CN104561232A - 一种细菌菌悬液的计数方法 - Google Patents

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樊文燕
顾林
李静
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Abstract

本发明公开了一种细菌菌悬液的计数方法，该方法包括培养基的制备，菌悬液的制备和细菌的培养和计数。本发明在现有技术的基础上，通过大量实验筛选，得到最佳的菌悬液的制备，细菌的培养方法，对比实验结果表明，本发明提供的细菌菌悬液的计数方法，可操作性强，移液准确，混合均匀，混合后细菌一致性好，可以大大提高计数的准确性。采用本发明的方法，平均计数准确率可达到95.0%，相比传统技术方法66.6%的准确率，计数更加准确，为保证药物临床疗效具有重要意义。

Description

一种细菌菌悬液的计数方法
技术领域
本发明涉及一种微生物检测方法，具体涉及一种药物中细菌菌悬液的计数方法。
背景技术
细菌的菌悬液广泛应用于微生物限度检查中。并且《中国药典》微生物限度检查法中明确规定了制成50～100cfu菌悬液方可用于实验，而现有常规法滴管吹散法进行操作时，通过统计发现菌悬液计数准确率仅为66.6％。并不能准确的用于计数，给药物的安全性带来一定的隐患。
因此，为了提高实际细菌计数的准确性，很有必要在现有技术的基础之上，设计研发一种操作合理，可提高细菌计数准确性的细菌菌悬液的计数方法。
发明内容
发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种操作合理，可提高细菌计数准确性，提高药物临床安全性的新的细菌菌悬液的计数方法。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案如下：
一种细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养基的制备
营养肉汤：取干粉培养基，按要求加入纯化水溶解，在110～125℃下灭菌15～30min，调节pH至7.2±0.2；
营养琼脂：取干粉培养基，按要求加入纯化水溶解，在110～125℃下灭菌15～30min，调节pH至7.2±0.2；
(2)菌悬液的制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养18～36小时；分别取上述培养物1～2ml加9～18ml 0.9％无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍递增稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，每步稀释使用移液枪吸取，并且使用自动漩涡仪进行每一稀释级别的混合，制成每1ml含菌数为50～100cfu(cfu为菌落形成单位，即指单位体积中的活菌个数)的菌悬液；
(3)细菌培养和计数
取上述各稀释级别的菌悬液注入无菌平皿中，立即倾注15～20mL营养琼脂培养基，每种菌悬液平行制备2～4个平皿，混匀，凝固，然后30～35℃培养48～72小时，计数。
作为优选方案，以上所述的细菌菌悬液的计数方法，步骤(1)中在121℃下灭菌15min。
作为优选方案，以上所述的细菌菌悬液的计数方法，步骤(2)中，接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养18～24小时；分别取上述培养物1ml，加9ml 0.9％无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍递增稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。
作为优选方案，以上所述的细菌菌悬液的计数方法，步骤(2)中，自动漩涡仪的混漩时间为30秒。本发明通过大量实验筛选，混漩时间，实验结果表明，在自动漩涡仪中混漩30秒后，可以充分使各细菌均匀分布混匀。
作为优选方案，以上所述的细菌菌悬液的计数方法，步骤(2)中移液枪的规格为体积1000μl。采用移液器，移液更加准确，并且采用自动漩涡仪进行混漩，可以很好的保证细菌菌悬液的均匀一，从而可保证计数的准确性，又不会破坏细菌。
作为优选方案，以上所述的细菌菌悬液的计数方法，步骤(3)中加入的营养琼脂培养基的温度为45℃。本发明通过大量实验筛选，在稀释级别的菌悬液中添加入45℃营养琼脂培养基，可以保证细菌的正常生存。
作为优选方案，以上所述的细菌菌悬液的计数方法，步骤(3)中在30～35℃培养48小时。
本发明通过大量实验筛选，使用移液枪移取细菌稀释液，并且采用自动漩涡仪的方法在你优选的时间内混匀，替传统的滴管吹散法，可大大提高细菌的均匀性，提高细菌计数的准确性。
本发明分别从混合的均一性、移液的准确性验证本发明提供的方法和现有技术进行对比，实验结果如下表所示：
一、混合的均匀性
本发明采用紫外分光光度法对同一浓度金黄色葡萄球菌OD600进行测定(OD600即细菌培养液在600nm处的吸光值，得到的OD600的数值如果在0.6～0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期)。
通过对金黄色葡萄球菌OD600的测定，得到表1所示的数据。
表1本发明改进后和现有药典方法改进前对细菌混合的均匀性的实验对比结果
次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
改进前 0.6346 0.6703 0.6453 0.6597 0.6803 0.6369 0.6427 0.6755 0.6833 0.6588
改进后 0.6754 0.6703 0.6735 0.6757 0.6710 0.6693 0.6773 0.6720 0.6733 0.6758
通过使用两种不同方法对同种浓悬液---金黄色葡萄球菌进行OD600的测定，对上述测得的数据进行了方差分析，得到F比＝6.78，从F分布表中可以查出F0.95(1，18)＝4.41，可以看出F比值远大于F标准值，因此两种方法存在差异。
同时从上述数据可以发现混合方法改进前的均值为0.65874，RSD＝2.9％；方法改进后均值为0.67336，RSD＝0.4％。从其均值可以清晰看出采用本发明提供的方法，菌悬液的浓度比较集中，得到的菌悬液混合更加均一。
二、移液的准确性
现有药典方法和本发明提供的方法进行移液准确性的考察，对比实验结果表明，药典传统方法的移液的相对标准偏差RSD为3.1％，本发明的相对标准偏差RSD为0.2％，比现有技术可提高16倍。表明本发明能更好的降低移液过程中的误差，具有移液准确率高的优点。
有益效果：本发明提供的细菌菌悬液的计数方法和现有技术相比具有以下优点：
本发明在现有技术的基础上，通过大量实验筛选，得到最佳的菌悬液的制备，细菌的培养方法，对比实验结果表明，本发明提供的细菌菌悬液的计数方法，可操作性强，移液准确，混合均匀，混合后细菌一致性好，可以大大提高计数的准确性。实验结果表明，采用本发明的方法，平均计数准确率可达到95.0％，相比传统技术方法66.6％的准确率，计数更加准确，为保证药物临床疗效具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
一种细菌菌悬液的计数方法，其包括以下步骤：
(1)培养基的制备
营养肉汤：取干粉培养基，按要求加入纯化水溶解，在121℃下灭菌15min，调节pH使灭菌后为7.2±0.2；
营养琼脂：取干粉培养基，按要求加入纯化水溶解，在121℃下灭菌15min，调节pH使灭菌后为7.2±0.2；
(2)菌悬液的制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养18～36小时；分别取上述培养物1ml加9ml 0.9％无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍递增稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，每步稀释使用移液枪吸取，并且使用自动漩涡仪进行每一稀释级别的混合，制成每1ml含菌数为50～100cfu(cfu为菌落形成单位，即指单位体积中的活菌个数)的菌悬液；
(3)取上述各稀释级别的菌悬液注入无菌平皿中，立即倾注15～20mL温度为45℃营养琼脂培养基，每种菌悬液平行制备2个平皿，混匀，凝固，然后30～35℃培养48小时，计数10次，实验结果如表2所示：
表210次计数的准确率
由表2是实验结果表明，通过10次技术结果表明，采用本发明的提供的细菌菌悬液的计数方法，平均计数准确率达到95.0％以上。
另外，本发明采用药典现有规定的方法对12次计数准确率统计，具体见表3所示：
表3现有计数方法的计数结果
由上表3计数结果表明，现有药典规定方法的计数平均准确率仅为66.6％，因此本发明提供的菌菌悬液的计数方法，相比传统技术方法,计数更加准确，为保证药物临床疗效具有重要意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养基的制备
营养肉汤：取干粉培养基，按要求加入纯化水溶解，在110～125℃下灭菌15～30min，调节pH至7.2±0.2；
营养琼脂：取干粉培养基，按要求加入纯化水溶解，在110～125℃下灭菌15～30min，调节pH至7.2±0.2；
(2)菌悬液的制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养18～36小时；分别取上述培养物1～2ml加9～18ml0.9％无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍递增稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，每步稀释使用移液枪吸取，并且使用自动漩涡仪进行每一稀释级别的混合，制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液；
(3)细菌培养和计数
取上述各稀释级别的菌悬液注入无菌平皿中，立即倾注15～20mL营养琼脂培养基，每种菌悬液平行制备2～4个平皿，混匀，凝固，然后30～35℃培养48～72小时，计数。
2.根据权利要求1所述的细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，步骤(1)中在121℃下灭菌15min。
3.根据权利要求1所述的细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，步骤(2)中，接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养18～24小时；分别取上述培养物1ml，加9ml0.9％无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍递增稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。
4.根据权利要求1所述的细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，步骤(2)中，自动漩涡仪的混漩时间为30秒。
5.根据权利要求1所述的细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，步骤(2)中移液枪的规格为1000μl体积。
6.根据权利要求1所述的细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，步骤(3)中加入的营养琼脂培养基的温度为45℃。
7.根据权利要求1所述的细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，步骤(3)中在30～35℃培养48小时。
8.根据权利要求1所述的细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，步骤(3)中所述的计数方法为移液器加入法。
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