CN102559165B - 一种采油菌趋向原油条件控制方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采油菌趋向原油条件控制方法及其应用。该方法包括建立一种微观可视化模型单凹载玻片，在凹槽内添加待检菌液和原油，用显微镜观察细菌运移情况，并通过比对研究微生物以原油为碳源的化学趋向性运动规律，确定采油菌趋向原油条件的控制条件。由该方法确定的生物驱油剂，包括采油菌和培养液，培养液中含有激活剂0.2-1.3g/L和Ca²⁺0.1g/L，激活剂为脂肽、石油磺酸盐、吐温-80、糖脂和酵母粉中的一种或酵母粉与其它几种激活剂复配使用。本发明的采油菌趋向原油条件控制方法明显优于现有方法，具有检测速度快、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，由此确定的生物驱油剂更加合理，可明显提高采收率。

Description

一种采油菌趋向原油条件控制方法及其应用

技术领域

本发明属于生物驱油技术领域，特别是涉及一种采油菌趋向原油条件控制方法及其在确定生物驱油剂组配方案中的应用。

背景技术

在采油技术领域中，原油趋向性是在地下油层中能够利用原油的微生物，对原油中烃类化学物质的浓度梯度产生响应，主动向油水界面靠近并富集的特性。目前，通常采用的微生物原油趋向性研究方法有三种：

(a)琼脂平板法-肉眼可见

如图1A所示，在含有一定浓度诱导剂(主要是碳源)的半固体平板中央加入一定量的经过处理的菌液(菌在达到对数生长期后，离心获得菌体，并用运动缓冲液清洗菌体)，在适宜温度下静止培养，在不同时间取出观察，出现趋化圈。

(b)毛细管法-暗视野显微镜/相差显微镜

如图1B所示，为建立一个微观的趋化性体系，用极细的毛细管弯成U型，平放在载玻片上，在其上放置一块盖玻片形成一个一端开口的小室，期内充满用运动缓冲液稀释的菌体，把一根加有诱导剂的毛细管从开口端插入菌液里，观察菌体运动的过程。

(c)琼脂糖内塞法-暗视野显微镜/相差显微镜

如图1C所示，在载玻片上用橡胶条及盖玻片构成一个小室，两端用凡士林封口，中间滴一小滴含有诱导剂的琼脂糖，四周加上菌液，显微镜下观察细菌趋化性。

上述方法不足之处一是操作比较复杂，不容易得到相应的结果；二是不能够对采油微生物的原油趋向性进行定量的研究。

解烃微生物利用烃类有三种方式：一是主动接近并附着在大分子烃类物质上，利用细胞膜上的烷烃加氧酶改变烃类性质；二是产生表面活性剂类物质将石油烃乳化成小液滴，进而靠主动运输摄取交换；三是将摄取水介质中的溶解烃。无论是哪种方式，能主动与原油亲和的微生物必定占有生存优势。油藏中的营养物质匮乏，多数微生物以石油为唯一碳源，加上水驱动力和压力等外力因素，因此存在一定程度的趋化性。如果能提供适当的营养，便可激活这些微生物的生长动力，加速其原油趋化性，并使其在油藏中大量繁殖，产生表活剂、有机酸、气体等有利于采油的物质，与原油/岩石/水相互作用，并能刺激油藏深部的厌氧微生物(主要是硝酸盐还原菌、发酵菌和产甲烷古菌等)，最终达到提高石油采收率的目的。国内在采油菌株对原油的趋化性方面研究还没有成型的方法和理论。

发明内容

本发明一个目的是提供一种采油菌趋向原油条件控制方法。

本发明所提供的采油菌趋向原油条件控制方法，可包括以下步骤：

一种采油菌趋向原油条件控制方法，用于确定生物驱油剂方案，包括以下步骤：

1)建立一种微观可视化模型单凹载玻片：在载玻片单面开设一圆形凹槽，添加待检菌液，加入原油，然后使用一盖片盖住凹槽并密封；

2)改变待检菌液的组成，包括采油菌的种类和培养液的成分和浓度，制作对应的单凹载玻片；

3)将各单凹载玻片放置，用显微镜观察细菌运移情况并记录；细菌运移情况包括细菌分布状态、细菌与原油接触状态以及细菌摄取原油状态；

4)通过比对研究微生物以原油为碳源的化学趋向性运动规律，确定采油菌趋向原油条件的控制条件。

本发明另一目的是用以上方法来确定合理的生物驱油剂。

本发明确定的生物驱油剂，包括采油菌和培养液，所述培养液中含有激活剂和Ca²⁺。在生物驱油剂中，激活剂浓度为0.2-1.3g/L；Ca²⁺浓度为0.1g/L。

其中，所述激活剂为脂肽、石油磺酸盐、吐温-80、糖脂和酵母粉中的一种或酵母粉与其它几种激活剂复配使用。

所述培养液的碳源优选葡萄糖，在生物驱油剂中的质量百分比浓度为0.018-0.18％。

所述采油菌为适合油层环境的一种或多种采油菌的混合，菌浓为1-5％(体积百分比)；优选2％。所述采油菌可选自1#DQ(波茨坦短芽孢杆(Brevibacillusborstelensis)CGMCCNo.2441)、3#HX(蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)CGMCCNo.1141)和5#LD(铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonasaeruginosa)CCTCCNo.208114)。

具体的，所述生物驱油剂包含以下终浓度的组分：采油菌1-5％(体积百分比)，葡萄糖0.018-0.18％(质量百分比)，KH₂PO₄1.5克/升，Na₂HPO₄3克/升，NH₄Cl2.0克/升，NaCl2.0克/升，CaCl₂0.1g/L，激活剂0.2-1.3g/L；自来水配制，pH值5.0-9.0。

更详尽的，所述生物驱油剂为包括KH₂PO₄1.5克/升，Na₂HPO₄3克/升，NH₄Cl2.0克/升，NaCl2.0克/升，CaCl₂0.1g/L，pH值5.0-9.0的水溶液，还含有以下所列组配之一：

组配一：所述采油菌为1#、3#和5#菌按体积1∶1∶1的混合菌，菌浓2％；所述葡萄糖浓度为0.018％；所述激活剂为脂肽，浓度为0.8g/L；

组配二：所述采油菌为3#菌，菌浓2％；所述葡萄糖浓度为0.05％；所述激活剂为吐温-80，浓度为0.2g/L；

组配三：所述采油菌为1#菌，菌浓5％；所述葡萄糖浓度为0.18％；所述激活剂为糖脂，浓度为1.0g/L；

组配四：所述采油菌为3#菌，菌浓1％；所述葡萄糖浓度为0.02％；所述激活剂为酵母粉，浓度为0.5g/L；

组配五：所述采油菌为1#、3#和5#菌按体积1∶1∶1的混合菌，菌浓2％；所述葡萄糖浓度为0.018％；所述激活剂为脂肽0.8g/L和酵母粉0.5g/L；

组配六：所述采油菌为1#、3#和5#菌按体积1∶1∶1的混合菌，菌浓2％；所述葡萄糖浓度为0.018％；所述激活剂为吐温-800.2g/L和酵母粉0.5g/L；

组配七：所述采油菌为3#菌，菌浓2％；所述葡萄糖浓度为0.018％；所述激活剂为脂肽，浓度为0.8g/L。

本发明还提供一种使采油菌种趋向原油条件的微生物采油方法，包括将上述确定的生物驱油剂注入油层的微生物驱油过程。

本发明试验结果表明：1)微生物采油菌在生长过程中，其疏水性发生变化，导致微生物菌体能够主动向原油方向运动；2)采油菌由于疏水性的逐步提高，最终能够聚集到原油附近，并通过乳化烃或溶解烃为碳营养源进行在位繁殖，也可以直接接触和作用原油；3)疏水性的大小，体现了微生物趋向并作用原油的速度，一般疏水性大的菌种，其乳化原油的速率也更快；4)在微生物培养液中添加一定浓度的激活剂，可以增强采油菌的疏水性，并提高微生物细胞个体向原油运动和聚集的速度；5)在微生物营养液中引入适量的Ca²⁺，可以调节和促进细菌细胞鞭毛或纤毛的摆动，并向原油作趋向性运动；6)可将细胞疏水性作为筛选和评价微生物采油菌的一种技术方法。本发明的采油菌趋向原油条件控制方法明显优于现有的采油菌趋向原油条件控制方法，具有检测速度快、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合推广和应用。本发明由此确定的生物驱油剂组配更为合理，可明显提高采收率，将在微生物驱油领域发挥巨大作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1A-图1C为常采用的微生物原油趋向性研究方法示意图；

图2为本发明采油菌趋向原油条件控制方法的可视化模型；

图3为采油菌在油水中的初始及运移后分布特点微观观察结果(20×)，a初始状，b初始状态，c最终状态；

图4为采油菌向原油趋化性运动的过程及在位繁殖观察结果，a细菌向原油方向运动，b细菌集中于油水界面，c细菌在原油附近繁殖；

图5为采油菌在油水中的作用和变化观察结果，a细菌摄取油滴，b细菌在原油附近的繁殖；

图6为采油菌的生长曲线；

图7为采油菌在不同生长阶段的疏水值变化曲线

图8为不同浓度脂肽有机物对采油菌3#HX疏水性的影响

图9为同一浓度(2％)脂肽对不同菌株疏水性的影响

图10为pH值对采油菌疏水性的影响

图11为温度对采油菌疏水性的影响

图12为不同碳源对采油菌疏水性的影响

图13为Ca²⁺对采油菌株4#015采油菌趋化性的影响，a对照，b加Ca²⁺；

图14为培养1小时菌株3#HX在不同蔗糖浓度下的趋化性及繁殖现象显微观察结果

图15为培养96小时菌株3#HX在不同蔗糖浓度下的趋化性及繁殖现象显微观察结果

图16为培养1小时菌株4#015在不同葡萄糖浓度下的趋化性及繁殖现象显微观察结果

图17为培养96小时菌株4#015在不同葡萄糖浓度下的趋化性及繁殖现象显微观察结果

图18为微生物原油趋化性调控途径

具体实施方式

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、采油菌趋向原油条件控制方法的建立

本发明采油菌趋向原油条件控制方法，包括以下步骤：

1)如图2所示，建立一种微观可视化模型单凹载玻片：在载玻片单面开设一圆形凹槽，先在凹槽内添加待检菌液，然后在凹槽一端加入原油，然后使用一盖片盖住凹槽并密封；

2)改变待检菌液的组成，包括采油菌的种类和培养液的成分和浓度，制作对应的单凹载玻片；

3)将各单凹载玻片放置，用显微镜观察细菌运移情况并记录；细菌运移情况包括细菌分布状态、细菌与原油接触状态以及细菌摄取原油状态；

4)通过比对研究微生物以原油为碳源的化学趋向性运动规律，确定采油菌趋向原油条件的控制条件。

试验一、用实施例1方法检测采油菌在油水中的趋向性运动规律及试验结果验证

一、用实施例1方法检测采油菌在油水中的趋向性运动规律

选取5株降解原油效果较好的菌种1#DQ(专利号CN200810227860.3已公开)、2#QF(研究用菌，实验室保藏)、3#HX(菌种专利号ZL200410038054.3)、4#015(研究用菌，实验室保藏)、5#LD(菌种保藏号CCTCCNO：208114)作为试验菌株，菌种的生物特性见表1。用实施例1建立的采油菌趋向原油条件控制方法对微生物采油菌在油水中的运动特点进行观察和检测。

表1微生物原油趋向性研究菌种筛选结果

试验结果表明，5株细菌在油水中的初始分布特点可以分为两种类型：一类为细菌细胞在油水中均匀分布，并没有表现出明显的疏水性(亲油性)和亲水性(菌1#DQ、2#QF、4#015、5#LD)；另一种类型的菌则由于原油的存在而表现出亲水性，即在油水界面附近菌浓较少，甚至形成真空地带，而在远离原油的位置则分布较多，菌体浓度较大(菌3#HX)。随着时间的推移，两种采油菌都开始向原油部位运移，表现出一定的趋向性，最终在油水界面附近聚集，形成了与初始状态相反的分布规律(如图3所示)。

根据试验观察，认为解烃类采油菌对原油烃的利用是逐步完成的：首先是菌种细胞由于趋化性运动，由原来的分散状态逐渐向油水界面集中，形成一个明显的密集带，这些菌类可能以溶解或增溶于该部位水溶液中的烃(短链烃，＜C₁₀)为主要碳源，完成菌种的生长和代谢作用；随后，有些细菌细胞直接附着于原油表面，并产生在位繁殖，繁殖后菌种浓度大大提高，与油滴或气泡混合形成菌团或絮状物，这些菌通过接触和粘附于原油而摄取并利用烃类(如图4和图5所示)。

二、试验结果验证-采油菌的生长曲线及疏水性变化

a、采油菌的生长曲线

对五株菌在LB培养基中的生长曲线进行了测定。试验条件为：LB液体培养基，将菌株从斜面转入液体培养基中，45℃温度条件下摇瓶恒温培养，定期取样，测定OD₆₀₀值。

生长曲线如图6所示，菌种1#、2#、3#、4#2小时左右进入对数生长期，13-14小时菌浓度开始稳定；5#菌6-8小时开始生长，14小时进入生长稳定期。

b、采油菌不同生长期疏水性变化

根据上述5株采油菌在油水中的分布变化过程，对其在不同生长阶段的疏水性进行了检测。细菌细胞表面疏水性采用BATH(bacteriaadhesiontohexadecane)测定方法。具体方法为：取2mL不同培养时间菌液注入10mm×150mm玻璃试管中，在样品试管中加入0.1mL十六烷，置于45℃下温育10min，在振荡器上振荡1min后静置30s，再振荡1min后将样品置于45℃下静置1h。以注射器吸取下层菌注入比色皿中测定OD₆₀₀值。同期测定未经十六烷吸附的菌液浓度。两者比值为细胞表面疏水性参数。测定结果以3次测定平均值为准。

通过实验结果(见表2)分析，5种菌生长初期的疏水值分别为20.2％、19.1％、0、10.4％和30.1％，其中，3#菌的疏水值最低为0，5#菌的疏水值最高，达到30％以上；5种菌株均在12小时-16小时进入稳定期，而此刻的疏水值也达到最高值，在五种菌中，5#菌的疏水值最高，为50.7％，3#菌的疏水值仍最低，约为17.8％，其它三种菌的疏水值分别为1#菌32.2％、2#菌29.6％、4#菌31.1％，之后随着菌种生长进入衰亡期，疏水性逐渐下降。

将上面的采油菌株与非采油菌的疏水性进行了比对。实验选取1株不具采油特性的菌株大肠杆菌。测定结果表明：大肠杆菌在稳定期的疏水最高值为3.0％，与采油菌的疏水性相差明显。

上述a、b试验结果验证了步骤一的试验结果。

表2采油菌不同生长时期疏水性测定结果(％)

三、解释5种菌在油水中分布及趋向性运动的变化规律

在五株菌中，5#菌的疏水性最高，与摇瓶振荡乳化试验的结果(表3，“+”代表乳化效果，“+”符号越多，表明乳化效果越好)相对比，其在静止培养条件下即具有最好的原油乳化效果，这说明在影响趋化性条件中，疏水性可能起着重要的作用。

表3采油菌对原油及液蜡的乳化效果试验结果

步骤二的试验结果表明，采油菌在不同的生长阶段其疏水值是发生变化的(图7)，即在生长迟缓期疏水性较低，至对数期时疏水性达到最大，随着细胞的逐渐衰亡，其疏水性也达到最低点。这种结果也可以解释5种菌在油水中分布及趋向性运动的变化规律：采油菌在油水中的初始分布情况，由于其疏水性不是很强，因而在油水中呈均匀分布，3#菌由于疏水性较低，因而在原油附近分布较少，形成了真空地带；随着细菌的进一步生长，疏水性逐渐提高，使得细菌个体开始向原油方向趋向性运动，最终聚集到原油附近，形成了聚集带。

利用上述试验一的结论，本发明提出如通过干预增强采油菌剂的疏水性，将提高微生物细胞个体向原油运动和聚集的速度从而提升微生物驱油效率。经研究分析，本发明提出的干预方案为向采油菌培养液中添加一定种类和浓度的激活剂和/或Ca²⁺。从而得到新的生物驱油剂。

试验二、采油菌原油趋向性运动的调控试验-不同物质对采油菌原油趋向性的影响

一、不同有机物对采油菌原油趋向性的影响

为了更好地促进采油菌向原油运移及聚集的速度，选取了五种具有表面活性的物质，分别为脂肽(成都诺恩克生物科技有限公司，CASNO：171263-26-6)、糖脂(上海瀚鸿化工有限公司，CASNO：10030-85-0)、吐温-80、酵母粉、石油磺酸盐激活剂，用实施例1的方法对其调控菌种趋向性运动速率的效果进行检测，结果如表4所示。

结果表明，在几种激活剂中，选用脂肽类的激活剂，其作用效果最好，可以有效地促进采油菌种在油水中向原油趋向运动的速度：未加脂肽激活剂的对照样品，由于细菌种类的差异，一般是3-10天形成菌体的聚集过程，而加入脂肽激活剂的样品，能够有效地促进其趋向性运动，1-3天内即可完成其对原油的聚集过程。五种激活剂中，吐温-80的效果略差于脂肽，其次是石油磺酸盐、糖脂、酵母粉，这几种激活剂只对某一种或几种菌种有效，并且其效果不如脂肽激活剂；对于疏水性较强的5#菌，几种激活剂的激活效果不很明显。对于单菌来说，吐温-80、酵母粉对3#菌的促进作用也很强，而对其它菌的效果一般。

表4不同激活剂对促进细菌向原油聚集的效果研究

注：--对细菌向原油运移聚集没有明显的促进作用；+有促进作用；++有较强促进作用

二、脂肽类有机物对采油菌疏水性的影响

从试验一的结果可以看出，采油菌在油水中的分布与细菌的疏水性有关：随着细菌在生长过程中疏水性的逐渐提高，亲水性降低，细菌细胞开始向原油趋向性运动并聚集在原油附近。同时，在培养液中加入有机物，例如脂肽有机物质，能够促进多种类型采油菌向原油的趋向性聚集。

由此，开展了脂肽物质处理采油菌细胞及在不同浓度脂肽条件下，采油菌的疏水性变化及影响研究。

(1)不同浓度脂肽有机物对采油菌疏水性的影响

将菌种3#HX接入LB液体培养基培养12小时至对数生长期后取1mL，以1∶5的体积比稀释，然后每管加入不同浓度的脂肽有机物(粗提物水溶液，加入体积浓度分别为0、2％、4％、8％、16％，20％)，室温振荡后静止1小时，测定菌细胞表面疏水性。

试验结果如图8所示(横坐标为脂肽浓度，纵坐标CSH为疏水性变化)，当加入一定浓度脂肽(2％)时，菌细胞表面疏水性明显提高，但随着脂肽浓度的进一步增加，菌细胞表面疏水性开始降低，直至趋于零。通过文献报导及分析认为，脂肽类有机物具有疏水性基团，当单层的脂肽类有机物分子覆盖菌体细胞表面时，可能是取以疏水端朝外的方式，即细菌表面与水接触的界面为疏水链所取代，使菌体细胞的疏水性增强，当脂肽浓度较低时，由于是单层覆盖，浓度越大，疏水性越强；当脂肽浓度达到一定值时，细胞表面分子饱和，新增的分子将继续覆盖在其它分子上，使疏水链朝外的方式改变为部分或全部以亲水部分朝外的方式，此时细胞变得亲水。

在不同菌株的培养液中加入同一浓度(2％)的脂肽物质，测定其疏水变化。结果如图9所示，除4#菌株有所降低外，其它均有所提高，其中1#、2#、3#菌种增加幅度较大。这表明脂肽类物质的确可以通过改变菌种的疏水性来提高其向原油运动的时间和速率。

三、不同pH值溶液对采油菌疏水性的影响

在15mL的试管中分别加入1mL菌液(培养12小时)与5mL去离子水，配置好的不同pH值的溶液，再加入500ul的十六烷，剧烈振荡1分钟后静置2小时，然后测定CSH。

试验结果如图10所示，在pH值为中性(pH＝7)的条件下，5株菌采油菌的CSH均为最低，疏水性较低；随着pH值的升高或降低，其疏水性逐渐增强，在强酸或强碱性条件下疏水性明显提高。在这5种菌种中，5#LD受pH值的影响较小，当pH值变化范围为4-9之间时，其疏水性的值为31％-37％之间。

四、温度对采油菌细胞疏水性的影响

在15mL的试管中分别加入1mL菌液与5mL去离子水，再加入500ul的十六烷，剧烈振荡1分钟，在不同温度条件下将体系静置2小时，然后测定CSH。

结果如图11所示，通过利用不同的温度对采油菌进行处理，发现随着温度的升高，细胞疏水性逐渐降低。其中，在处理温度为50℃的条件下，4#015菌与5#LD细胞的疏水性最低。

五、不同碳源对采油菌疏水性的影响

检测了采油菌在不同有机碳营养源条件下的疏水性变化情况。试验方法为将采油菌分别加入到葡萄糖、原油、蔗糖为主要有机碳源的营养液中进行培养，取处于对数生长期的菌，测定其疏水性。

试验结果如图12所示，采油菌在三种不同的有机碳源培养条件下，其疏水性是有差异的：以葡萄糖为碳源，菌种的疏水性最强；其次是原油；采油菌在蔗糖中的疏水性最弱。

六、不同无机盐离子对采油菌原油趋向性的影响

在细菌的生长和营养条件中，无机盐离子起着生长调节和代谢控制的作用，为了检测不同离子对采油菌趋向性的影响，选取了四种金属离子Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺和Mn²⁺，将其配制成0.1g/L的溶液，制成载玻密封片，观察细菌的趋向性运动。

结果如表5所示，在试验的四种离子中，Ca²⁺对采油菌的趋化性起促进作用，其影响的结果是使采油菌的细胞个体活跃度提高，细胞体积增大，趋向性聚集明显(如图13所示)；Mg²⁺的影响不大；Zn²⁺和Mn²⁺起抑制作用，导致细胞的运动活跃性降低，且趋于静止，没有最终的趋向性聚集现象，尤其以Zn²⁺最为明显，这有可能是高浓度的重金属离子对微生物生长代谢起到毒副作用。

表5金属离子对采油菌原油趋化性的影响

近几年的研究资料表明，Ca²⁺、cAMP和cGMP对纤毛和鞭毛运动的调控极其重要。纤毛或鞭毛运动是受Ca²⁺的浓度控制的，当其细胞外K⁺浓度下降或Ca²⁺浓度升高都可使细胞膜发生超极化，从而导致细胞内cAMP浓度上升，纤毛或鞭毛拍击频率增加，细胞正趋向、向营养源方向运动。当细胞外K⁺浓度上升或Ca²⁺浓度降低时，cAMP浓度下降，细胞膜去极化，细胞负趋向、向后避开游动。

在分子水平上，细胞中存在一种Ca²⁺结合蛋白(简称CaM)，包含有4个Ca²⁺结合位点，CaM单独存在时不具有活性，当它与3个或4个Ca²⁺结合后，构象发生变化，与受体酶结合形成CaM-Ca²⁺-酶复合物。CaM/Ca²⁺/酶复合物可直接活化细胞质中的ATP酶、核苷酸环化酶和dynein-ATP酶；或间接通过活化蛋白激酶或磷酸酶，来调节纤毛和鞭毛的运动。

七、蔗糖碳源对微生物采油菌原油趋向性的影响

以采油菌种3#HX为试验菌株，在其无机盐培养液中加入不同浓度的蔗糖成分，检测以蔗糖为有机碳源微生物的原油趋化性。

试验结果如图14(培养1h，a：蔗糖浓度1.8％；b：0.18％；c：对照组；d：0.018％)和图15(培养96h，a：蔗糖浓度1.8％；b：0.18％；c：对照组；d：0.018％)所示，不同浓度的蔗糖溶液对采油菌HX具有明显的影响：高浓度的蔗糖溶液(浓度为1.8％)对菌种的繁殖没有作用；而低浓度(蔗糖浓度0.018％)和中等浓度的蔗糖溶液(浓度0.18％)对菌种的繁殖有明显的促进作用，其中，低浓度的溶液作用最好，菌种浓度最大，中等浓度的溶液差于低浓度溶液的效果，但比对照组不加蔗糖和高浓度溶液要好；三种浓度的蔗糖溶液，均没有明显促进菌种向原油聚集的作用。

八、葡萄糖碳源对微生物采油菌原油趋向性的影响

以葡萄糖为碳源，检测了不同浓度葡萄糖溶液对采油菌4#015的繁殖及趋向性的影响。试验仍以无机盐溶液为基础培养基，添加不同浓度的葡萄糖作为有机碳源，观察采油菌种的变化。

试验结果如图16(培养1h，a：葡萄糖浓度1.8％；b：0.18％；c：对照组；d：0.018％)和图17(培养96h，a：葡萄糖浓度1.8％；b：0.18％；c：对照组；d：0.018％)，加入不同浓度的葡萄糖溶液，菌种015发生不同的变化。当加入1.8％、0.18％、0.018％三种浓度的葡萄糖溶液时，菌浓都比不加葡萄糖的要大，其中，0.018％浓度的葡萄糖溶液作用最为明显，细菌繁殖数量最多，浓度为0.18％的次之，浓度为1.8％的培养及中菌种繁殖数量最少。加入三种不同浓度的葡萄糖，对采油菌聚集速率的影响不明显。

综合上述，认为油藏采油微生物有两个途径产生原油趋化性现象，一是疏水途径，二是鞭毛运动途径，在无其它外界因素干扰条件下，这两个途径可能单独或同时发生。因而，要改变或促进微生物的趋化性运动，可以相应通过两种方式：一是改变细菌的疏水性(如加入激活剂、调整碳源种类及浓度、控制pH值及温度)；二是通过分子信号的变化(如加入Ca²⁺)，改变微生物细胞鞭毛或纤毛的摆动状态和摆动频率，调节细菌的趋向性运动(图18)。

以下根据试验二的结果给出本发明优选的实施例。

实施例2、生物驱油剂的制备

本发明提供的生物驱油剂，包括采油菌和培养液，培养液中含有激活剂和Ca²⁺。所述生物驱油剂的具体组成包括：

采油菌：前述1#至5#菌株，菌浓体积百分比在1-5％变化；其中：

1#菌在本发明中代号为DQ，已在专利ZL200810227860.3中公开，为波茨坦短芽孢杆(Brevibacillusborstelensis)Po，该菌株已于2008年06月06日保藏于位于中国北京朝阳区大屯路的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.2441。

3#菌在本发明中代号为HX，已在专利ZL200410038054.3中公开，为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)HP，该菌株已于2004年04月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC№1141。

5#菌在本发明中代号为LD，为铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonasaeruginosa)DQ8，已于2008年08月04日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCCM208114。

碳源：以葡萄糖为基本碳源，质量百分比浓度为0.018-0.18％间变化；

液体培养基的基本无机盐：KH₂PO₄1.5克/升，Na₂HPO₄3克/升，NH₄Cl2.0克/升，NaCl2.0克/升，自来水配制。121℃条件下灭菌20分钟。

Ca²⁺：加入CaCl₂使其终浓度为0.1g/L。

pH值调节组分：用稀盐酸或氢氧化钠调节pH值在5.0-9.0。

激活剂：为五种具有表面活性的物质，分别为脂肽、石油磺酸盐、吐温-80、糖脂和酵母粉中的一种或酵母粉与其它几种激活剂复配使用。

表4生物驱油剂组配

按上述组配将所有组分混合，配制形成系列生物驱油剂。

实施例3、使生物驱油剂进行趋向原油条件的微生物采油

采用人造均质岩心物理模拟驱油模型验证上述驱油剂进行微生物驱油效果，采取以下操作：

将岩心模型抽真空，饱和地层水，计算孔隙体积；然后向模型中饱和原油，建立束缚水，测定模型的含油饱和度；接着用注入水驱替模型中的原油不再出油为止，计算水驱采收率；注入不同体系生物驱油剂，注入体积0.3PV(地层孔隙体积倍数)，然后水驱至含水100％，计算采收率。

使用上述实施例2中1-7号组配的生物驱油剂注入油层实施微生物驱油，结果表明(见表5)，驱油效果均比(基本无机盐组分+菌液)组配的驱油剂提高。

表5不同组配生物驱油剂驱油效果

结论：

1、微生物采油菌在生长过程中，其疏水性发生变化，导致微生物菌体能够主动向原油方向运动；

2、采油菌由于疏水性的逐步提高，最终能够聚集到原油附近，并通过乳化烃或溶解烃为碳营养源进行在位繁殖，也可以直接接触和作用原油；

3、疏水性的大小，体现了微生物趋向并作用原油的速度，一般疏水性大的菌种，其乳化原油的速率也更快；

4、在微生物培养液中添加一定浓度的激活剂，可以增强采油菌的疏水性，并提高微生物细胞个体向原油运动和聚集的速度；

5、在微生物营养液中引入适量的Ca²⁺，可以调节和促进细菌细胞鞭毛或纤毛的摆动，并向原油作趋向性运动；

6、可将细胞疏水性作为筛选和评价微生物采油菌的一种技术方法。

Claims (10)

1.一种生物驱油剂，由采油菌和培养液组成，其特征在于：所述培养液中含有激活剂和Ca²⁺；所述采油菌选自1#DQ(波茨坦短芽孢杆(Brevibacillusborstelensis)CGMCCNo.2441)和5#LD(铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonasaeruginosa)CCTCCNo.208114)；所述激活剂为脂肽、石油磺酸盐、吐温-80、糖脂和酵母粉中的一种或酵母粉与其它几种激活剂复配使用。

2.根据权利要求1所述的生物驱油剂，其特征在于：所述培养液的碳源为葡萄糖，在生物驱油剂中的质量百分比浓度为0.018-0.18％。

3.根据权利要求1或2所述的生物驱油剂，其特征在于：所述采油菌体积百分比1-5％。

4.根据权利要求3所述的生物驱油剂，其特征在于：所述采油菌体积百分比2％。

5.根据权利要求1或2所述的生物驱油剂，其特征在于：在生物驱油剂中，激活剂浓度为0.2-1.3g/L；Ca²⁺浓度为0.1g/L。

6.根据权利要求3所述的生物驱油剂，其特征在于：在生物驱油剂中，激活剂浓度为0.2-1.3g/L；Ca²⁺浓度为0.1g/L。

7.根据权利要求4所述的生物驱油剂，其特征在于：在生物驱油剂中，激活剂浓度为0.2-1.3g/L；Ca²⁺浓度为0.1g/L。

8.根据权利要求1或2所述的生物驱油剂，其特征在于：其由以下终浓度的组分构成：采油菌体积百分比1-5％，葡萄糖质量百分比0.018-0.18％，KH₂PO₄1.5克/升，Na₂HPO₄3克/升，NH₄Cl2.0克/升，NaCl2.0克/升，CaCl₂0.1g/L，激活剂0.2-1.3g/L；自来水配制，pH值5.0-9.0。

9.根据权利要求8所述的生物驱油剂，其特征在于，为KH₂PO₄1.5克/升，Na₂HPO₄3克/升，NH₄Cl2.0克/升，NaCl2.0克/升，CaCl₂0.1g/L，pH值5.0-9.0的水溶液，还含有以下所列组配：

组配一：所述采油菌为1#DQ，菌浓5％；所述葡萄糖浓度为0.18％；所述激活剂为糖脂，浓度为1.0g/L。

10.一种使采油菌种趋向原油条件的微生物采油方法，包括将生物驱油剂注入油层的微生物驱油过程，其特征在于：使用权利要求1至9任一所述的生物驱油剂。