CN110951822A - 一种适用于药敏板的细菌药敏检测方法 - Google Patents

一种适用于药敏板的细菌药敏检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于药敏板的细菌药敏检测方法，属于细菌药物敏感性检测技术领域。本发明公开的用于检测细菌对药物敏感性的药敏板，包被有适用于细菌药敏试验的药物；药物浓度为标准菌株的最小抑菌浓度或以标准菌株最小抑菌浓度为标准的梯度浓度。适用于药敏板的细菌药敏检测方法，包括确定适用于药敏试验的初始菌液吸光度，进行细菌药敏检测。本发明提供的药敏板及药敏检测方法，操作简便价格适中，不仅适用于基层兽医高效精准的选择治疗药物，也能用于科研试验中对大批量样本的耐药情况统计，具有广泛应用价值。

Description

一种适用于药敏板的细菌药敏检测方法
技术领域
本发明涉及细菌药物敏感性检测技术领域，更具体的说是涉及一种适用于药敏板的细菌药敏检测方法。
背景技术
细菌耐药性是自人类发现并广泛应用抗生素后便存在的问题，有些菌株对某些抗生素具有天然耐药性，有些菌株则是在外界环境压力下自身产生或获得了耐药性。粗放型的用药方式不仅会导致抗生素的滥用，更会进一步加重耐药菌株产生的速度和菌株的多重耐药性，因此，治疗细菌性疾病前进行药敏试验是至关重要的。
但目前市面上常见、常用的药敏试验用试剂种类少、样式单一、操作繁琐且实验结果不够精确，如纸片法操作繁琐，大样本检测时操作耗时费力，而且只能得到基本的敏感、中介及耐药三种结果，不能给出药物对细菌的准确抑菌率，只能作为治疗用药的基本指导不能适应更复杂科学研究的需要，因此药敏纸片难以满足大批量菌株药敏试验的需求。现有药敏板种类少，进口药敏板需要同时购买大型细菌分析仪才能使用，难以应用到常规实验室的检测。因此，提供一种能够快速、便捷检测大量细菌对药物敏感性的细菌药敏检测方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种适用于药敏板的细菌药敏检测方法，本发明提供的药敏板，解决了市面上药敏检测用试剂品种单一、检测大量细菌药敏时操作繁琐耗时长的问题；本发明检测方法可通过酶标仪读取吸光度的方式直接判定药物对细菌的抑菌效果，并应用公式计算药物对细菌的具体抑菌率；本发明提供的药敏板及药敏检测方法，操作简便价格适中，不仅适用于基层兽医高效精准的选择治疗药物，也能用于科研试验中对大批量样本的耐药情况统计，具有广泛应用价值。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种适用于所述药敏板的细菌药敏检测方法，具体步骤如下：
(1)确定适用于药敏试验的初始菌液吸光度：
①菌液准备：挑取标准菌株于液体LB培养基中，37℃，180rpm震荡培养16h；
②菌液稀释：将上一步的菌液进行倍比稀释，使用麦氏比浊管进行比浊，得到符合2～0.5麦氏比浊度的菌液，之后吸取0.5麦氏比浊度的菌液进行百倍稀释和万倍稀释，共得到2、1.5、1、0.5、0.5×10-2、0.5×10-46个浓度梯度的菌液，于630nm下测定吸光度；
③制备LB固体培养基：配制LB固体培养基，调节培养基pH至7.0～7.4， 121℃高压15min，待温度降至50～60℃备用；
④细菌计数：无菌条件下吸取500μL测定吸光度的菌液于9cm细菌培养皿，与4.5mLLB固体培养基充分混匀，等待凝固后倒置于37℃培养箱中培养；记录2、1.5、1、0.5、0.5×10-2、0.5×10-46个浓度梯度菌液的菌落数，与其在630nm下的吸光度进行对应，绘制菌液浓度-吸光度线性关系曲线；
⑤确定菌液与吸光度呈线性相关的浓度范围，选择吸光度值为0.2～0.4的菌液浓度作为药敏试验的推荐菌液稀释起始浓度；
(2)进行细菌药敏检测：
①制备待测菌液并稀释，调整吸光度为0.2～0.4；
②药敏板加样：向检测孔和阳性对照孔内加入待测菌液，空白对照孔内加入液体LB培养基，阴性对照孔内加入灭活待测菌液；将药敏板置于37℃培养箱中培养10～12h；
③结果判定：将培养后的药敏板置于酶标仪中，630nm下测定各孔吸光度，依据抑菌率(％)＝[(A阳-A阴)-(A样-A阴)]/(A阳-A阴)×100％公式对药物抑菌效果进行判定：抑菌率>90％，细菌对板内包被药物敏感性为敏感； 90％>抑菌率>80％，细菌对板内包被药物敏感性为中介；抑菌率<80％，细菌对板内药物敏感性为耐药；
若不计算抑菌率，则通过A样<A阴或A阳>A样>A阴且孔内液体澄清，直接眼观判定孔内药物对待测细菌是否具有良好抑制效果。
进一步，步骤(1)①中所述标准菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。
进一步，步骤(2)①制备待测菌液并稀释，调整吸光度为0.2～0.4的具体步骤如下：
a.病料采集：用已消毒的剪刀、镊子采集1g病变部位深层组织/粪便或 100μL血样/水样于装有液体增菌培养基的离心管，37℃、180rpm震荡培养16h 或每隔30min-1h用力震荡离心管数次直到液体混浊；
b.细菌分离鉴定：无菌条件下，取1接菌环菌液均匀涂布各种细菌的分离鉴别培养基，37℃培养箱中培养12h；
所用细菌分离鉴定培养基包括：大肠埃希菌麦康凯琼脂培养基，金黄色葡萄球菌BP琼脂培养基，KF链球菌琼脂培养基；
c.增菌培养：挑取分离鉴别培养基上符合特征的菌落，于对应细菌液体增菌培养基中，37℃、180rpm震荡培养16h或每隔30min-1h用力震荡离心管数次直到液体混浊；
所用细菌增菌培养基包括：液体LB培养基，肉浸液肉汤培养基，脑心浸液肉汤培养基；
d.菌液稀释：使用液体LB培养基对上一步得到的菌液进行稀释，使用酶标仪测定稀释后菌液在630nm下的吸光度，调整吸光度为0.2～0.4；取100μL 稀释后菌液与10mL液体LB培养基混合均匀，配成待测稀释后菌液。
进一步，步骤(2)②药敏板加样的具体步骤如下：
根据药敏板检测孔、空白对照孔、阴性对照孔和阳性对照孔的要求，向检测孔和阳性对照孔内加入100μL待测稀释后菌液(细菌数约为1×106，吸光度0.04～0.06)，空白对照孔内加入100μL稀释用液体LB培养基，阴性对照孔内加入100μL灭活待测稀释后菌液；将药敏板置于37℃培养箱中培养 10～12h。
阳性对照：对于多菌株的检测需求，可将待测菌株菌液混合后，加入阳性对照孔中(如，同时测8株大肠埃希菌的耐药性，则在向检测孔中加完对应菌液后，每种菌液吸取200μL至干净离心管或其他灭菌后容器中，充分混匀，再将混合的菌液吸取200μL分别加入两个阳性对照孔)。
阴性对照：用于排除死亡菌体沉淀对吸光度造成的影响和抑菌率的计算，所以加入的是当次检测菌株灭活后的菌液(与阳性对照相同，若检测多株菌，则将各份菌液均吸出200μL，混合后灭活，然后从灭活混合菌液中吸取200μL 分别加入两个阴性对照孔)。
空白对照孔加入的是摇菌用培养基，目的是排除液体培养基被不当操作污染给实验结果带来的影响。
进一步，步骤(2)③结果判定的条件为：
a.阳性对照孔吸光度大于0.2，阴性对照孔吸光度与初始菌液吸光度误差在0.02范围内，空白对照孔吸光度小于阴性对照孔吸光度，在对照孔吸光度符合要求的情况下才能准确计算检测孔抑菌率；
b.若不需计算准确抑菌率，使用96孔板进行稀释法测定药物最小抑菌浓度时，通过眼观判定液体澄清孔，以孔内药物浓度做药物的最小抑菌浓度；使用药敏板进行多种药物对细菌抑菌效果判定时，选择吸光度值不大于空白对照孔、眼观液体澄清孔内包被药物作为最合适治疗用药。
进行结果判定时，阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔需满足如下要求：空白对照孔内液体应眼观澄清透明，且吸光度值小于阴性对照孔；阳性对照孔内液体应眼观浑浊，且吸光度值大于阴性对照孔；阴性对照孔吸光度值应符合菌液初始吸光度范围。
根据上述结果判定得出的结论，可给出如下给药建议：综合考虑检测细菌的常用治疗药物、动物的用药史、药价、给药方式和药物使用及药物残留限定等因素，选择眼观液体澄清孔、吸光度A样<A阴孔或抑菌率在80％以上检测孔内包被药物作为治疗药物。
进一步，所述药敏板包括检测孔、阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔；所述检测孔包被有适用于细菌药敏试验的药物；所述药物浓度为标准菌株的最小抑菌浓度或以标准菌株最小抑菌浓度为标准的梯度浓度。
进一步，所述药敏板包括板体和板盖；所述板体包括检测孔、阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔；所述板盖标识有与所述板体相对应的检测孔及药物浓度、阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔。
优选地，所述药敏板应包括：a.板盖，标有检测孔、空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔；其中检测孔应标注包被了何种药物；b.板体：设有检测孔、空白对照孔、阳性对照孔及阴性对照孔，其中检测孔内包被有常用治疗革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌感染的药物，若检测大量样本对多种药物的敏感性，可选择包被有多种药物且药物浓度为标准菌株最小抑菌浓度(MIC) 的药敏板，若检测少量样本对多种药物的耐药程度，选择包被有多种药物且药物浓度呈梯度的药敏板。
进一步，药敏板的制备方法，具体步骤如下：
①配置药液：按照药敏板板盖标示浓度，使用对应溶剂稀释药物纯粉至百倍使用浓度，作为配置药敏板的药物原液，存储于-20℃；
各药物对应的溶剂如下：
药物 溶剂 药物 溶剂 药物 溶剂
阿莫西林 水 庆大霉素 水 多西环素 稀盐酸
氟苯尼考 二甲基亚砜 恩诺沙星 稀盐酸 甲氧苄啶 稀盐酸
土霉素 稀盐酸 硫酸链霉素 水 环丙沙星 水
替米考星 水 硫酸新霉素 水
②稀释药液：使用鼠尾草酚抗氧化包被液将药液在低温(16℃左右)条件下，稀释到药敏板板盖标示浓度；
③将稀释后的药液加入药敏板板体的检测孔中，每孔加100μL药液，用于制备多样本药敏板；或者将稀释后的药液加入到药敏板板体的其中一排检测孔中，之后用抗氧化包被液对该排孔内药液进行2倍倍比稀释至药敏板板体的其他排，用于制备MIC药敏板；
④药敏板干燥：将加入药液后的药敏板置于50～60℃真空干燥箱中干燥 10h；
⑤干燥后的药敏板使用真空包装机包装，于-20℃冰箱中保存。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种药敏板及适用于药敏板的细菌药敏检测方法，与常规药敏纸片法相比，使用本发明药敏板检测细菌耐药性消耗材料更少，且操作耗费时间短；并且药敏板中不同的药物浓度不仅能够检测细菌对药物的敏感性，更能进一步确定野生菌株的MIC，对后续治疗用药有一定指导意义。基于药敏板的细菌药敏检测方法为药敏板结果的观测和计算提供了基础，让药敏板不仅能够用于兽医临床对致病菌的药敏检测，而且能够用于科学研究中大批量样本耐药情况分析。采用本发明检测方法，加入菌液后仅需要12个小时即可完成检测，根据检测结果进行选药和相应的预防与治疗，操作简便，成本低，适用畜禽养殖基层作为防治细菌性疾病的选药工作及环境中细菌耐药性的调查工作，对保护生态环境起到积极作用。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于检测细菌对药物敏感性的药敏板，药敏板包括：
a.板盖，标有检测孔、空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔；其中检测孔标注包被了何种药物；
b.板体：设有检测孔、空白对照孔、阳性对照孔及阴性对照孔，其中检测孔内包被有常用治疗革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌感染的药物，若检测大量样本对多种药物的敏感性，可选择包被有多种药物且药物浓度为标准菌株最小抑菌浓度(MIC)的药敏板，若检测少量样本对多种药物的耐药程度，选择包被有多种药物且药物浓度呈梯度的药敏板。
以常规96孔板制备的药敏板为例，检测大量样本对多种药物的敏感性，选择包被有多种药物且药物浓度为标准菌株最小抑菌浓度(MIC)的药敏板，其药敏板板盖标识如下：
大肠埃希菌·多样本检测药敏板板盖(μg/mL)
Figure RE-GDA0002374727310000071
注：板盖标识数字为本列药物在药敏板内的包被浓度(单位：μg/mL)，为标识药物对大肠埃希菌ATCC 25922的最小抑菌浓度。
多样本检测药敏板板体如下：
大肠埃希菌·多样本检测药敏板板体
Figure RE-GDA0002374727310000072
注：其中A1-H11范围(共计88孔)为检测孔，包被有药敏试验用抗生素，A排药物浓度为本列包被药物的统一浓度，为包被药物对大肠埃希菌 ATCC 25922的最小抑菌浓度(CLSI标准)，本板可同时检测最多8株不同菌株对11种抗菌药物的敏感性。A12-B12为药敏板的空白对照孔，D12-E12 为药敏板的阴性对照孔，G12-H12为药敏板的阳性对照孔。阳性对照为待测菌液(用于确保菌种存活)，阴性对照为灭活待测菌液，空白对照为液体LB 培养基。
以常规96孔板制备的药敏板为例，检测少量样本对多种药物的耐药程度，选择包被有多种药物且药物浓度呈梯度的药敏板，其药敏板板盖标识如下：
大肠埃希菌·MIC检测药敏板板盖(μg/L)
Figure RE-GDA0002374727310000081
MIC检测药敏板板体如下：
大肠埃希菌·MIC检测药敏板板体
Figure RE-GDA0002374727310000082
注：其中A1-H11范围(共计88孔)为检测孔，包被有药敏试验用抗生素，其中，F1-F11孔内抗生素药物含量为各列抗生素对大肠埃希菌ATCC 25922的最小抑菌浓度(单位：μg/mL)，各列其他孔内药物浓度均为以F孔为标准，自上而下2倍倍比稀释所得。A12-B12为药敏板的空白对照孔， D12-E12为药敏板的阴性对照孔，G12-H12为药敏板的阳性对照孔。阳性对照为待测菌液，阴性对照为灭活待测菌液，空白对照为液体LB培养基。
上述检测孔中包被的药物可以根据需要替换成其他药物，上述内容仅用于列举实例，并不用于限定本发明的保护范围。
实施例2
多样本药敏板的制备方法，具体步骤如下：
①配置药液：按照药敏板板盖标示浓度，使用对应溶剂稀释药物纯粉至百倍使用浓度，作为配置药敏板的药物原液，存储于-20℃；
②稀释药液：使用鼠尾草酚抗氧化包被液(使用无水乙醇溶解鼠尾草酚，配制好的溶液中鼠尾草酚浓度为0.2mg/mL，溶液除菌过滤后，得到包被液) 将药液在低温(16℃左右)条件下，稀释到药敏板板盖标示浓度，并加入药敏板板体的检测孔中，每孔加100μL药液；
③药敏板干燥：将加入药液后药敏板置于50～60℃真空干燥箱中干燥10h；
④彻底干燥后的药敏板使用真空包装机包装，于-20℃冰箱中保存。
实施例3
MIC药敏板的制备方法，具体步骤如下：
①配置药液：按照药敏板板盖标示浓度，使用对应溶剂稀释药物纯粉至 10倍标示浓度，作为配置药敏板的药物原液，存储于-20℃；
②稀释药液：使用鼠尾草酚抗氧化包被液将药液在低温(16℃左右)条件下，稀释到药敏板板盖标示浓度，并加入药敏板板体的A排药物孔中，每孔加200μL药液，之后用抗氧化包被液对A排孔内药液进行2倍倍比稀释至 H排；
③药敏板干燥：将加入药液后的药敏板置于50～60℃真空干燥箱中干燥 10h；
④彻底干燥后的药敏板使用真空包装机包装，于-20℃冰箱中保存。
实施例4
一种适用于药敏板的细菌药敏检测方法，包括：
(1)确定适用于药敏试验的初始菌液吸光度：
①菌液准备：挑取生长于麦康凯固体培养基的大肠埃希菌ATCC 25922 于LB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养16h；
②菌液稀释：将上一步的菌液进行倍比稀释，使用麦氏比浊管进行比浊，得到符合2～0.5麦氏比浊度的菌液，之后吸取0.5麦氏比浊度的菌液进行百倍稀释和万倍稀释，共得到2、1.5、1、0.5、0.5×10-2、0.5×10-46个浓度梯度的菌液，于630nm下测定吸光度；
③制备LB固体培养基：配制LB固体培养基，调节培养基pH至7.0～7.4，121℃高压15min，待温度降至50～60℃备用；
④细菌计数：无菌条件下吸取500μL测定吸光度的菌液于9cm细菌培养皿，与4.5mLLB固体培养基充分混匀，等待凝固后倒置于37℃培养箱中培养；记录2、1.5、1、0.5、0.5×10-2、0.5×10-46个浓度梯度菌液的菌落数，与其在630nm下的吸光度进行对应，绘制菌液浓度-吸光度线性关系曲线；
⑤确定菌液与吸光度呈线性相关的浓度范围，选择在630nm下吸光度值为0.2～0.4的菌液浓度作为药敏试验的推荐菌液稀释起始浓度；
(2)进行细菌药敏检测：
①病料采集：用已消毒的剪刀、镊子采集1g病变部位深层组织/粪便或 100μL血样/水样于装有液体增菌培养基的离心管，37℃、180rpm震荡培养16h 或每隔30min-1h用力震荡离心管数次直到液体混浊；
②细菌分离鉴定：无菌条件下，取1接菌环菌液均匀涂布各种细菌的分离鉴别培养基，37℃培养箱中培养12h；
③增菌培养：挑取分离鉴别培养基上符合特征的菌落，于对应细菌液体增菌培养基中，37℃、180rpm震荡培养16h或每隔30min-1h用力震荡离心管数次直到液体混浊；
④菌液稀释：使用液体LB培养基对上一步得到的菌液进行稀释，使用酶标仪测定稀释后菌液在630nm下的吸光度，调整吸光度为0.2～0.4；取100μL 稀释后菌液与10mL液体LB培养基混合均匀，配成初始菌悬液，吸取100μL 配置好的菌悬液(细菌数约为1×106，吸光度0.04～0.06)加入到药敏板内；
⑤药敏板加样：根据药敏板检测孔、空白对照孔、阴性对照孔和阳性对照孔的要求，向检测孔和阳性对照孔内加入100μL待测稀释后菌液，空白对照孔内加入100μL稀释用液体LB培养基，阴性对照孔内加入100μL灭活待测稀释后菌液；全部液体加完后药敏板置于37℃培养箱中培养10～12h；
⑥结果判定：将上一步培养后的药敏板置于酶标仪中，630nm下测定各孔吸光度，依据抑菌率(％)＝[(A阳-A阴)-(A样-A阴)]/(A阳-A阴)×100％，对药物抑菌效果进行判定：抑菌率>90％，细菌对板内包被药物敏感性为敏感； 90％>抑菌率>80％，细菌对板内包被药物敏感性为中介；抑菌率<80％，细菌对板内药物敏感性为耐药；
若不计算抑菌率，则可通过A样<A阴或A阳>A样>A阴且孔内液体澄清，直接眼观判定孔内药物对待测细菌具有良好抑制效果。
细菌分离鉴定培养基为大肠埃希菌麦康凯琼脂培养基，麦康凯琼脂培养基包括以下组分：蛋白胨20.0g/L、乳糖10.0g/L、牛胆盐5.0g/L、氯化钠5.0g/L、中性红0.075g/L以及琼脂13.0g/L，培养基煮沸冷却后调节pH值为7.2～7.6。配制的麦康凯琼脂培养基制作麦康凯琼脂平板的操作如下：配置好的麦康凯琼脂培养基121℃高压灭菌15min，紫外下放置冷却至60℃时倾倒于一次性平皿中(每皿倾倒15～20mL)，培养基凝固后既成麦康凯琼脂平板。
细菌增菌培养基为液体LB培养基，包括以下组分：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L，培养基煮沸冷却后调节pH值为7.0～7.4，之后121℃高压灭菌15min，紫外下放置冷却至室温，一瓶5mL分装入高压灭菌后的玻璃瓶中并用封口膜密封。
对比例
利用多样本检测药敏板与商品化药敏纸片，检测7株野生菌株对11种抗菌药物的敏感性，同时以标准菌株药敏结果作为药敏板与商品化纸片的效果控制组；
纸片法药敏结果如下(敏感—S，中介—I，耐药—R)：
Figure RE-GDA0002374727310000111
应用本发明的检测方法计算得各孔药物的抑菌率(％)为：
Figure RE-GDA0002374727310000121
注：表中最后一列为对照列，对照列吸光度值均为两对照孔吸光度的平均值。其中空白对照孔(A12-B12)内加入的是稀释菌液用的液体LB培养基，测定吸光度为0.0418，阴性对照孔(D12-E12)内加入的是100μL灭活菌液，测定吸光度为0.0874，阳性对照孔(G12-H12)内加入的是100μL待测菌液，吸光度为0.4216。抑菌率(％)＝[(A阳-A阴)-(A样-A阴)]/(A阳-A阴)×100％。抑菌率>90％，细菌对板内包被药物敏感性为敏感(S)；90％>抑菌率>80％，细菌对板内药物敏感性为中介(I)；抑菌率<80％，细菌对板内包被药物敏感性为耐药(R)。
经验证，使用本发明计算得到的抑菌率与商品化药敏纸片得到的细菌敏感性结果一致，建立的适用于药敏板的细菌药敏检测方法具有很强实用性。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种适用于药敏板的细菌药敏检测方法，其特征在于，包括：
(1)确定适用于药敏试验的初始菌液吸光度：
①菌液准备：挑取标准菌株于液体LB培养基中，37℃，180rpm震荡培养16h；
②菌液稀释：将上一步的菌液进行倍比稀释，使用麦氏比浊管进行比浊，得到符合2～0.5麦氏比浊度的菌液，之后吸取0.5麦氏比浊度的菌液进行百倍稀释和万倍稀释，共得到2、1.5、1、0.5、0.5×10-2、0.5×10-46个浓度梯度的菌液，于630nm下测定吸光度；
③制备LB固体培养基：配制LB固体培养基，调节培养基pH至7.0～7.4，121℃高压15min，待温度降至50～60℃备用；
④细菌计数：无菌条件下吸取500μL测定吸光度的菌液于9cm细菌培养皿，与4.5mL LB固体培养基充分混匀，等待凝固后倒置于37℃培养箱中培养；记录2、1.5、1、0.5、0.5×10-2、0.5×10-46个浓度梯度菌液的菌落数，与其在630nm下的吸光度进行对应，绘制菌液浓度-吸光度线性关系曲线；
⑤确定菌液与吸光度呈线性相关的浓度范围，选择吸光度值为0.2～0.4的菌液浓度作为药敏试验的推荐菌液稀释起始浓度；
(2)进行细菌药敏检测：
①制备待测菌液并稀释，调整吸光度为0.2～0.4；
②药敏板加样：向检测孔和阳性对照孔内加入待测菌液样品，空白对照孔内加入液体LB培养基，阴性对照孔内加入灭活待测菌液；将药敏板置于37℃培养箱中培养10～12h；
③结果判定：将培养后的药敏板置于酶标仪中，630nm下测定各孔吸光度，依据抑菌率(％)＝[(A阳-A阴)-(A样-A阴)]/(A阳-A阴)×100％公式对药物抑菌效果进行判定：抑菌率>90％，细菌对板内包被药物敏感性为敏感；90％>抑菌率>80％，细菌对板内包被药物敏感性为中介；抑菌率<80％，细菌对板内药物敏感性为耐药；
若不计算抑菌率，则通过A样<A阴或A阳>A样>A阴且孔内液体澄清，直接眼观判定孔内药物对待测细菌是否具有良好抑制效果。
2.根据权利要求1所述的一种适用于药敏板的细菌药敏检测方法，其特征在于，步骤(1)①中所述标准菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。
3.根据权利要求1所述的一种适用于药敏板的细菌药敏检测方法，其特征在于，步骤(2)①制备待测菌液并稀释，调整吸光度为0.2～0.4的具体步骤如下：
a.病料采集：用已消毒的剪刀、镊子采集1g病变部位深层组织/粪便或100μL血样/水样于装有液体增菌培养基的离心管，37℃、180rpm震荡培养16h或每隔30min-1h用力震荡离心管数次直到液体混浊；
b.细菌分离鉴定：无菌条件下，取1接菌环菌液均匀涂布各种细菌的分离鉴别培养基，37℃培养箱中培养12h；
c.增菌培养：挑取分离鉴别培养基上符合特征的菌落，于对应细菌液体增菌培养基中，37℃、180rpm震荡培养16h或每隔30min-1h用力震荡离心管数次直到液体混浊；
d.菌液稀释：使用液体LB培养基对上一步得到的菌液进行稀释，使用酶标仪测定稀释后菌液在630nm下的吸光度，调整吸光度为0.2～0.4；取100μL稀释后菌液与10mL液体LB培养基混合均匀，配成待测稀释后菌液。
4.根据权利要求1所述的一种适用于药敏板的细菌药敏检测方法，其特征在于，步骤(2)②药敏板加样的具体步骤如下：
根据药敏板检测孔、空白对照孔、阴性对照孔和阳性对照孔的要求，向检测孔和阳性对照孔内加入100μL待测稀释后菌液，空白对照孔内加入100μL稀释用液体LB培养基，阴性对照孔内加入100μL灭活待测稀释后菌液；将药敏板置于37℃培养箱中培养10～12h。
5.根据权利要求1所述的一种适用于药敏板的细菌药敏检测方法，其特征在于，步骤(2)③结果判定的条件为：
a.阳性对照孔吸光度大于0.2，阴性对照孔吸光度与初始菌液吸光度误差在0.02范围内，空白对照孔吸光度小于阴性对照孔吸光度，在对照孔吸光度符合要求的情况下才能准确计算检测孔抑菌率；
b.若不需计算准确抑菌率，使用稀释法测定药物最小抑菌浓度时，通过眼观判定液体澄清孔，以孔内药物浓度做药物的最小抑菌浓度；使用药敏板进行多种药物对细菌抑菌效果判定时，选择吸光度值不大于空白对照孔、眼观液体澄清孔内包被药物作为最合适治疗用药。
6.根据权利要求1所述的一种适用于药敏板的细菌药敏检测方法，其特征在于，所述药敏板包括检测孔、阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔；所述检测孔包被有适用于细菌药敏试验的药物；所述药物浓度为标准菌株的最小抑菌浓度或以标准菌株最小抑菌浓度为标准的梯度浓度。
7.根据权利要求6所述的一种适用于药敏板的细菌药敏检测方法，其特征在于，所述药敏板包括板体和板盖；所述板体包括检测孔、阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔；所述板盖标识有与所述板体相对应的检测孔及药物浓度、阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔。
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CN113584119A (zh) * 2021-07-26 2021-11-02 郑州安图生物工程股份有限公司 一种快速检测混合菌药敏信息的方法
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