图29～31所示。
第三阶段：(Box-Behnken)BBD实验阶段，建立等高线和响应曲面，确定培养基最优组合
1.通过Design Expert软件分析确定BBD实验培养基配方如表3-1所示，一共17组，其中其中-1为原始培养条件，1为原始培养条件的1.5倍，0为平均培养条件。
表3-1 BBD实验培养基
在第二阶段中通过PB实验筛选出驯化BG11培养基中影响藻菌共生系统的主要因子，三个主要影响因子分别为酵母膏、NaNO3、K2HPO4，本阶段通过软件Design Expert设计响应曲面法(BBD)进行试验，共17个实验组，设计实验结果如下表3-2所示。
表3-2 BBD实验
2、确定影响生物量的因素交互作用及模型求解
利用Design Expert软件对藻菌共生体生物量实验数据进行分析，建立等高线和响应曲面，结果如图32～37。图中A为酵母膏，B为NaNO3，C为K2HPO4。虽然从数据图中得出各因素两两之间的交互作用对响应值的影响都不是很显著，但相比较而言，从这几张图可以看出，酵母膏与K2HPO4的交互作用比酵母膏与NaNO3的交互作用和NaNO3与K2HPO4的交互作用对响应值的影响要来的显著。具体表现为其曲面较陡。
模型方程：生物量＝333.263+49.479×A-116.829×B+100.5745×C+4.2264×A×B+3.84×A×C+0.5732×B×C-12.25536×A＾2+3.16296×B＾2-5.31024×C＾2
通过求导得出藻菌共生系统获得生物量的最佳培养基，酵母膏：6.239g/L，NaNO3：1.977g/L，K2HPO4：0.050g/L。
3、确定影响总蛋白的因素交互作用及模型求解
利用Design Expert软件对藻菌共生体总蛋白含量实验数据进行分析，建立等高线和响应曲面，结果如图38～43图中A为酵母膏，B为NaNO3，C为K2HPO4。虽然从数据图中得出各因素两两之间的交互作用对响应值的影响都不是很显著，但相比较而言，从这几张图可以看出，酵母膏与K2HPO4的交互作用比酵母膏与NaNO3的交互作用和NaNO3与K2HPO4的交互作用对响应值的影响要来的显著。具体表现为其曲面较陡。
模型方程：总蛋白＝-595.05037+304.31265×A-8.60687×B-34.27686×C-8.94012×A×B-6.95319×A×C+1.12866×B×C-7.34422×A＾2+2.11074×B＾2+2.65940×C＾2
通过求导得出藻菌共生系统获得总蛋白的最佳培养基，酵母膏：6.748g/L，NaNO3：1.931g/L，K2HPO4：0.052g/L。
4、确定影响总脂的因素交互作用及模型求解
利用Design Expert软件对藻菌共生体总脂含量实验数据进行分析，建立等高线和响应曲面，结果如图44～49。图中A为酵母膏，B为NaNO3，C为K2HPO4。虽然从数据图中得出各因素两两之间的交互作用对响应值的影响都不是很显著，但相比较而言，从这几张图可以看出，酵母膏与NaNO3的交互作用比酵母膏与K2HPO4的交互作用和NaNO3与K2HPO4的交互作用对响应值的影响要来的显著。具体表现为其曲面较陡。
模型方程：总脂＝-0.025438-0.07763×A+0.090675×B-6.18×10-3×C-0.016648×A×B-6.304×10-3×A×C-1.608×10-3×B×C+0.029928×A＾2+1.01×10-3×B＾2+2.566×10-3×C＾2
通过求导得出藻菌共生系统获得总脂的最佳培养基，酵母膏：5.688g/L，NaNO3：1.703g/L，K2HPO4：0.047g/L。
5、验证试验
将优化后的培养基对藻菌共生体进行培养，通过气相色谱质谱联用仪分析。优化后的培养基，集中在在5min、10min、15min、19min、45min五个时间段出峰，且出峰值都较大，出峰条带也明显增多代表图谱如图50～53所示。在这五个时间段内主要的脂肪酸种类有9-Hexadecenoic acid，(Z)-；6,9-Octadecadienoic acid；Docosanoic acid；Hexadecanoicacid；1-heptadecene；9,12-Octadecadienoic(Z，Z)-；1-Octadecene七种，代表图谱如图54～58所示。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (7)
1.一种藻菌共生系统培养基的优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1构建藻菌共生体系，确定最优菌藻比例：
S1.1确定藻种和菌种：提供小球藻和赤芝菌株；
S1.2配置驯化BG11培养基：BG11培养基、2％麦芽糖和0.5％酵母膏，pH5；
S1.3培养不同比例的菌藻共生体：将小球藻和驯化好的赤芝菌按照不同比例接入到驯化BG11培养基中进行培养；
S1.4分析比对不同比例的藻菌共生体产出的生物量、总脂、总蛋白含量和脂肪酸种类，筛选出最优菌藻比例；
S2确定培养基中影响藻菌共生体系营养成分产量的主要影响因子：
S2.1确定不同配比的培养基；
S2.2向不同配比的培养基中接入菌藻(最优菌藻比例)进行培养，并通过分析藻菌共生体的生物量、总脂含量、总蛋白含量、脂肪酸种类来确定主要影响因子；
S3确定菌藻共生系统的优化培养基：
S3.1根据主要影响因子设计不同配比的培养基，并获得在不同配比培养基下的菌藻共生体的生物量、总脂含量、总蛋白含量；
S3.2建立等高线和响应曲面，确定影响菌藻共生系统生物量的因素交互作用，获得生物量模型方程，并求解得到藻菌共生系统获得生物量的最佳培养基；
S3.3建立等高线和响应曲面，确定影响菌藻共生系统总蛋白含量的因素交互作用，获得总蛋白模型方程，并求解得到藻菌共生系统获得总蛋白的最佳培养基；
S3.4建立等高线和响应曲面，确定影响菌藻共生系统总脂含量的因素交互作用，获得总脂模型方程，并求解得到藻菌共生系统获得总脂的最佳培养基。
2.根据权利要求1所述的藻菌共生系统培养基的优化方法，其特征在于，藻菌共生体培养包括步骤：
S1.3.1小球藻光照培养：将装有小球藻藻液的试管摇匀，在无菌操作下直接转入玻璃三角锥形瓶内，封好瓶口在光照培养箱内培养，培养温度为25℃，光照条件2000Lux，时间设置12Hr昼/12Hr夜；
S1.3.2小球藻扩大培养：取5-10ml藻液加入10-20ml新鲜培养基进行活化，在无菌的三角锥形瓶内培养15天左右，至藻种生长状态好，进行扩大培养，转接比例1:5(藻液：培养基)，培养时每日摇动三角锥形瓶2次；
S1.3.3藻菌共生培养：将足够浓度的小球藻和驯化好的赤芝菌共同在驯化的BG11培养基中培养，并且每天将其放入恒温摇床中培养2h，恒温摇床转速为160r/min，温度为26℃；
S1.3.4藻菌共生光照培养：将其放入光照培养箱内继续培养，观察藻菌球是否能形成以及形成状态。
3.根据权利要求1所述的藻菌共生系统培养基的优化方法，其特征在于，生物量的测定方法：将三角锥形瓶中的藻菌共生体液加入到50mL离心管中，在4000r/min的条件下离心8min—10min，弃上清液，之后用蒸馏水洗涤再离心，重复两次；然后放入80℃干燥箱中烘至恒重后称取干重量，称取三次取平均值，以获得藻菌共生体生物量。
4.根据权利要求1所述的藻菌共生系统培养基的优化方法，其特征在于，总脂的提取方法：取0.1g藻菌共生体干粉研磨后加入无水乙醚和石油醚的混合溶剂，水浴超声振荡10min，在20℃环境下抽提4h，抽提结束后加入质量分数为10％NaOH沉淀细胞，然后在4000r/min的条件下离心15min取上层清液，再放入60℃水浴锅中迅速蒸去多余的溶剂至溶液恒重；在蒸去多余的溶剂的溶液中加入等体积的饱和NaOH-甲醇溶液皂化过夜，置于4℃冷藏室中进行；然后用HCl稀溶液调节pH值至1-2，再加入少量去离子水离心分离取上层油层；最后放入在40℃烘箱中蒸去多余的溶剂至油液恒重，以获得藻菌共生体总脂。
5.根据权利要求1所述的藻菌共生系统培养基的优化方法，其特征在于，总蛋白含量的测定方法：取剩余藻菌共生体干粉研磨加入4mL 0.15mol/L NaCl，水浴超声10min，在8000r/min的条件下离心10min取上层清液；取1mL藻菌可溶性蛋白液加入5mL考马斯亮蓝试剂混匀，在25℃下保温10min，静置5min，于波长595nm下测定其吸光度值。
6.根据权利要求1所述的藻菌共生系统培养基的优化方法，其特征在于，脂肪酸种类的检测方法：采用毛细管气相色谱-质谱联用法(GC-MS)，色谱条件：100m×0.25mm×0.20um毛细管柱，载气为氦气，流速为0.5mL·min＾-1,压力280kPa；喷嘴和检测器都设为260℃，分流比为30:1，进样量1μL，升温程序为柱温140℃，保持5min，以4℃·min＾-1升至240℃，保持20min。
7.一种用于藻菌共生系统的优化培养基，其特征在于，该优化培养基的配方包括酵母膏：5.688g/L-6.748g/L，NaNO3：1.703g/L-1.977g/L，K2HPO4：0.047g/L-0.052g/L。
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