CN106544301B - 一株耐高温降解原油产乳化剂的地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株耐高温降解原油产乳化剂的地衣芽孢杆菌及其应用。具体的，本发明涉及保藏编号为CGMCC No.13054的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)以及含有该菌的地衣芽孢杆菌制剂。本发明还涉及所述的地衣芽孢杆菌或其制剂在发酵培养生产生物乳化剂中的应用，在降解原油及驱油中的应用，以及在乳化油品中的应用。本发明的地衣芽孢杆菌能够以原油为碳源和能源生长，并合成生物乳化剂；该菌株及其代谢产物能够有效降解原油中饱和分组分和芳香分组分含量；该菌产生的生物乳化剂具有优异的耐高温性能、很强的乳化能力；该菌株及其产生的生物乳化剂可用于微生物采油，提高采油率。

Description

一株耐高温降解原油产乳化剂的地衣芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于能源生物技术和环境生物技术领域，具体地说，本发明是关于一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)及其应用，该菌株能够代谢生成生物乳化剂，该菌株及其产生的生物乳化剂可用于微生物采油，具有耐高温、耐盐的优点，可有效降解原油、提高采油率。

背景技术

生物技术已经被越来越多的应用于石油开采领域，微生物采油技术就是其中之一。微生物提高原油采收率(Microbial Enhanced Oil Recovery，MEOR)技术能够进一步提高原油采收率，延长油田开发寿命，具有广阔的应用前景。该技术与其它采油技术相比，具有成本低、适用范围广、生物活性稳定、有效作用时间长、环境友好等优点。微生物采油技术是借助微生物菌体本身及其相关代谢产物改变油藏三相界面性质、油藏渗透率等因素来提升采收率。同时原油开采的过程中还要受到油藏的地质条件和油藏化学条件的影响，例如：渗透率、孔隙率、温度、压力、pH值、氧含量与矿化度等。

油田进行长时间的二次采油后，油藏中剩余原油呈现出不连续分布的状态，并且它们主要存在于岩层的孔隙中。这种情况下继续进行二次采油其采出液中的含水比例很高，为保持采收率需要借助其他的理化方法。这种在二次采油技术基础上辅助以其他技术发展起来的采油技术称为三次采油技术。三次采油技术的应用方法主要分为四类：化学驱替、气体驱替、热力驱替和微生物驱替。

三次采油技术中的微生物驱替技术利用的是微生物及其生命代谢活动来提高原油采收率。相比较化学驱替而言，其采出液中含有的化学污染物较少，并且具有可生化降解的特性，对周边环境的污染能够降到最低；而且微生物驱油的投入也相对较少，在进行驱油的过程中只需要投加一定量的菌液以及定期补充营养液即可；再则微生物具有极强的适应能力，在高温、高矿化度的油井中依然能够充分发挥其效能提高采收率。

微生物在驱油过程中产生的代谢产物包括脂肽类的表面活性剂以及糖脂、糖蛋白类的生物乳化剂，微生物可以利用它们在驱替液剪切力的作用下乳化原油降低界面张力提高采收率。生物乳化剂是表面活性物质的一种，它由微生物代谢产生，结构特点是同时具有疏水部分和亲水部分。相比较化学乳化剂，生物乳化剂在构成上更为复杂，可借助不同种类的物质表现出了不同的活性。生物乳化剂具体可由糖类、蛋白质及脂肽类物质构成。相比组成结构简单的化学乳化剂，生物乳化剂易受多种环境因素的影响例如温度、矿化度和pH值等。

油藏温度升高会导致细胞内部生化反应速度上升繁殖代谢迅速，但细胞中生物大分子物质对温度敏感，会因温度过高产生不可逆损伤。另外油藏矿化度也是影响微生物生长及代谢产物作用原油提高采油率的重要因素，相关研究表明随着营养剂盐度的增大乳化原油的效果明显变差，在10％盐度下无任何乳化效果。通常情况下，普通采油微生物适宜的温度在30-50℃之间，嗜热微生物可以在80-100℃环境条件下起作用，极端嗜热微生物甚至可以在116℃的高温下进行驱油。国内的相关研究显示，微生物的最适生存温度为20-40℃。例如，CN104593298A公开了一株新型嗜热耐盐降解原油产乳化剂的菌株及其应用，虽然该菌可以在高温下生长且产生物乳化剂，但该菌最适盐的质量分数为3.0％且不能在80℃高温下产生生物乳化剂高效降解原油。CN105441351A公开了一株嗜热产表面活性剂石油降解菌及其应用，虽然该菌也属地衣芽胞杆菌且可在高温下生长产生物乳化剂，但该菌耐盐度仅能达到70000mg/L的矿化度且产生的生物乳化剂仅在55℃温度下有效乳化柴油。

综上所述，石油开采在兼顾经济利益和环境保护的条件下，微生物采油技术的应用是一种高效环保的采油技术手段。降解石油和高产有利代谢产物的微生物的分离是实现微生物强化采油技术的基础，菌种的好坏是微生物才有的关键。目前已分离得到的一些石油微生物中，能在厌氧条件下降解原油的嗜热耐盐同时能够产生物乳化剂的菌种不多。寻找合适的微生物仍是本领域当前的一项重要工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一株耐高温降解原油、同时产生物乳化剂的地衣芽孢杆菌及其应用。这种采油功能菌产生的生物乳化剂对温度有着优越的耐受能力，在80℃条件下依然能发挥出较好的乳化活性。

本发明提供了一株耐高温降解原油、同时产生物乳化剂的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，本发明命名其为T6189。该菌株已于2016年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号：CGMCC No.13054。该菌株能够以原油为碳源和能源生长，并合成生物乳化剂；该菌株及其代谢产物能够有效降解原油中饱和分组分和芳香分组分含量；该菌产生的生物乳化剂具有优异的耐高温性能、很强的乳化能力；该菌株及其产生的生物乳化剂可用于微生物采油。

本发明的地衣芽孢杆菌T6189是从新疆油田采出液中分离得到的。参考《常见细菌系统鉴定手册》，根据T6189的形态特征和生理生化特征，以及根据分析其16sRNA基因序列并在NCBI数据库GenBank进行Blast比对的结果，可鉴定T6189属于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，与ATCC14580相似度为99％。T6189的16sRNA的序列如序列表SEQ ID No.1所示。T6189的形态特征和生理生化特征如下：

地衣芽孢杆菌T6189在LB固体平板上55℃进行培养的菌落形态特征为：该菌株能在平板上形成较大菌落，菌落的直径随培养时间的增加而增加，在培养12h时，菌落直径为2mm；在培养24h时，菌落直径增加到6.5mm；观察平板上菌落发现其周围呈现不规则形状，经过长时间培养后其菌落的周围能形成丝状分布的类似菌丝的结构。总体而言，该菌落为扁平状，中间呈白色，并伴有丝状隆起，在菌落的外围部分有较小颗粒状隆起，菌落部分比较光滑，呈现湿润性状，菌落总体上较粘稠、易于挑起，菌落的正反面颜色差异不大。

地衣芽孢杆菌T6189的细胞形态特征为：革兰氏染色为阳性，杆状，有鞭毛，具备运动性，兼性厌氧。

地衣芽孢杆菌T6189的生理生化特征为：具有很强的耐温性，可在高温环境下生长且以自身及代谢产物作用原油提高采油率，最佳生长温度范围为50-60℃；最佳生长pH值范围为7-10；具有较高的耐盐性，可在矿化度为110000mg/L以上的条件下生存并产生相当数量的菌体，当矿化度为50000mg/L时对其生长影响较小；能代谢蔗糖产酸；能在兼性厌氧及厌氧环境下生存；降解原油中饱和分组分和芳香分组分含量，产生生物乳化剂。

本发明的地衣芽孢杆菌T6189可以在营养培养基，如：普通牛肉汁、LB、营养琼脂中生长，也可以在添加葡萄糖或蔗糖的无机盐培养基中生长，也可以以原油等为碳源生长。该地衣芽孢杆菌T6189的优选原油无机盐培养基组分为：NaNO₃ 3-10g/L、Na₂MO₄ 0.08-0.1g/L、FeSO₄ 0.12-0.15g/L、MgSO₄ 0.2-0.25g/L、CaCl₂ 0.12-0.15g/L、KH₂PO₄ 1.0-1.5g/L、(NH₄)₂HP0₄ 1.0-1.5g/L、原油2％(V/V)、蔗糖0.2‰(W/V)(原油和蔗糖添加量以无机盐培养基100％计)；培养条件为：pH值7.0-7.2，培养温度50-60℃，搅拌速度140-160rpm、培养时间为48h以上。

本发明还提供了一种地衣芽孢杆菌制剂，该地衣芽孢杆菌制剂中含有保藏编号为CGMCC No.13054的地衣芽孢杆菌，该地衣芽孢杆菌制剂为固态或液态菌制剂。

本发明还提供了上述的地衣芽孢杆菌或上述的地衣芽孢杆菌制剂在生产生物乳化剂中的应用。

在上述的应用中，优选地，所述地衣芽孢杆菌或所述地衣芽孢杆菌制剂是在以蔗糖为碳源、NaNO₃为氮源、且含有微量元素铁和钼的发酵培养基中生产所述生物乳化剂；并且蔗糖在发酵培养基中的含量为10-45g/L，NaNO₃在发酵培养基中的含量为3-10g/L。

本发明还提供了一种生物乳化剂，其是利用上述的地衣芽孢杆菌或上述的地衣芽孢杆菌制剂发酵培养而得到的。

本发明还提供了一种生物乳化剂的制备方法，该方法包括：

利用上述的地衣芽孢杆菌制剂或上述的地衣芽孢杆菌制剂制剂在以蔗糖为碳源、NaNO₃为氮源、且含有微量元素铁和钼的发酵培养基中进行发酵培养，之后至少经离心除去菌体、沉淀出生物乳化剂粗产品、清洗生物乳化剂粗产品、干燥的步骤，制备得到生物乳化剂。

在上述的生物乳化剂的制备方法中，优选地，所述发酵培养基为：蔗糖10-15g/L、硝酸钠3-4.5g/L、硫酸亚铁0.12-0.15g/L、钼酸钠0.08-0.1g/L、硫酸镁0.2-0.25g/L、磷酸二氢钾1.0-1.5g/L、磷酸氢二铵1.0-1.5g/L、酵母粉0-0.125g/L；发酵培养条件为：温度50-60℃、pH值7.0-7.2、搅拌速度140-160rpm，培养时间为120h以上。

本发明还提供了一种上述的生物乳化剂的制备方法制备得到的生物乳化剂。

本发明还提供了上述的地衣芽孢杆菌、上述的地衣芽孢杆菌制剂、上述的生物乳化剂在降解原油和/或驱油中的应用。

本发明还提供了上述的地衣芽孢杆菌、上述的地衣芽孢杆菌制剂、上述的生物乳化剂在乳化油品中的应用。根据本发明的具体实施方式，优选地，所述油品为原油、煤油、石蜡、葵花仁油、柴油、正十六烷以及甲苯中的一种或几种的组合。

根据本发明的具体实施方式，本发明的地衣芽孢杆菌T6189可有效降低原油中饱和分组分和芳香分组分的含量且提高原油中胶质含量。以河南油田4001井、4024井、4027井、4032井及4045井的五种油样为例，利用本发明的地衣芽孢杆菌T6189对这五种原油进行降解，其中饱和分含量平均下降7.81％，芳香分含量平均下降1.98％，胶质含量平均增加2.01％。此外，根据本发明的具体实施方式，其中4001原油饱和分中nC16至nC22之间正构烷烃相对丰度平均增加2.53％；nC23至nC35之间正构烷烃相对丰度平均降低1.02％。4027原油饱和分中nC25之前的轻质正构烷烃相对丰度平均增加1.24％；nC25至nC35之间正构烷烃相对丰度平均下降1.65％。4032原油饱和分中nC22之前部分轻质正构烷烃相对丰度有大幅提升，nC16至nC21正构烷烃相对丰度平均增加1.76％；nC22至nC30之间正构烷烃相对丰度平均下降1.26％。因此，本发明的地衣芽孢杆菌T6189可有效对原油进行微生物降解，进而提高原油采收率。

本发明采用硫酸蒽酮法和考马斯亮蓝法分别对本发明的地衣芽孢杆菌T6189产生的生物乳化剂中的糖类和蛋白质进行定量分析，结果表明，本发明的地衣芽孢杆菌T6189代谢产生的生物乳化剂主要由糖类和蛋白质组成，占生物乳化剂总量的96.42％，其中糖类含量为28.87％，蛋白质含量为67.55％。

本发明的地衣芽孢杆菌T6189产生的生物乳化剂具有较高的乳化能力和耐温性。当浓度为1.0g/100mL时，该生物乳化剂溶液能够将等体积的煤油全部乳化，且随着生物乳化剂浓度的增加对应的乳状液高度基本维持不变，乳化指数均接近100％。同时该生物乳化剂对温度有着优越的耐受能力，在80℃高温环境下依然能够发挥出较好的乳化活性。且该生物乳化剂在不同盐度条件下均对原油具有较高的乳化性。

根据本发明的具体实施方案，本发明的地衣芽孢杆菌T6189产生的生物乳化剂对烷烃类、芳烃类、混合烃及脂类底物均有较好的乳化能力，且对混合烃中柴油有着高效的乳化能力，其EI₁₉₂值高达90％以上。

综上所述，本发明通过从新疆油田采出液中筛选得到了一株耐高温、高效降原油且产生物乳化剂的采油功能菌株，其最适生长温度为50-60℃；最佳生长pH值为7-10；能耐受高达110000mg/L以上的矿化度；革兰氏阳性菌；能代谢蔗糖产酸；具备运动性；能在缺氧环境下生存。该菌不仅可用于高温油藏中稠油的高效降解，及其通过菌体自身及代谢产物对原油组分进行改变和降解从而达到提高原油采收率的目的，而且该菌产生的生物乳化剂能够在高温中对烷烃类、芳烃类、混合烃及脂类底物均有较强的乳化能力，特别对混合烃中的柴油具有高效的乳化能力。因此该菌为微生物采油所用菌株适用范围的扩大提供了有效的方法。本发明提供的采油功能菌可用于高温油藏中稠油的降解，通过菌种自身及其代谢产物对原油组分进行改变和降解从而达到提高原油采收率的目的，本发明还为微生物采油所用菌株适用范围的扩大提供了有效的方法。

附图说明

图1为耐高温采油菌T6189的生长曲线图。

图2a为耐高温采油菌T6189在LB培养基中不同pH值下的生长曲线图；图2b为耐高温采油菌T6189在无机盐培养基中不同pH值下的生长曲线图；图2c为耐高温采油菌T6189在不同矿化度下的生长曲线图；图2d为耐高温采油菌T6189在不同温度下的生长曲线图。

图3a、图3b和图3c分别为耐高温采油菌T6189对原油样品4001、4027和4032生物降解前后正构烷烃相对丰度图。

图4a和图4b分别为耐高温采油菌T6189产生的生物乳化剂中葡萄糖和蛋白质浓度标准曲线图。

图5为耐高温采油菌T6189产生的生物乳化剂不同浓度乳化能力图。

图6为不同温度对耐高温采油菌T6189产生的生物乳化剂乳化能力影响图。

图7为不同盐度对耐高温采油菌T6189产生的生物乳化剂乳化能力影响图。

图8为耐高温采油菌T6189产生的生物乳化剂对不同底物乳化能力图。

用于专利程序的微生物保存：

保藏日期：2016年9月28日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

保藏编号：CGMCC No.13054；

分类命名：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

实施例1

本发明的耐高温采油菌T6189的筛选、分离、鉴定及生长曲线测定

第一步：耐高温采油菌T6189的筛选

耐高温采油菌T6189的筛选方法：按照原油无机盐培养基(其成分组成为：NaNO₃10g/L、Na₂MO₄ 0.08g/L、FeSO₄ 0.12g/L、MgSO₄ 0.2g/L、CaCl₂ 0.12g/L、KH₂PO₄ 1.0g/L、(NH₄)₂HPO₄ 1.0g/L、原油(源自新疆T6189井采出液)2％(V/V)、蔗糖0.2‰(W/V)(原油和蔗糖添加量以无机盐培养基100％计)；pH值为7.0-7.2)配方配制培养基，其中在培养基中添加0.2‰的蔗糖快速激活该菌以便筛选过程快速进行。

实验步骤如下：

(1)将配制好的培养基封装入150mL的三角瓶中，每个三角瓶中装液量为100mL；将分装完毕的三角瓶用封口膜封口，将其置于高温高压灭菌锅中灭菌，控制灭菌条件为121℃、15min；

(2)待灭菌后将三角瓶取出在超净台中冷却降温，后接种10wt％的新疆T6189井采出液，每个样品做3-5个平行组；然后将接种后的培养基放置在恒温摇床中培养，培养条件控制为55℃、150rpm；

(3)将原油乳化情况良好的乳状菌液作种子液接种到新鲜原油无机盐培养基中进行转接富集，如此进行三轮富集。

第二步：耐高温采油菌T6189的分离

多轮富集培养后将乳化情况良好的培养基采用稀释平板法分离单菌。实验步骤如下：

(1)用200μL移液枪移取乳化液100μL至装有900μL蒸馏水的2mL离心管中，将原液稀释10倍；然后依照上述方法将10倍稀释液继续稀释，直至其稀释为10^-6、10^-7、10^-8和10^-9；

(2)原油无机盐培养基中微生物的浓度一般为8次方左右，因此以10^-6、10^-7和10^-8为目标液体进行涂板，涂板过程在超净台中完成；将涂好的LB(其成分组成为：NaCl 10g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、琼脂粉2wt％；pH值为7.0-7.2)固体平板放置在55℃的恒温培养箱中培养。

第三步：耐高温采油菌T6189的鉴定

(1)通过划线法分离得到T6189的单菌落，将分离得到的T6189菌株用LB培养基活化后送至上海生工公司进行基因测序分析。然后将返回的16sRNA的基因序列与NCBI的数据库中进行同源性比对。T6189与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580相似度为99％。T6189的16sRNA的序列如序列表SEQ ID No.1所示。鉴定该菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

(2)菌落形态特征：该菌能在平板上形成较大菌落，菌落的直径随培养时间的增加而增加；在12h时，菌落直径为2mm；在24h时，菌落直径增加到6.5mm。观察平板上菌落发现其周围呈现不规则形状，经过长时间培养后其菌落的周围能形成丝状分布的类似菌丝的结构。总体而言，该菌落为扁平状，中间呈白色，并伴有丝状隆起，在菌落的外围部分有较小颗粒状隆起，菌落部分比较光滑，呈现湿润性状，菌落总体上较粘稠、易于挑起，菌落的正反面颜色差异不大。

(3)细胞形态特征：革兰氏染色为阳性，杆状，有鞭毛，具备运动性，兼性厌氧。

(4)T6189菌株的生理生化特征见表1。

表1 T6189菌的生理生化特征

测试项目	检测结果
		淀粉水解实验	-
油脂水解实验	+
		葡萄糖发酵实验	+，产气
蔗糖发酵实验	+
		乳糖发酵实验	-
明胶水解实验	+

第四步：耐高温采油菌T6189的生长曲线测定

采油功能菌T6189通过绘制间歇培养的生长曲线来了解该菌的生长过程及各个时期出现的时间。实验步骤如下：

(1)配制LB液体培养基，分装于150mL三角瓶中，每个三角瓶装液100mL；

(2)在完成高温高压灭菌后，于超净台中接种2wt％的种子液(即LB培养基活化T6189菌株后的菌液)，置于55℃、150rpm的摇床中培养；

(3)在培养过程中每隔2h经由无菌操作取出4mL培养液进行离心分离，除去上清液并用缓冲液悬浮菌体，而后于紫外分光光度计中波长为600nm的条件下测量其吸光度并绘制生长曲线图，如图1所示。由图1可知，由于接种为对数生长期的种子液且培养条件为高温，因此细菌在进行间歇培养的过程中其延滞期很短甚至不可见，因此在图中直接表现出对数生长期。对数生长期细菌快速增值，生长速率常数达到最大值，经过16-17h后生长曲线开始变得平缓，细菌的生长进入稳定期，在稳定期维持10h后细菌的总体浓度开始下降，细菌的生长开始进入衰亡期。

本发明已将菌T6189于2016年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号：CGMCC No.13054。

实施例2

不同pH值、温度及矿化度对耐高温采油菌T6189的生长影响

(1)pH值对该菌的生长影响：①配制LB液体培养基，分装在150mL三角瓶中，每瓶装液量为100mL；用1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠调节各瓶中pH值分别为5、6、7、8和9；②在高温高压灭菌锅中灭菌，按2wt％的接种量接入种子液(即LB培养基活化T6189菌株后的菌液)，然后在55℃、150rpm条件下培养48h；③培养完成后取4mL培养液于离心管中，离心洗涤沉淀并用等体积蒸馏水悬浮菌体，于紫外分光光度计中600nm条件下测量其吸光度观察其菌浓变化情况；④用相同方法测量菌体在pH值为5、6、7、8和9时无机盐培养基(其成分组成为：NaNO₃ 10g/L、Na₂MO₄ 0.08g/L、FeSO₄ 0.12g/L、MgSO₄ 0.2g/L、CaCl₂ 0.12g/L、KH₂PO₄1.0g/L、(NH₄)₂HPO₄ 1.0g/L；pH值为7.0-7.2)中培养48h后的生长情况，与LB培养的结果进行比较。

(2)矿化度对该菌生长的影响：①配制LB液体培养基，分装在150mL三角瓶中，每瓶装液量为100mL；然后往三角瓶中添加氯化钠改变其矿化度，因LB培养基自身带有10000mg/L的矿化度，所以往培养基中分别添加1-10g/100mL不等的氯化钠，调节矿化度分别为1万、2万、3万、4万、5万、7万、9万和11万(mg/L)；②在高温高压灭菌锅中灭菌，按2wt％的接种量接入种子液(即LB培养基活化T6189菌株后的菌液)，然后在55℃、150rpm条件下培养48h；③培养完成后取4mL培养液于离心管中，离心洗涤沉淀并用等体积蒸馏水悬浮菌体，于紫外分光光度计中600nm条件下测量其吸光度观察其菌浓变化情况。

(3)温度对该菌生长的影响：①配制LB液体培养基，分装在150mL三角瓶中，每瓶装液量为100mL；②在高温高压灭菌锅中灭菌完成后，按2wt％的接种量接种种子液(即LB培养基活化T6189菌株后的菌液)，然后于35℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃、150rpm条件下培养48h；③培养完成后取4mL培养液于离心管中，离心洗涤沉淀并用等体积蒸馏水悬浮菌体，于紫外分光光度计中600nm条件下测量其吸光度观察其菌浓变化情况。

耐高温采油菌T6189在不同pH值、温度及矿化度的生长影响分别如图2a、2b、2c和2d所示，酸性环境对其负面影响较大，其在pH值为7至10的的范围内均能较好的生长，最佳的生长pH值为8；该菌种在矿化度为110000mg/L的条件下依旧能够生存并产生相当数量的菌体，矿化度50000mg/L以下时对其生长影响较小；该菌种的最佳生长温度为55℃，温度超出50-60℃范围其生长受到明显抑制。

实施例3

耐高温采油菌T6189对原油的代谢特征

第一步：原油的微生物代谢及萃取分离

本发明使用的原油分别是来自河南油田4001井、4024井、4027井、4032井及4045井的油样，其中4027井油样在常温下呈液态，其余油井的油样在常温下均为固态。具体实验步骤如下：

(1)原油的微生物代谢：①按照无机盐培养基配制培养基，在培养基中加入0.2wt‰的蔗糖用作微生物快速激活剂，再添加0.5wt％的不同原油于各个装有100mL培养液的150mL三角瓶中封口，于121℃条件下灭菌15min；②将装有不同原油的各个三角瓶取出于超净工作台中冷却，接种2wt％活化后的T6189种子液(即LB培养基活化T6189菌株后的菌液)，于恒温摇床中55℃、150rpm条件下培养，培养时间7d。

(2)原油的萃取分离：①取500mL分液漏斗将分液漏斗玻璃部分以及烧杯置于马弗炉中灼烧去除有机物，灼烧条件500℃、2h；②将经微生物作用后的含油三角瓶取出于通风厨中进行原油的萃取，萃取剂为四氯化碳，萃取用量为100mL，萃取过程分多次进行；③收集分液漏斗中的下层液体于灼烧过的烧杯中，然后于通风厨中挥干四氯化碳，烧杯中留下的部分即为微生物作用后的原油。

第二步：耐高温采油菌T6189作用原油前后组分的变化情况

原油由饱和分、芳香分、胶质及沥青质四部分组成，本发明依据它们极性的不同利用氧化铝吸附柱进行分离。用正庚烷洗脱得到饱和分；用甲苯洗脱得到芳香分；用(1∶1)甲苯-乙醇、甲苯、乙醇(95％)次序洗脱得到胶质。在实验中对五种原油的原始样品及其经过微生物代谢处理的样品进行了四组分分离。结果如表2所示。

表2 原油四组分分离结果

由表2中数据可知，原油在微生物作用前后组分发生了明显的变化，其中饱和分含量平均下降7.81％；芳香分含量平均下降1.98％；胶质含量平均增加2.01％；沥青质含量平均增加1.76％。

综上所述，原油经该菌作用后其饱和烃被微生物代谢致使该组分在原油中的占比下降，芳香分存在部分降解，胶质沥青致由于其难生物降解因此在原油中占比有所升高。

第四步：耐高温采油菌T6189作用前后原油中饱和分组分的气相色谱分析

气相色谱分析执行的标准是：SY/T 6196-1996；测试所使用的仪器是：GC-FID；测试条件是：载气：99.999％氦气；进样口：300℃；检测器FID：300℃；色谱柱：HP-5弹性石英毛细柱(30m×0.25mm×0.25μm)；柱温：初温100℃保持1min，4℃/min升温至300℃，保持10min；载气流速：恒流1mL/min；分流进样1μL，分流比10∶1。

选取4001、4027和4032原油样品及生物降解处理后的原油样品的饱和组分进行气相色谱分析。各个饱和分样品的正构烷烃相对丰度变化情况如图3a、3b和3c所示。其中4001原油饱和分中nC16至nC22之间正构烷烃相对丰度平均增加2.53％；nC23至nC35之间正构烷烃相对丰度平均降低1.02％。4027原油饱和分中nC25之前的轻质正构烷烃相对丰度平均增加1.24％；nC25至nC35之间正构烷烃相对丰度平均下降1.65％。4032原油饱和分中nC22之前部分轻质正构烷烃相对丰度有大幅提升，nC16至nC21正构烷烃相对丰度平均增加1.76％；nC22至nC30之间正构烷烃相对丰度平均下降1.26％。三种原油微生物作用前后原油正构烷烃相对丰度变化呈现出一定的规律性，即采油功能微生物能够代谢碳原子数小于35的正构烷烃，在代谢nC22至nC35之间的正构烷烃时功能微生物会首先将其降解为较小分子量正构烷烃而后加以利用，由此导致nC16至nC22之间的正构烷烃相对丰度的提升。

实施例4

耐高温采油菌T6189产生生物乳化剂提取及组分性能评价

第一步：耐高温采油菌T6189产生生物乳化剂的提取分离

(1)发酵培养基的配制与接种发酵：①按照发酵培养基(其组成成分为：蔗糖10g/L、蛋白胨2.7g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢钾0.3g/L；pH＝7.0-7.2)配方配制培养基，在121℃条件下灭菌15min，然后在超净台中进行接种，接种量为2wt％种子液(即LB培养基活化T6189菌株后的菌液)。将接种后的锥形瓶放入摇床中培养，培养条件为55℃，150rpm，培养时间120h；②收集发酵上清液在含糖培养基(其组成成分为：蔗糖10g/L、蛋白胨2.7g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢钾0.3g/L；pH＝7.0-7.2)中培养120h后，将锥形瓶中发酵液装入50mL离心管中进行离心分离，离心条件为10000rpm、10min；离心完成后收集上清液于2L烧杯中待用；③取无水乙醇，按照乙醇/发酵液体积比例为3∶1添加无水乙醇，将混合液置于4℃冰箱中沉淀过夜；④倾去烧杯中上层清夜；在烧杯底部以及杯壁上留下的沉淀即为生物乳化剂，收集生物乳化剂于50mL离心管中，在收集过程中可用无水乙醇冲刷，而后将配平后的离心管置于离心机中进行高速离心收集沉淀，离心条件为10000rpm、10min；得到的生物乳化剂沉淀收集于25mL圆底烧瓶中待用；⑤收集于25mL圆底烧瓶中的生物乳化剂可经由真空冷冻干燥机进行干燥，干燥完成后即得到生物乳化剂粗产物。圆底烧瓶封口后置于-80℃冰箱中保存。

第二步：耐高温采油菌T6189产生生物乳化剂中糖类和蛋白质的定量分析

耐高温采油菌T6189产生生物乳化剂主要由糖类和蛋白定组成。本发明采用硫酸蒽酮法和考马斯亮蓝法分别对糖类和蛋白质进行定量分析。

(1)糖类定量分析，具体步骤如下：①标准液的制备：量取被干燥至恒重的无水葡萄糖0.2g于体积为100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度线，充分摇匀；移取10mL溶液加入100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度线，充分摇匀，即1mg/mL的标准液；②样品制备：称取0.2g样品于100mL容量瓶中，定容至刻度线摇匀，然后于沸水中加热2h使之充分溶解；用10mL移液管吸取10mL溶液于新的100mL容量瓶中定容摇匀，即样品液；③蒽酮试剂制备：称取0.2g蒽酮溶解于100mL浓硫酸中即可得到，仅限当日使用；④标准曲线的制作：分别量取标准液体积为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL于10mL具塞试管中，对照组吸取2.0mL蒸馏水，其余用蒸馏水补充至2.0mL；而后各个试管加入8.0mL的蒽酮溶液，充分摇匀，于冰水中冷却，再在沸水浴中加热10min，用冷水冷却，在室温下放置10min；最后在分光光度计中测量吸光度，波长620nm；依据测得的数据绘制标准曲线；⑤参考步骤④测量样品吸光度，控制浓度使最终吸光度数值在标准曲线吸光度范围内，然后换算浓度。葡萄糖浓度标准曲线图如图4a所示。

(2)蛋白质定量分析，具体步骤如下：①蛋白质标准液的制备：量取0.1g牛血清蛋白于100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，充分摇匀，移取10mL于新的100mL容量瓶中，充分摇匀，即为标准蛋白溶液；②蛋白染色剂制备：称取0.1g考马斯亮蓝G250将其溶解在50mL浓度为95％的乙醇中，而后将溶液与100mL85％的磷酸混合，再于1.0L容量瓶中定容，即得染色液；③标准曲线的制作：量取100、200、300、400和500μL浓度为0.1mg/mL的标准蛋白溶液于10mL具塞试管中，用蒸馏水定容至500μL，取500μL蒸馏水做空白。然后往每根试管中添加5mL染色液，混合后2min至1h内测量其吸光度(波长为595nm)，依据实验结果绘制标准曲线；④参考步骤③测量样品吸光度，控制浓度使最终吸光度数值在标准曲线吸光度范围内，而后换算浓度。蛋白质浓度标准曲线图如图4b所示。

由图4a和4b可知，耐高温菌T6189代谢产生的生物乳化剂主要由糖类和蛋白质组成，占生物乳化剂总量的96.42％，其中糖类含量为28.87％，蛋白质含量为67.55％。

第三步：耐高温采油菌T6189生物乳化剂的乳化力、温敏性及盐敏性分析

本发明以乳化指数(EI)为评价指标来检测该菌产生物乳化剂的乳化能力，即EI值越大表明形成的乳状液越稳定，具体步骤如下：

(1)生物乳化剂乳化能力的检测：配制不同浓度的生物乳化剂溶液，浓度分别为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4及1.5g/100mL。取配制好的不同浓度的生物乳化剂溶液与航空煤油按照1∶1的体积比混合，充分振荡分散，静置观察并记录计算乳化指数。不同浓度的生物乳化剂的乳化能力如图5所示。

由图5可知，当浓度小于1.0g/100mL时，1mL的生物乳化剂溶液对等体积煤油的乳化能力随着浓度的增加而增加；当浓度为1.0g/100mL时，生物乳化剂溶液能够将等体积的煤油全部乳化，且随着生物乳化剂浓度的增加对应的乳状液高度基本维持不变，乳化指数均接近100％。因此选择乳化剂浓度为1.0g/100mL用于评价该菌产生物乳化剂温敏性。

(2)生物乳化剂温敏性检测：将生物乳化剂溶液分别置于60、70、80、90和100℃的实验环境中2h，而后取出静置降温，将处理过后的生物乳化剂溶液与航空煤油按照1∶1的体积比混合，充分振荡分散，静置观察并记录计算乳化指数。不同温度对生物乳化剂的乳化能力影响如图6所示。由于高温处理会致使生物乳化剂形成的乳状液稳定性显著下降，因此本发明将生物乳化剂的温敏性评价分为两个阶段：第一阶段在12h内每隔2h拍照测量乳化指数；第二阶段在乳化液静置24h后拍照测量其EI₂₄数值。

由图6可知，当温度为60℃时，样品的EI₂₄值为44.12％，降比明显；当温度为70℃时，样品的EI₂₄值为78.75％，优于60℃处理样品的乳化能力；当温度为80℃、90℃和100℃时，样品的EI₂₄值分别为74.07％、7.05和6.76％。相比之前样品的乳化能力显著降低。综上所述，该菌产生的生物乳化剂对温度有着优越的耐受能力，在80℃条件下依然能发挥出较好的乳化活性。

(3)生物乳化剂盐敏性检测：用NaCl调节乳化剂溶液的含盐量，控制含盐量为0、1、2、3、4及5％，取含不同盐量的生物乳化剂溶液与航空煤油按照1∶1的体积比混合，充分振荡分散，静置观察并记录计算乳化指数。不同盐度对生物乳化剂的乳化能力影响如图7所示。

由图7可知，起始阶段含盐量不同的乳化剂溶液乳化性能表现出较大差异。空白乳化剂溶液乳化煤油的EI₂₄值为93.94％；当含盐量为1％时，EI₂₄值为86.36％；含盐量2％时，EI₂₄值为97.1％；含盐量3％时，EI₂₄值为95.31％；含盐量4％时，EI₂₄值为93.75％；含盐量5％时，EI₂₄值为86.15％。综上所述，在含盐量低于1％的环境中，该种乳化剂能够具有较好的乳化活性。

第四步：耐高温采油菌T6189产生的生物乳化剂对不同底物的乳化能力

本发明检测了该菌产生的生物乳化剂对8种(煤油、石蜡、葵花仁油、柴油、正十六烷和甲苯)不同底物的乳化能力的效果，其中生物乳化剂溶液浓度为1.0g/100mL，乳化剂溶液与待作用样品按照体积比为1∶1的比例混合，充分振荡分散，静置观察并记录计算乳化指数。生物乳化剂对不同底物的乳化能力如图8所示。

由图8可知，该菌产生的生物乳化剂对不同底物的乳化能力差异较大。其中以柴油为底物时，乳状液在前80h能够维持稳定，随后乳化层高度开始下降，至168h后乳状液失稳速度加快，其EI₁₉₂值为80.3％；以煤油、液体石蜡和正十六烷为底物时，乳状液基本维持稳定，乳化层在静置过程中缓慢下降，它们的EI₁₉₂值分别为：90％、80.77％和75.44％；当以葵花仁油为底物时，乳状液在前36h维持稳定，随后快速失稳，至120h左右基本失去乳化效果；在以甲苯为底物时，形成的乳状液性状稳定维持了很好的乳化效果，但是其乳化层的高度在逐渐下降。综上所述，该菌产生生物乳化剂对烷烃类、芳烃类、混合烃及脂类底物均有较好的乳化能力，且对混合烃中的柴油有着高效的乳化能力。

实施例5

耐高温采油菌T6189发酵培养基优化

本发明采用Design Expert软件设计PB(Plackett-Burman)实验用以筛选出对耐高温菌T6189生长代谢中重要的培养基组分。实验中分析的因素共8种，分别是蔗糖、NaNO₃、FeSO₄、Na₂MoO₄、MgSO₄、酵母粉、KH₂PO₄和(NH₄)₂HPO₄，共进行12次实验。PB实验设计及实验结果如表3所示。

表3 PB实验设计及结果

(1)PB实验中分别以生物量和乳化剂量为响应值进行测量，实验步骤如下：①按照设计表配制相应的培养基，在高温高压灭菌锅中灭菌，灭菌条件121℃、15min；②将完成灭菌的培养基取出，在超净工作台中接种完成活化的种子液(即LB培养基活化T6189菌株后的菌液)，种子液接种量2wt％，之后于55℃、150rpm条件下培养120h；③在恒温摇床中完成培养后取出，将发酵液转移至50mL离心管中，于精密天平中进行两管配平，进行对角离心的两根离心管之间的重量差值控制在0.01g之间；离心条件10000rpm、10min；④完成离心后将上清液倾倒入容器中保存备用，待离心管烘干后用差值法计算所含菌体的重量，再依据离心发酵液所用量进行百分比换算，计算菌体在发酵液中的比率，单位g/L；如此即可得到发酵生物量的数值；⑤将步骤④中保存的发酵上清液取出，用移液管精确吸取10mL于新的容器中，再用50mL移液管移取50mL无水乙醇缓慢加入装有10mL上清液的容器中，在此过程中不断振荡以促进混合；⑥将醇沉得到的混合液转移到50mL离心管中，按照步骤③进行配平离心，离心条件10000rpm、10min，得到的沉淀即为生物乳化剂，待离心管烘干后用差值法计算得到的生物乳化剂量，再依据离心时所用液体体积进行换算，即可测得生物乳化剂产量。

(2)CCD(Plackett-Burman)实验的基础培养基配方是：蔗糖15g/L、硝酸钠3g/L、硫酸亚铁0.15g/L、钼酸钠0.1g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸二氢钾1.5g/L及磷酸氢二铵1.5g/L、酵母粉0.125g/L。由PB实验结果分析，以上述配方中蔗糖、硫酸亚铁和磷酸二氢钾为实验中心进行展开，实验表设计及结果如表4。

表4 CCD实验设计及结果

本发明通过CCD实验构建了一个二次方程模型用以解释该菌产生物乳化剂的产量与蔗糖、FeSO₄及KH₂PO₄加量之间的关系，并通过这个模型找到了该菌产生物乳化剂最大理论产量所在区间，运用Design Expert软件进行PB实验设计对培养基组分的重要性进行甄别，结果显示当以生物乳化剂的产量为考察指标时，蔗糖、FeSO₄及KH₂PO₄是三个重要因素。它们的添加量(蔗糖15g/L、FeSO₄ 0.15g/L及KH₂PO₄ 1.5g/L)对乳化剂产量有显著影响。依据PB实验结果进行了CCD实验构建了一个二次方模型用以解释生物乳化剂产量与蔗糖、FeSO₄及KH₂PO₄之间的关系，并通过此模型寻找到了生物乳化剂最大理论产量所在区间。

实际因素的表达式如下所示：

Bioemusifler＝-4.62380+0.20433*Sucrose+31.57737*FeSO₄+2.23318*KH₂PO₄-0.37232*Sucrose*FeSO₄-0.031052*Sucrose*KH₂PO₄-3.61846*FeSO₄*KH₂PO₄-2.56731E-003*Sucrose²-74.68421*FeSO₄ ²-0.33333*KH₂PO₄ ²。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国石油大学(北京)

<120> 一株耐高温降解原油产乳化剂的地衣芽孢杆菌及其应用

<130> GAI16CN2947

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1360

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 1

ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa 60

cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat tccagcttca cgcagtcgag 120

ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga tttgtgggat tggcttagcc tcgcggcttc 180

gctgcccttt gttctgccca ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg 240

atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa 300

ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc 360

acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcactc tgcccccgaa ggggaagccc 420

tatctctagg gttgtcagag gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat 480

taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg 540

cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat gcgtttgctg cagcactaaa gggcggaaac 600

cctctaacac ttagcactca tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct aatcctgttc 660

gctccccacg ctttcgcgcc tcagcgtcag ttacagacca gagagtcgcc ttcgccactg 720

gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc gctacacgtg gaattccact ctcctcttct 780

gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc tccccggttg agccgggggc tttcacatca 840

gacttaagaa accgcctgcg cgcgctttac gcccaataat tccggacaac gcttgccacc 900

tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca 960

aggtgccgcc ctattcgaac ggtacttgtt cttccctaac aacagagttt tacgatccga 1020

aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc 1080

ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc 1140

tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc 1200

gccgcgggtc catctgtaag tggtagctaa aagccacctt ttatgattga accatgcggt 1260

tcaatcaagc atccggtatt agccccggtt tcccggagtt atcccagtct tacaggcagg 1320

ttacccacgt gttactcacc cgtccgccgc tgacctaagg 1360

Claims (11)

1.保藏编号为CGMCC No.13054的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

2.一种地衣芽孢杆菌制剂，该地衣芽孢杆菌制剂中含有保藏编号为CGMCC No.13054的地衣芽孢杆菌，该地衣芽孢杆菌制剂为固态或液态菌制剂。

3.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌或权利要求2所述的地衣芽孢杆菌制剂在生产生物乳化剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述地衣芽孢杆菌或所述地衣芽孢杆菌制剂是在以蔗糖为碳源、NaNO₃为氮源、且含有微量元素铁和钼的发酵培养基中生产所述生物乳化剂；并且蔗糖在发酵培养基中的含量为10-45g/L，NaNO₃在发酵培养基中的含量为3-10g/L。

5.一种生物乳化剂，其是利用权利要求1所述的地衣芽孢杆菌或权利要求2所述的地衣芽孢杆菌制剂发酵培养而得到的。

6.一种生物乳化剂的制备方法，该方法包括：

利用权利要求1所述的地衣芽孢杆菌或权利要求2所述的地衣芽孢杆菌制剂在以蔗糖为碳源、NaNO₃为氮源、且含有微量元素铁和钼的发酵培养基中进行发酵培养，之后至少经离心除去菌体、沉淀出生物乳化剂粗产品、清洗生物乳化剂粗产品、干燥的步骤，制备得到生物乳化剂。

7.根据权利要求6所述的生物乳化剂的制备方法，其中，所述发酵培养基为：蔗糖10-15g/L、硝酸钠3-4.5g/L、硫酸亚铁0.12-0.15g/L、钼酸钠0.08-0.1g/L、硫酸镁0.2-0.25g/L、磷酸二氢钾1.0-1.5g/L、磷酸氢二铵1.0-1.5g/L、酵母粉0-0.125g/L；发酵培养条件为：温度50-60℃、pH值7.0-7.2、搅拌速度140-160rpm，培养时间为120h以上。

8.一种权利要求6或7所述的生物乳化剂的制备方法制备得到的生物乳化剂。

9.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌、权利要求2所述的地衣芽孢杆菌制剂、权利要求5所述的生物乳化剂、或权利要求8所述的生物乳化剂在降解原油和/或驱油中的应用。

10.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌、权利要求2所述的地衣芽孢杆菌制剂、权利要求5所述的生物乳化剂、或权利要求8所述的生物乳化剂在乳化油品中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其中，所述油品为原油、煤油、石蜡、葵花仁油、柴油、正十六烷以及甲苯中的一种或几种的组合。