CN101914439A - 用于油田微生物增产或环保的微生物菌剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于油田微生物增产或环保的微生物菌剂的制备方法，复合菌剂由微生物发醇液离心沉淀的菌泥和保护剂复配后干燥而成；每克微生物菌剂中活菌总数为1×10⁹-1×10¹¹个；本发明将单一微生物或复合微生物制备成具有较高活化率的粉剂，以达到增加产品贮存时间，节约运输成本，简化使用方法的目的。该菌剂的制备方法具备操作简单、使用方便、对微生物适用范围广、成本低廉的特点，适合于实验室和规模化生产。

Description

用于油田微生物增产或环保的微生物菌剂的制备方法

技术领域

本发明属于微生物采油技术领域，主要涉及一种用于油气田微生物增产或环保用途的微生物菌粉产品的制备方法，更具体地说是针对用于油田增产或环保的微生物，利用三种不同的保护剂，来制备微生物固体菌剂的技术，并涉及其应用范围。

背景技术

微生物提高原油采收率技术(MEOR技术)，是一种将微生物及营养液注入地层中，通过微生物在地层中生长代谢产生的生物表面活性剂、气体、聚合物、有机酸、有机酮、有机酯等物质来提高原油采收率的方法。自1926年Beckman提出细菌能够采油至今，微生物清蜡和降低重油粘度、微生物选择性封堵地层、微生物吞吐、微生物强化水驱等技术已成为继传统的热驱、化学驱、气驱之后的第四种提高采收率的方法。

为提高微生物的性能及增产效果，传统的微生物驱工艺建议在注入井附近建立适当的微生物培养设备和存储设备，以保证微生物的浓度和活性。这种工艺不仅提高了微生物采油的成本，在实际应用中也是难以实现的。但如果将事先生产好的微生物发酵液或菌泥运输到油田进行施工，由于运输过程中温度、溶氧等条件难以控制，微生物的活性将难以保证，且由于注入量较大，液体发酵液的运输成本也将大大提高。因此使用保护剂对微生物制剂进行处理，将微生物发酵液制成固体菌剂的形式，具有体积小、运输方便、室温下可贮存、活化率高、水溶性好，保质期长，可提高产品性能等优点，是解决上述问题的有效方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种将油田增产或环保用微生物制备成固体菌剂的新方法，具有活化率较高，活化后代谢产物产量较高，保质期较长，运输方便的微生物菌剂制备方法。其具有使用范围广泛、操作简单、成本低、活化率高等优点。

为了实现上述目的，本发明微生物菌剂的制备方法采用冷冻干燥和低温烘干两种方法，包括如下步骤：

1.培养基：选用LB培养基，121℃高压灭菌20min，备用；用于培养微生物的LB培养基按重量百分比由0.2-3％蛋白胨、0.1-2％酵母粉、0.1-3％氯化钠，余量为水组成，自然pH值。

2.摇瓶培养：将目的菌接种到装有LB液体培养基中，进行摇瓶培养，条件为：温度37-60℃，转速100-160rpm，三角瓶装液量20-40％，培养时间12-48h；

3.种子罐发酵，按1-3％的接种量将目的菌的摇瓶菌液移入种子罐，进行发酵培养，条件为：罐温37-60℃，罐压0.02-0.08MPa，通气量1∶1.0-1.5v/v/min，搅拌速度300-400rpm、发酵时间12-24h；

4.发酵罐发酵：按1-15％的接种量将目的菌种子液移至发酵罐，进行发酵培养，条件为：罐温37-60℃，罐压0.02-0.08MPa，通气量1∶1.0-1.5v/v/min，搅拌速度300-400rpm、发酵时间16-24h，使发酵液中菌浓度为1×10¹⁰-1×10¹⁴个/mL；

步骤3和4中微生物发酵培养液按重量比由1-5％葡萄糖、0.1-2％酵母粉、0.1-3％的K₂HPO₄、0.05-0.5％MgSO₄·5H₂O、0.01-0.5％CaCl₂·5H₂O、余量为蒸馏水组成，并调节pH为7.0。

5.菌泥的制备：将发酵好的发酵液在室温，5000-10000rpm的条件下离心10-15min，将离心沉淀物用无菌水洗涤两次，再次离心，即得到菌泥。

6.保护剂配制与灭菌：

1)基于保护剂配方1的保护剂配制与灭菌：

保护剂配方1：按与菌泥所对应的发酵液重量体积比(g/L)：脱脂乳粉质量浓度0.5-2.5，蔗糖质量浓度0.1-1；

灭菌方法：脱脂乳：紫外灭菌30min；蔗糖：121℃高压蒸汽灭菌15min。灭菌后将二者在无菌条件下混合均匀；

2)基于保护剂配方2的保护剂配制与灭菌：

保护剂配方2：按与菌泥所对应的发酵液重量体积比(g/L)：地瓜淀粉质量浓度0.5-2.5，甘油质量浓度0.1-1，碳酸钙质量浓度0.01-0.2；

灭菌方法：121℃高压蒸汽灭菌15min；

3)基于保护剂配方3的保护剂配制与灭菌：

保护剂配方3：按与菌泥所对应的发酵液重量体积比(g/L)：麸皮质量浓度0.1-1，蔗糖质量浓度0.2-1，甘油质量浓度0.05-1；

灭菌方法：121℃高压蒸汽灭菌15min；

7.微生物菌剂的制备：

1)基于保护剂配方1的微生物菌剂制备：将菌泥放入灭菌好的保护剂中，用搅拌器匀速搅拌混合均匀，然后在-10--80℃的环境中预冻2-3h，再在无菌条件下真空冷冻干燥6-48h即可得到微生物冻干菌剂。

2)基于保护剂配方2的微生物菌剂制备：将菌泥放入灭菌好的保护剂中，用搅拌器匀速搅拌混合均匀，然后在-10--80℃的环境中预冻2-3h，再在无菌条件下真空冷冻干燥6-48h即可得到微生物冻干菌剂。

3)基于保护剂配方3的微生物菌剂制备：将菌泥放入灭菌好的保护剂中，用搅拌器匀速搅拌混合均匀，然后将其放置于15-50℃的无菌通风室中通风干燥6-48h，即可得到微生物菌剂。

所述微生物为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，ATCC NO.21332)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，ATCC NO.39307)、节杆菌属石蜡菌(Arthrobacter paraffineus，ATCC NO.19558)、球型芽孢杆菌(Bacillus circulans，ATCC NO.21783)、肠膜明串球菌(Leuconostoc mesenteroides，ATCCNO.14935)、Lactobacillas Confusus(ATCC NO.10881)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus，ATCC NO.10987)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，ATCCNO.9027)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus，ATCC NO.23055)中的一种及多种微生物的混合物。

8.产品质量检验：合格产品中活菌数≥1×10¹⁰个/克。

活菌数的检测方法为稀释平板计数法。具体操作过程如下：①称取微生物菌剂1.0g，加入盛有99mL装有玻璃珠的无菌生理盐水中，按微生物适合的温度不同，于37-60℃振荡培养30min，使菌体均匀分散，制成10^-2的稀释液；②按10倍稀释法进行稀释：取盛有0.9mL无菌生理盐水的1.5mL离心管8支，并依次编号10^-3-10^-10，用无菌移液器吸取0.1mL稀释液到编号为10^-3的离心管中，用漩涡混合器振荡1min，使菌体均匀分散，制成10^-3稀释液，用相同的方法制备10^-3-10^-10稀释液；③用无菌移液器分别吸取0.1mL 10^-8、10^-9、10^-10三个稀释液于相应编号已制备好的LB培养基平板上(每个稀释度做三个平行)，用无菌玻璃涂布棒将平板表面的菌液均匀向四周涂布扩散，至菌液全部被平板吸收，静置30min，将平板倒置于37℃的恒温箱中培养；④12-18h后每一个活菌细胞可以在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落，根据平板上菌落的数目，计算每克混合菌剂中所含的活菌总数，计算公式如下：

每克菌剂中活菌数＝(同一稀释度的3个平板上菌落平均数×稀释倍数)/微生物菌剂克数。

刚刚制备后的每克微生物菌剂中活菌总数为1×10¹⁰-4×10¹⁰个，室温下保存1-2个月每克微生物菌剂中活菌总数为1×10⁹-1×10¹¹个。

本发明公开了一种新型微生物粉剂的制备方法，所制备的微生物菌剂可用于油田微生物增产或环保，所制备菌剂利用三种不同组成的保护剂配方，两种不同的生产方式，将单一微生物或复合微生物制备成具有较高活化率的粉剂，以达到增加产品贮存时间，节约运输成本，简化使用方法的目的。该菌剂的制备方法具备操作简单、使用方便、对微生物适用范围广、成本低廉的特点，适合于实验室和规模化生产。

附图说明

图1冻干前后发酵液中表面活性剂成分高效液相色谱法(HPLC)分析；

图2活化后复合菌降解黄原胶能力曲线；

图3活化后复合菌产生物多糖能力与时间的关系曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本方法进行详细说明。

实施例1：基于单一菌种的微生物菌剂的制备

本实施例所选目的微生物为一株产生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌(ATCC No.21332)，采油工程上可用于微生物驱油。

1、培养基：选用LB培养基，121℃高压灭菌20min，备用；

LB培养基按重量百分比由1％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.5％氯化钠，余量为水组成，自然pH值。

2、摇瓶培养：将目的菌接种到装有LB液体培养基中，进行摇瓶培养，条件为：温度50℃，转速150rpm，三角瓶装液量30％，培养时间12h；

3、种子罐发酵，按2％的接种量将目的菌的摇瓶菌液移入种子罐，进行发酵培养，条件为：罐温50℃，罐压0.06MPa，通气量1∶1.5v/v/min，搅拌速度400rpm、发酵时间24h；

培养基按重量百分比由1％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.5％氯化钠，余量为水组成，自然pH值。

4、发酵罐发酵：按5％的接种量将目的菌种子液移至发酵罐，进行发酵培养，条件为：罐温50℃，罐压0.06MPa，通气量1∶1.5v/v/min，搅拌速度400rpm、发酵时间24h，使发酵液中菌浓度为1×10¹¹个/ml；

发酵罐培养液按重量比由3％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.5％的K₂HPO₄、0.3％MgSO₄.5H₂O、0.3％CaCl₂.5H₂O、余量为水组成，并调节pH为7.0。

5、菌泥的制备：将发酵好的发酵液在室温，8000rpm的条件下离心15min，将离心沉淀物用无菌水洗涤两次，再次离心，即得到菌泥。

6.保护剂配制与灭菌：

保护剂配方1：按与菌泥所对应的发酵液重量体积比(g/L)：脱脂乳粉质量浓度1，蔗糖质量浓度0.5；

灭菌方法：脱脂乳：紫外灭菌30min；蔗糖：121℃高压蒸汽灭菌15min；

7.微生物菌剂的制备：

将菌泥放入灭菌好的保护剂中，用搅拌器匀速搅拌混合均匀，然后在-40℃的环境中预冻2h，再在无菌条件下真空冷冻干燥12h即可得到微生物冻干菌剂。

8.产品质量检验：合格产品中活菌数≥3.5×10¹⁰个/克，活化后发酵液表面张力≤30.17mN/m。

将按实施例1中方法冻干保存的菌粉0.1g，接种于装有100mL LB培养基的250mL锥形瓶中，37℃，160rpm振荡培养24h，转入种子罐中，按实例一2.3.中所述条件进行发酵，采用HPLC法对发酵液中的生物表面活性剂成分进行分析，分析方法为：乙腈∶水＝40∶60，流速：0.5mL/min，紫外检测波长213nm，柱温30℃。所得结果如图1所示，冻干保存对菌种发酵液中的生物表面活性剂的性质和含量影响不大。

实施例2：基于混合菌种的微生物菌剂的制备

本实施例所选目的微生物为枯草芽孢杆菌(ATCC No.21332)、地衣芽孢杆菌(ATCC No.39307)、铜绿假单胞菌(ATCC No.9027)的复合物，这种复合菌具有一定的降解黄原胶能力。

1、培养基：选用LB培养基，121℃高压灭菌20min，备用；

LB培养基按重量百分比由0.8％蛋白胨、0.3％酵母粉、0.5％氯化钠，余量为水组成，自然pH值。

2、摇瓶培养：将目的菌接种到装有LB液体培养基中，进行摇瓶培养，条件为：温度37℃，转速160rpm，三角瓶装液量20％，培养时间12h；

3、种子罐发酵，按3％的接种量将目的菌的摇瓶菌液移入种子罐，进行发酵培养，条件为：罐温37℃，罐压0.08MPa，通气量1.0∶2.0v/v/min，搅拌速度300rpm、发酵时间24h；

培养基按重量百分比由0.8％蛋白胨、0.3％酵母粉、0.5％氯化钠，余量为水组成，自然pH值。

4、发酵罐发酵：按5％的接种量将目的菌种子液移至发酵罐，进行发酵培养，条件为：罐温37℃，罐压0.08MPa，通气量1.0∶2.0v/v/min，搅拌速度300rpm、发酵时间120h，使发酵液中菌浓度为1×10¹¹个/mL；

发酵罐培养液按重量比由3％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.5％的K₂HPO₄、0.3％MgSO₄.5H₂O、0.3％CaCl₂.5H₂O、余量为水组成，并调节pH为7.0。

5、菌泥的制备：将发酵好的发酵液在室温，40000rpm的条件下离心20min，将离心沉淀物用无菌水洗涤两次，再次离心，即得到菌泥。

6.保护剂配制与灭菌：

保护剂配方二：按与菌泥所对应的发酵液重量体积比(g/L)：地瓜淀粉质量浓度1，甘油质量浓度0.2，碳酸钙质量浓度0.05；

灭菌方法：121℃高压蒸汽灭菌15min；

7.微生物菌剂的制备：

将菌泥放入灭菌好的保护剂中，用搅拌器匀速搅拌混合均匀，然后在-40℃的环境中预冻2h，再在无菌条件下真空冷冻干燥12h即可得到微生物冻干菌剂。

8.产品质量检验：合格产品中活菌数≥2.8×10¹⁰个/克，活化后发酵液表面张力≤31.29mN/m，发酵120h黄原胶降粘率可达80％。

将按实施例2中方法冻干保存的菌粉0.1g，接种于装有100mL LB培养基的250mL锥形瓶中，37℃，160rpm振荡培养24h，转入种子罐中，按实例二2.3.中所述条件进行发酵，检测复合菌降解黄原胶的能力，结果如图2所示。由图可见，发酵120h，黄原胶的降粘率可达80％，发酵液中菌浓度为4×10⁹cfu/mL，说明这种菌剂制备方法对菌种活性影响不大。

实施例3：基于混合菌种的微生物菌剂的制备

本实施例所选目的微生物为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，ATCCNO.21332)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，ATCC NO.39307)、节杆菌属石蜡菌(Arthrobacter paraffineus，ATCC NO.19558)的复合物，这种复合菌具有一定的产生生物聚合物能力，在石油开采过程中可用于调剖堵水。

1、培养基：选用葡萄糖2％+基础无机盐培养基，115℃高压灭菌15min，备用；

LB培养基按重量百分比由1％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.5％氯化钠，余量为水组成，pH值6.0。

2、摇瓶培养：将目的菌接种到事先配好的液体培养基中，进行摇瓶培养，条件为：温度60℃，转速160rpm，三角瓶装液量20％，培养时间12h；

3、种子罐发酵，按5％的接种量将目的菌的摇瓶菌液移入种子罐，进行发酵培养，条件为：罐温60℃，罐压0.06MPa，通气量1∶1.5v/v/min，搅拌速度400rpm、发酵时间16h；

培养基按重量百分比由1％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.5％氯化钠，余量为水组成，pH值6.0。

4、发酵罐发酵：按3％的接种量将目的菌种子液移至发酵罐，进行发酵培养，条件为：罐温60℃，罐压0.06MPa，通气量1∶1.5v/v/min，搅拌速度400rpm、发酵时间30h，使发酵液中菌浓度为1×10¹¹个/mL；

发酵罐培养液按重量比由3％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.5％的K₂HPO₄、0.3％MgS0₄.5H₂O、0.3％CaCl₂.5H₂O、余量为水组成，并调节pH为7.0。

5、菌泥的制备：将发酵好的发酵液在室温，4000rpm的条件下离心15min，将离心沉淀物用无菌水洗涤两次，再次离心，即得到菌泥。

6.保护剂配制与灭菌：

保护剂配方3：按与菌泥所对应的发酵液重量体积比(g/L)：麸皮质量浓度0.5，蔗糖质量浓度0.5，甘油质量浓度0.1；灭菌方法：121℃高压蒸汽灭菌15min；

7.微生物菌剂的制备：

将菌泥放入灭菌好的保护剂中，用搅拌器匀速搅拌混合均匀，然后将其放置于40℃的无菌通风室中通风干燥12h，即可得到微生物菌剂。

8.产品质量检验：合格产品中活菌数≥2.0×10¹⁰个/克。多糖产量大于2.5mg/L。

将按实施例2中方法冻干保存的菌粉0.1g，按实施例3中1.2.3.中所述条件进行发酵，检测保护剂中微生物发酵产多糖的能力，结果如图3所示。发酵23h，多糖产量最高，可达到3.0mg/L，菌浓度可达1.0×10¹⁰cfu/mL，说明这种菌剂制备方法对菌种活性及性能影响不大。

Claims (7)

1.用于油田微生物增产或环保的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：

复合菌剂由微生物发酵液离心沉淀的菌泥和保护剂复配后干燥而成；每克微生物菌剂中活菌总数为1×10⁹-1×10¹¹个；

所述保护剂配方为下述三种配方之一：

保护剂配方一：按与菌泥所对应的发酵液重量体积比g/L：脱脂乳粉质量体积浓度0.5-2.5，蔗糖质量体积浓度0.1-1；

保护剂配方二：按与菌泥所对应的发酵液重量体积比g/L：地瓜淀粉质量体积浓度0.5-2.5，甘油质量体积浓度0.1-1，碳酸钙质量体积浓度0.01-0.2；

保护剂配方三：按与菌泥所对应的发酵液重量体积比g/L：麸皮质量体积浓度0.1-1，蔗糖质量体积浓度0.2-1，甘油质量体积浓度0.05-1。

2.根据权利要求1所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述微生物为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，ATCC NO.21332)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，ATCC NO.39307)、节杆菌属石蜡菌(Arthrobacter paraffineus，ATCC NO.19558)、球型芽孢杆菌(Bacillus circulans，ATCCNO.21783)、肠膜明串球菌(Leuconostoc mesenteroides，ATCC NO.14935)、Lactobacillas Confusus(ATCC NO.10881)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus，ATCC NO.10987)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，ATCCNO.9027)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus，ATCC NO.23055)中的一种或多种微生物的混合物。

3.根据权利要求1所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述微生物菌剂按以下步骤进行制备，

①对目的微生物进行摇瓶培养；

②种子罐发酵；

③将微生物转入发酵罐继续培养至菌浓度为1×10¹⁰-1×10¹⁴个/ml；

④按保护剂配方1或保护剂配方2配制保护剂，并将其灭菌；

⑤菌泥的制备：将发酵好的发酵液在室温，5000-10000rpm的条件下离心10-15min，将离心沉淀物用无菌水洗涤两次，离心沉淀物即为菌泥；

将菌泥放入灭菌好的保护剂中，用搅拌器匀速搅拌混合均匀，然后在-10--80℃的环境中预冻2-3h，再在无菌条件下真空冷冻干燥6-48h即可得到微生物冻干菌剂。

4.根据权利要求1所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述微生物菌剂按以下步骤进行制备，

①对目的微生物进行摇瓶培养；②种子罐发酵；③将微生物转入发酵罐继续培养至菌浓度为1×10¹⁰-1×10¹⁴个/mL；

④按保护剂配方3配制保护剂，并将其灭菌；

⑤菌泥的制备：将发酵好的发酵液在室温，5000-10000rpm的条件下离心10-15min，将离心沉淀物用无菌水洗涤1-5次，再次离心，离心沉淀物即为菌泥；

将菌泥放入灭菌好的保护剂中，用搅拌器匀速搅拌混合均匀，然后将其放置于15-50℃的无菌通风室中通风干燥6-48h，即可得到微生物菌剂。

5.根据权利要求3或4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤①中所述微生物在37-60℃、100-160rpm的条件下用LB培养基振荡培养12-48h；用于培养微生物的LB培养基按重量百分比由0.2-3％蛋白胨、0.1-2％酵母粉、0.1-3％氯化钠，余量为水组成，自然pH值。

6.根据权利要求3或4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤②和③中微生物发酵培养液按重量比由1-5％葡萄糖、0.1-2％酵母粉、0.1-3％的K₂HPO₄、0.05-0.5％MgSO₄·5H₂O、0.01-0.5％CaCl₂·5H₂O、余量为蒸馏水组成，并调节pH为7.0。

7.根据权利要求3或4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤④中的灭菌方法为，保护剂2和保护剂3采用121℃，15min高压蒸汽灭菌的方法；保护剂1中的脱脂乳采用紫外灯照射30-60min的灭菌方法，其它组分采用121℃，15min高压蒸汽灭菌的方法，分别灭菌后将各组分在无菌环境下混合均匀。

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