CN109207554B - 用ttc琼脂培养基快速检测日化产品抑菌效果的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于日用品技术领域，具体是涉及一种用TTC琼脂培养基快速检测日化产品抑菌效果的方法。用0.02mg/mLTTC琼脂培养基快速评价日化产品的抑菌效果，其将48h的抑菌效果评价实验缩短到24h报出结果，具有快速检测的意义。本发明采用的方法步骤为（1）不同的灭菌方式对TTC的影响；（2）不同浓度TTC显色培养基对阳性菌的影响；（3）TTC显色培养基在日化产品抑菌效果检测中的应用。本发明根据TTC可被活细胞中的脱氢酶还原生成三苯甲臜类物质而沉积,使细胞显示出相应的红色或紫色的原理，在24h培养观察的回收菌数与48h培养观察的回收菌数结果无明显差异。
Description
一、技术领域：
本发明属于日用品技术领域，具体是涉及一种用TTC琼脂培养基快速检测日化产品抑菌效果的方法。
二、背景技术：
洗涤剂抑菌性能测试方法主要为GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》、QB/T 2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》和卫法监发[2002]282号《消毒技术规范》[2002年版]。采用悬液法对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌进行抑菌性能测定时，三种方法均需在35℃±2℃培养48h计算回收菌数。平板计数法计数准确、可靠度高、成本低，但因需要进行细菌培养，检测耗时长、效率低。《化妆品安全技术规范》(2015版)菌落总数的检验方法中，可在每100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1mL，0.5％TTC溶液。实验发现此添加量对金黄色葡萄球菌有抑制生长现象。
三、发明内容
有鉴于此，本发明的提供一种日化产品抑菌效果快速检测方法，用0.02mg/mLTTC琼脂培养基快速评价日化产品的抑菌效果，其将48h的抑菌效果评价实验缩短到24h报出结果，具有快速检测的意义。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：用TTC琼脂培养基快速检测日化产品抑菌效果的方法，其特征在于：所述的方法步骤为：
S1.不同的灭菌方式对TTC的影响：
配制质量百分比0.1％TTC溶液500mL，分装于3个螺口玻璃瓶中，分别采用单独避光高压灭菌，再与50℃营养琼脂混匀制得培养基A；经0.45um微孔滤膜过滤除菌后，再与50℃营养琼脂混匀制得培养基B；加入营养琼脂混匀高压灭菌制得培养基C；分别将培养基A、B、C与对照组营养琼脂培养基进行大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌回收菌数对比验证，确定配制培养基A的配制方法进行S2试验；
S2.不同浓度TTC显色培养基对阳性菌的影响：
按照培养基A的配制方法配制TTC系列梯度的营养琼脂5瓶，各瓶含TTC的浓度依次为0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL；
S3.按照QB/T 2738-2012方法，无菌操作取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的24h新鲜培养物，分别制备阳性菌悬液；
S4.吸取0.1mL的金黄色葡萄球菌菌悬液，加入到含5.0mLPBS的试管中，迅速混匀后，取混合液0.5mL加入到4.5mLPBS试管中，做梯度稀释，取其中2～3个稀释度的稀释液，吸取0.5mL置于灭菌平皿内,分别倾注S2中的5瓶营养琼脂中各2个平皿，摇匀待冷却后翻转平皿至36℃±1℃培养48h，以营养琼脂培养的回收菌数作为对照，以平板菌落数在30～300的范围计数；
吸取0.1mL的大肠埃希菌菌悬液，加入到含5.0mLPBS的试管中，迅速混匀后，取混合液0.5mL加入到4.5mLPBS试管中，做梯度稀释，取其中2～3个稀释度的稀释液，吸取0.5mL置于灭菌平皿内,分别倾注S2中的5瓶营养琼脂中各2个平皿，摇匀待冷却后翻转平皿至36℃±1℃培养48h，以营养琼脂培养的回收菌数作为对照，以平板菌落数在30～300的范围计数，确定抑菌试验选用TTC的最佳使用浓度不超过0.02mg/mL；
S5.选购市场上常见的含各种色素的日化洗涤剂产品，按照QB/T 2738《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》的要求进行悬液法抑菌试验，TTC可被活细胞中的脱氢酶还原生成三苯甲臜类物质而沉积,使细胞显示出相应的红色或紫色,样品中所含的各种色素对TTC显色无干扰，24h即可观察结果。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
本发明利用TTC可被活细胞中的脱氢酶还原生成三苯甲臜类物质而沉积,使细胞显示出相应的红色或紫色的原理，控制合理灭菌方式及TTC使用浓度，实现细菌的快速检测。所述方法简便快捷，检测结果稳定可靠。
该发明方法所使用的显色试剂常见易得，所述方法操作简便，，容易通过肉眼判断。
该方法可实现快速检测。
四、附图说明：
图1中为采用悬液法抑菌试验，①、②为不同时间培养的金黄色葡萄球菌，③、④为不同时间培养的大肠埃希菌，20h均可通过肉眼判断结果。
图2为采用抑菌环法抑菌试验，在TTC显色培养基上抑菌圈清晰完整。
五、具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定：
本发明通过研究选用0.02mg/mL氯化三苯四氮唑(简称TTC)添加到营养琼脂培养基中，应用到日化产品的抑菌效果评价中，期望能快速测定抑菌效果，以提高配方开发的效率。
用TTC琼脂培养基快速检测日化产品抑菌效果的方法，所述的检测方法的步骤为：
S1.不同的灭菌方式对TTC的影响：
配制质量百分比0.1％TTC溶液500mL，分装于3个螺口玻璃瓶中，分别采用单独避光高压灭菌，再与50℃营养琼脂混匀制得培养基A；经0.45um微孔滤膜过滤除菌后，再与50℃营养琼脂混匀制得培养基B；加入营养琼脂混匀高压灭菌制得培养基C；分别将培养基A、B、C与对照组营养琼脂培养基进行大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌回收菌数对比验证，确定配制培养基A的配制方法进行S2.试验；
所述的对照组为营养琼脂；
S2.不同浓度TTC显色培养基对阳性菌的影响：
按照培养基A的配制方法配制TTC系列梯度的营养琼脂5瓶，各瓶含TTC的浓度依次为0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL；
S3按照QB/T 2738-2012方法，无菌操作取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的24h新鲜培养物，分别制备阳性菌悬液；
S4.吸取0.1mL的金黄色葡萄球菌菌悬液，加入到含5.0mLPBS的试管中，迅速混匀；将试管按需要数量分别排列于试管架上，每管加入18.0mLPBS液，各组由左向右，逐管标上10-1、10-2、10-3.将菌悬液样本在涡旋仪上混合20s，随即吸取2.0mL加入到10-1管内，如此类推，直至最后一管。选择适宜稀释度试管(以预计生长菌落数每平板为30cfu～300cfu者为宜)，吸取其中混合均匀的悬液0.5mL加于无菌平皿内,分别倾注S2中的5瓶营养琼脂各5个平皿，摇匀待冷却后翻转平皿至36℃±1℃培养48h。
吸取0.1mL的大肠埃希菌菌悬液，加入到含5.0mLPBS的试管中，迅速混匀；将试管按需要数量分别排列于试管架上，每管加入18.0mLPBS液，各组由左向右，逐管标上10-1、10-2、10-3.将菌悬液样本在涡旋仪上混合20s，随即吸取2.0mL加入到10-1管内。如此类推，直至最后一管。选择适宜稀释度试管(以预计生长菌落数每平板为30cfu～300cfu者为宜)，吸取其中混合均匀的悬液0.5mL加于无菌平皿内,分别倾注步骤2)中的5瓶营养琼脂各5个平皿，摇匀待冷却后翻转平皿至36℃±1℃培养48h，确定抑菌试验选用TTC的最佳使用浓度不超过0.02mg/mL。
所述的对照组为营养琼脂；
验证方法：
1实验试剂及设备
1.1主要试剂
2,3,5—三苯基氯化四氮唑，又称氯化三苯基四氮唑[triphenyltet2razoliumchloride(TTC)]、红四唑等，化学式C19 H15 ClN4[2]，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2)，自配；标准硬水(硬度342mg/L)，自配；营养琼脂培养基，生化试剂，北京路桥技术有限公司。
试验菌株为金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠埃希菌(ATCC 25922)，中国普通微生物菌种保藏管理中心。
1.2实验设备
恒温水浴锅，郑州长城科工贸有限公司；涡旋仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；恒温生化培养箱，上海一恒科技仪器有限公司；TYJ-2A菌落计数器，上海宏汇电器厂；生物安全柜，型号BSC-1100II A2-x，济南鑫贝西生物技术有限公司。
1.3试验用日化产品
采购于大型超市，标贴宣称具有抑菌功能的洗手液、洗衣液、餐具净等产品。
2实验部分
2.1菌悬液的配制
按照QB/T 2738-2012方法，无菌操作取金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠埃希菌(ATCC 25922)五代的24h新鲜培养物，分别制备阳性菌悬液，要求浓度为：取0.1mL滴入5.0mLPBS液内，回收菌数在1×104～9×104cfu/mL[3]。2.2测试方法
按照QB/T 2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》抑菌率检测方法进行测试，计算回收菌落数。
2.3不同的灭菌方式对TTC的影响
2.3.1配制0.1％TTC溶液500mL：精确称取0.5TTC试剂,用蒸馏水溶解、定容于500mL容量瓶至刻度,摇匀。
2.3.2量取上述0.1％TTC溶液100mL，装于螺口玻璃瓶中避光经121℃,20min高压灭菌,冷却后冰箱冷藏，使用时无菌操作按照1mL注入到100mL 50℃左右的营养琼脂培养基的比率混匀，至45℃水浴中备用，标记A瓶。
2.3.3另量取上述0.1％TTC溶液100mL，通过0.45um微孔滤膜过滤除菌，装于无菌玻璃瓶中冰箱避光冷藏，使用时无菌操作吸取1mL注入到100mL 50℃左右的营养琼脂培养基的比率混匀，至45℃水浴中备用，标记B瓶。
2.3.4吸取上述0.1％TTC溶液1mL注入到100mL已溶解的营养琼脂培养基中混匀，经121℃,20min高压灭菌,至45℃水浴中备用，标记C瓶。
2.3.5吸取0.1mL菌悬液，加入到含5.0mLPBS的试管中，迅速混匀；将试管按需要数量分别排列于试管架上，每管加入4.5mLPBS液，各组由左向右，逐管标上10-1、10-2、10-3.将菌悬液样本在涡旋仪上混合20s，随即吸取0.5mL加入到10-1管内。如此类推，直至最后一管。选择适宜稀释度试管(以预计生长菌落数每平板为30cfu～300cfu者为宜)，吸取其中混合均匀的悬液0.5mL加于无菌平皿内,分别倾注A瓶、B瓶、C瓶及营养琼脂培养基各2个平皿，摇匀待冷却后翻转平皿至36℃±1℃培养48h，以营养琼脂培养的回收菌数作为对照，各组测得的回收菌数见表1。
表1不同的灭菌方式对TTC指示剂的影响
2.3.6结论：由表1可知，A瓶和B瓶菌落回收数与营养琼脂对照组的相对偏差均＜10％，而C瓶外观呈现红褐色,培养的阳性菌回收菌数与对照组有明显差异。本实验选择A瓶的配制方法进行后续试验。
2.4TTC安全使用浓度验证。
2.4.1配制0.5％TTC溶液：精确称取0.5g(精确到0.001g)TTC试剂,用蒸馏水溶解、定容于100mL容量瓶至刻度,摇匀。121℃,20min高压灭菌,冷却后冰箱避光冷藏。
2.4.2配制含系列浓度TTC的营养琼脂：5瓶100mL装的营养琼脂分别加入0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的0.5％TTC试剂，各瓶营养琼脂里含TTC的浓度依次为0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL。2.4.3吸取0.1mL菌悬液，加入到含5.0mLPBS的试管中，迅速混匀；将试管按需要数量分别排列于试管架上，每管加入18.0mLPBS液，各组由左向右，逐管标上10-1、10-2、10-3.将菌悬液样本在涡旋仪上混合20s，随即吸取2.0mL加入到10-1管内。如此类推，直至最后一管。选择适宜稀释度试管(以预计生长菌落数每平板为30cfu～300cfu者为宜)，吸取其中混合均匀的悬液0.5mL加于无菌平皿内,分别倾注含TTC 0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL的营养琼脂5个平皿，充分混合均匀，待琼脂凝固后翻转平皿，置36℃±1℃培养箱内培养48h±2h，同时做不加TTC的营养琼脂对照及空白对照，各组测得的回收菌数见表2.
表2含不同浓度TTC对阳性菌的影响
2.4.4由表2可知，含0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mLTTC营养琼脂培养基都对大肠杆菌均无抑制现象；但对金黄色葡萄球菌显色均敏感，当TTC浓度大于0.02mg/mL时，平皿的回收菌数与营养琼脂对照组比较相对偏差略大，有一定的抑制现象，而且浓度越高，抑菌作用越明显。可能为革兰氏阳性菌细胞壁上肽聚糖和磷壁酸含量高，而革兰氏阴性菌肽聚糖和磷壁酸含量少，其外还有脂蛋白、外膜、脂多糖等结构的不同而导致对TCC敏感性不同。最终选择0.02mg/mL的TTC作为显色剂，既保证菌落良好的显色效果，且不抑制细菌的生长。
2.5不同色素对含0.02mg/mL TTC显色培养基的影响
试验用样品选自超市采购的洗衣液(蓝色、蓝绿色)、洗手液(蓝色、红色、绿色、白色含珠光浆、橙黄色餐具净等宣称抑菌的日化产品。测试方法按照QB/T2738《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》和QB/T 2850《抗抑菌洗涤剂》进行试验。试验采用显色培养基24h与48h对照培养结果，与营养琼脂48h对照培养进行，结果见表3。
表3TTC显色培养基应用到带色的日化产品中的抑菌效果
由表3可知，选购市场上常见的含各种色素的日化洗涤剂产品，按照QB/T 2738《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》的要求进行悬液法抑菌试验。试验在36℃±1℃培养箱内培养20h菌落已呈现红色，易于计数，比标准要求的48h培养观察缩短了时间，菌落数与48h观察结果的误差率＜10％，无明显差异。TTC显色培养基24h与营养琼脂培养基48h培养计数误差率＜10％，无明显差异。样品中所含的各种色素对TTC显色无干扰。其原理为：简称TTC可被活细胞中的脱氢酶还原生成三苯甲臜类物质而沉积,使细胞显示出相应的红色或紫色。
2.6TTC应用到日化产品抑菌效果抑菌环法试验观察：
按照QB/T 2738《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》对日化产品进行抑菌环法抑菌率试验，实际发现14h就可观察出结果，抑菌圈呈圆形无色，细菌生长部分为红色，且判断对比强烈。
3、结果与讨论(参见图1和图2)
TTC最常用在种子活性测定、植物疫病检测、活组织活性检测及菌落总数的测定。通过试验发现，TTC同样适用于日化洗涤剂产品抑菌性能的测试。含0.02mg/mL的TTC显色营养琼脂培养基，对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的培养均适宜，既能保证菌落良好的显色效果且不抑制细菌的生长。在24h培养即可观察出实验结果，回收的菌数与48h观察结果一致，且色素对其无影响。所以建立快速检测日化产品抑菌效果的试验方法，缩短了检测时间，可应用于大批量日化样品的抑菌效果的评价。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等同替换，均为本发明的权利要求所涵盖。
Claims (1)
1.用TTC琼脂培养基快速检测日化产品抑菌效果的方法，其特征在于：所述的方法步骤为：
S1.不同的灭菌方式对TTC的影响：
配制质量百分比0.1％TTC溶液500mL，分装于3个螺口玻璃瓶中，分别采用单独避光高压灭菌，再与50℃营养琼脂混匀制得培养基A；经0.45um微孔滤膜过滤除菌后，再与50℃营养琼脂混匀制得培养基B；加入营养琼脂混匀高压灭菌制得培养基C；分别将培养基A、B、C与对照组营养琼脂培养基进行大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌回收菌数对比验证，确定配制培养基A的配制方法进行S2试验；
S2.不同浓度TTC显色培养基对阳性菌的影响：
按照培养基A的配制方法配制TTC系列梯度的营养琼脂5瓶，各瓶含TTC的浓度依次为0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL；
S3.按照QB/T 2738-2012方法，无菌操作取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的24h新鲜培养物，分别制备阳性菌悬液；
S4.吸取0.1mL的金黄色葡萄球菌菌悬液，加入到含5.0mLPBS的试管中，迅速混匀后，取混合液0.5mL加入到4.5mLPBS试管中，做梯度稀释，取其中2～3个稀释度的稀释液，吸取0.5mL置于灭菌平皿内,分别倾注S2中的5瓶营养琼脂中各2个平皿，摇匀待冷却后翻转平皿至36℃±1℃培养48h，以营养琼脂培养的回收菌数作为对照，以平板菌落数在30～300的范围计数；
吸取0.1mL的大肠埃希菌菌悬液，加入到含5.0mLPBS的试管中，迅速混匀后，取混合液0.5mL加入到4.5mLPBS试管中，做梯度稀释，取其中2～3个稀释度的稀释液，吸取0.5mL置于灭菌平皿内,分别倾注S2中的5瓶营养琼脂中各2个平皿，摇匀待冷却后翻转平皿至36℃±1℃培养48h，以营养琼脂培养的回收菌数作为对照，以平板菌落数在30～300的范围计数，确定抑菌试验选用TTC的最佳使用浓度不超过0.02mg/mL；
S5.选购市场上常见的含各种色素的日化洗涤剂产品，按照QB/T 2738《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》的要求进行悬液法抑菌试验，TTC可被活细胞中的脱氢酶还原生成三苯甲臜类物质而沉积,使细胞显示出相应的红色或紫色,样品中所含的各种色素对TTC显色无干扰，24h即可观察结果。
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