CN104293661A - 一种快速抗菌试验方法及试剂盒 - Google Patents

一种快速抗菌试验方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种快速抗菌试验方法及试剂盒，包括无菌多孔检测板、保湿保温培养盒、培养液、试验菌、阳性对照抗菌剂，所述无菌多孔检测板含有3个或3个以上大小均等的检测孔，检测孔底部为厚薄一致、质地均匀的透明材料，所述保湿保温培养盒由盒身和盒盖组成，盒身内能够平放1-10个检测板，所述培养液为试验菌生长所需培养液。本发明的一种快速抗菌试验方法及试剂盒，能够快速、简便的检测试样的抗菌能力，并具有高通量、低成本的优势。

Description

一种快速抗菌试验方法及试剂盒
技术领域
本发明属于微生物试验领域，具体是涉及一种快速抗菌试验方法及试剂盒。
背景技术
抗菌试验是用于检测和评价抗菌剂抗菌效果的一种试验方法，也可用来筛选新的抗菌药物和用于检测细菌耐药性。
现行的标准抗菌试验方法是基于琼脂培养平皿上计算菌落数变化情况来判定抗菌剂性能的，试验周期比较长。该标准抗(抑)菌产品抗(抑)菌性能试验方法的操作步骤如下：
将试验细菌(金黄色葡萄球菌:ATCC 6538或大肠杆菌:8099或ATCC 25922)经24h斜面培养，培养物用PBS洗下，制成菌悬液,要求的浓度为：用100μl滴于5ml对照样液内(50X稀释)，回收菌数为1×104～9×104cfu/ml。
取灭菌过被试样液(5ml)和对照样液(5ml)(与试样同质材料，同等大小，但不含抗菌剂，且经灭菌处理)各4管。
取上述菌悬液，分别在每个被试样液和对照样液内滴加100μL(50X稀释)，均匀混合，开始计时，作用2、5、10、20min，用无菌镊分别将样液(0.5mL)投入含5mLPBS的试管内(10X稀释)，充分混匀，再作适当稀释，然后取其中2～3个稀释度，分别吸取0.5mL，置于两个平皿，用凉至40～45℃的营养琼脂培养基15mL作倾注(30X稀释)，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35℃±2℃培养48h(细菌)作活菌菌落计数。
试验重复3次，按下式计算抑菌率：X＝(A-B)/A×100％。式中：X为抗(抑)菌率，％；A――对照样品平均菌落数；B――被试样品平均菌落数。
评价标准：X≥50％～90％为抑菌率，产品有抑菌作用，X≥90％为抗菌率，产品有抗菌作用。
该标准方法试验周期比较长，约需48h，还有阴性对照组(不含抗菌剂)菌落数不好控制，一般每个阴性对照组平皿菌落数在100-900之间比较好，太低或太高都将影响定量。因此，现行的抗(抑)菌试验方法不适合生产线上中间产品或半成品的快速检测，也不适合大量样品的高通量筛查。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种快速抗菌试验方法及试剂盒，能够快速、简便的检测试样的抗菌能力，并具有高通量、低成本的优势。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种快速抗菌试验试剂盒,包括无菌多孔检测板、保湿保温培养盒、培养液、试验菌、阳性对照抗菌剂，无菌多孔检测板含有3个或3个以上大小均等的检测孔，检测孔底部为厚薄一致、质地均匀的透明材料，保湿保温培养盒由盒身和盒盖组成，盒身内能够平放1-10个检测板，培养液为试验菌生长所需培养液。
优选的，所述无菌多孔检测板含有3行5列共15个检测孔，左边3列为试样孔，右边2列为对照孔，每个检测孔的容积为0.1-0.5ml。
优选的，所述试验菌装在带盖的瓶子内，瓶子内装有斜面琼脂培养基，试验菌长在斜面琼脂培养基上。
优选的，所述试验菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌或待查菌。
优选的，所述阳性对照抗菌剂是水溶性抗菌试剂。
优选的，所述试剂盒还包括3个或以上大小均等的细菌培养管，细菌培养管是透明的玻璃管或塑料管。
一种快速抗菌试验方法，在波长470nm下检测菌液的吸光度来判定试验菌的密度。
优选的，快速抗菌试验方法包括如下步骤：
(1)试验菌液准备：试验菌液的OD470达到0.5-0.8；
(2)试样液及对照液准备；
(3)抗菌反应及终止；
(4)检测抗菌效果：将菌液起始OD值控制在OD470为0.1-0.3，通过在470nm波长下检测菌液在后续培养过程中的吸光度变化来判定试样的抗菌效果。
优选的，快速抗菌试验方法包括如下步骤：
(1)试验菌液准备：挑取经24h斜面培养的试验菌或过夜摇菌培养的试验菌，用培养液稀释至OD470为0.2-0.3,然后摇床培养至OD470达到0.5-0.8；
(2)试样液及对照液准备：分别配制0.2-1ml的等量各待测试样液和对照液，对照液包括阳性对照液和阴性对照液，所述的阴性对照液是不含任何抗菌剂的溶剂；
(3)抗菌反应及终止：取0.01-0.1ml的定量试验菌液，分别与各试样液及对照液混合，试验菌液与试样液或对照液的混合体积比例为1：2-1：10；混合后计时，反应1-20min，然后，离心、除去上清、加入0.2-5ml的等量培养液重悬以终止反应；
(4)检测抗菌效果：分别取0.1-1ml各试样组和对照组的等量的重悬菌液，用培养液稀释1-5倍至OD470为0.1-0.3后分置于无菌多孔检测板的不同孔中，检测起始OD470，然后在保湿保温培养盒底部放置无菌湿纸巾，将无菌多孔检测板置于无菌湿纸巾上，在37℃摇床中摇动培养1-5h，每小时检测一次OD470，通过OD470的数值变化判断各待测试样的抗菌效果。
一种快速抗菌试验方法，包括如下步骤：
(1)试验菌液准备：挑取经24h斜面培养的试验菌或过夜培养的试验菌，用培养液稀释5-20倍后摇床培养至可见混浊；
(2)试样液及对照液准备：分别配制0.5-2ml的等量各待测试样液和对照液，对照液包括阳性对照液和阴性对照液，所述阴性对照液是不含任何抗菌剂的溶剂；
(3)抗菌反应及终止：取0.05-0.2ml的定量试验菌液分别与各待测试样液及对照液混合，反应1-20min，然后加入5-10倍培养液以终止反应；
(4)检测抗菌效果：分别取0.1-1ml各试样组和对照组的终止反应后的等量菌液置于不同细菌培养管中，用培养液稀释1-5倍至无明显可见混浊止，然后置于37℃摇床中培养1-2h或室温培养18-24h，观察并对比各管中液体的混浊程度判断各待测试样的抗菌效果。
本发明具有的优点和积极效果是：本发明的一种快速抗菌试验方法及试剂盒快速、简单、高通量、省成本，能在1至5个小时内检测出试样的抗菌能力，并可同时检测上百乃至上千个试样，而且使用的试剂量少，节省检测成本，适合于基层或专业机构进行抗菌试验、微生物试验、新抗菌剂筛查以及细菌耐药性检测。
附图说明
图1是本发明无菌多孔检测板的正视图；
图2是本发明无菌多孔检测板的俯视图；
图3是本发明实施例3中比较OD470和OD600与细菌密度关系图。
图1、图2中：1.无菌多孔检测板，2.检测孔。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1
如图1、图2所示，一种快速抗菌试验试剂盒，包括：
(1)无菌多孔检测板1(15孔)：透明塑料铸模制得，含有3行5列共15个大小均等的检测孔2，左边三列为试样孔，右边两列为对照孔，每个检测孔2的容积为0.1-0.5ml，检测孔底部厚薄一致、质地均匀。
(2)保湿保温培养盒(1个)：为透明塑料材质，由盒身和盒盖组成，底部放置无菌湿纸巾，无菌湿纸巾上放置检测板1。
(3)培养液(30ml)：一瓶LB培养液。
(4)试验菌(1瓶)：大肠杆菌(ATCC 25922)长在斜面的LB琼脂培养基表面。
(5)阳性对照抗菌剂(1ml)：0.1％氯己定二葡糖酸盐。
实施例2
一种快速抗菌试验试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备无菌多孔检测板1：按图2所示制模,然后用公知的方法用透明塑料铸模制得。检测板1含有3行5列15个检测孔2组成，左边部分3X3孔(S1、S2、S3三组)为试样孔，用于检测抗菌试样；右边部分2X3孔(D1、D2两组)为对照孔，用于检测阳性对照和阴性对照抗菌剂；每个孔的容积约0.35ml；用无菌塑料袋密封包装，备用。
(2)制备培养液：将LB培养液配制后分装在50ml的玻璃瓶内，每瓶30ml，高压杀菌后密封存储，备用。
(3)制备试验菌：将LB琼脂培养基高压杀菌后，凉至50℃左右，分装入经无菌消毒的3ml的小广口玻璃瓶内，每瓶1.5ml,斜放、静置至琼脂培养基凝固，备用；将大肠杆菌(ATCC 25922)划线在琼脂培养基表面，37℃培养2天至大量菌落群长出，冷藏备用。
(4)制备阳性对照抗菌剂：取市购的20％氯己定二葡糖酸盐(CAS#：LRAA1627)0.1ml，加入到20ml的无菌蒸馏水中，混匀，再经0.2μ滤膜无菌过滤后，在超净台上按每瓶1ml，分装在高压杀菌过的2mL小玻璃瓶中，盖紧备用。
(5)制备保湿保温培养盒：由盒身和盒盖组成，其大小以足够平放1个检测板为度，用透明塑料制得；抗菌试验时用于盛放无菌多孔检测板，并在无菌多孔检测板下垫无菌湿纸巾以防检测板中菌液蒸发，盖上盖子后置于摇床中保温摇动培养。
(6)将上述步骤(1)制得的无菌多孔检测板1、步骤(2)制得的培养液、步骤(3)制得的试验菌、步骤(4)制得的阳性对照抗菌、步骤(5)制得的保湿保温培养盒各取一份，合并装在纸盒中，便成快速抗菌试验试剂盒。
实施例3
比较OD470和OD600在检测细菌密度时的效果：
取0.5ml大肠杆菌(ATCC 25922)过夜菌液，用5ml的LB培养液稀释后在37℃摇床上摇动培养3h，取该菌液0.1ml与0.1ml的LB培养液混合，然后，再用LB培养液作倍比梯度稀释7次，最后一次仅LB培养液不含菌，然后把该系列梯度稀释的菌液(8份)转到酶标盘里，用酶标仪分别在470nm和600nm检测梯度稀释后各组菌液的OD值，结果如表1及图3所示。
表1.不同细菌液稀释度下检测OD450和OD600结果
菌密度 1 0.5 0.25 0.125 0.063 0.031 0.016 0.000
470nm 0.637 0.414 0.246 0.163 0.111 0.083 0.069 0.047
600nm 0.388 0.246 0.151 0.085 0.066 0.051 0.045 0.043
试验结果证明：用470nm的波长(OD470nm)和600nm的波长(OD600nm)都能测定细菌液中的细菌密度，而且两者的OD值都与菌密度成正比关系，即菌液的稀释倍数越高，菌的密度就越低，OD470和OD600的值就越小。然而，用470nm的波长来测定细菌液中细菌密度比用600nm效果更好，因为，对测定一定范围的细菌密度而言，OD470nm比OD600nm有更大的窗口而且更灵敏，也就是说细菌密度稍有变化时，OD470nm值的变化比OD600nm值变化大，尤其在菌密度较低时，600nm还测不到是否有菌，而470nm却已经能检测到。
实施例4
用快速抗菌试验方法检测壳聚糖的抗菌效果，包括如下步骤：
(1)试验菌液准备：从一储备的琼脂培养皿上的大肠杆菌(ATCC 25922)菌落群中挑取一个菌落并转移到5ml的LB培养液里，37℃过夜摇菌，次日，取适量过夜菌用LB培养液5ml稀释至OD470为0.2-0.3,然后37℃摇床培养复苏至OD470达到0.8；
(2)无菌多孔检测板准备：取一无菌多孔检测板，用70％乙醇喷洒孔内外消毒，然后在超净台上风干，备用；
(3)试样液及对照液准备：分别配制1ml的待测试样：0.1％壳聚糖溶液和0.05％壳聚糖溶液，并调pH至7.2，用蒸馏水配制阳性对照液0.1％氯已定葡萄糖酸溶液1ml，和阴性对照液PBS 1ml；将待测试样液及阳性、阴性对照液用65℃水浴20min进行巴氏杀菌；
(4)抗菌反应及终止：取4个1.5mL小离心管，标记#1，#2，#3，#4，向各管中加入0.2ml试验菌液，再分别依次向#1，#2，#3，#4管中加入0.5ml的0.05％壳聚糖溶液、0.1％壳聚糖溶液、阳性对照液、阴性对照液，混合反应20min，然后，离心、除去上清、向各管加入0.5ml的LB培养液，重悬细菌以终止反应；
(5)检测抗菌效果：取预消毒过的多孔检测板，分别取0.2ml上一步骤的各个样品的重悬菌液，分别加在S1，S2，D1，D2孔中，在S3孔中加等量的LB培养液(不含菌)，每组作2个(T1、T2)，检测起始T0细菌密度(OD470)，然后将该多孔检测板置于保湿保温培养盒内，在检测板下垫无菌湿纸巾(以防检测板中菌液蒸发)，盖上保湿保温培养盒盖子，在37℃摇床中摇动培养，约每小时检测一次细菌密度(OD470)，检测结果如表2所示。
表2.经不同样品处理后细菌密度(OD470)随时间变化情况
检测结果显示：
D2：阴性对照(无抗菌剂)的试验菌OD470值随培养时间而升高，说明试验菌还活着；
D1：阳性对照(氯已定0.1％)完全抑制了细菌增长(OD470值不变)，说明试验菌被杀灭；
S3：LB(无菌、无抗菌剂)完全没有细菌增长(OD470＝空白)，说明无菌污染。
S2：壳聚糖0.1％也基本完全抑制细菌增长(OD470值不变)，说明0.1％壳聚糖有显著抗菌作用；
S1：壳聚糖0.05％仅细菌增长稍微变慢(OD470值升高)，说明0.05％壳聚糖仅有轻微抑菌作用。
本实施例结果显示：壳聚糖的抗菌效果是浓度依赖性的，当壳聚糖浓度为0.1％时有显著抗菌效果，当浓度降为0.05％时丧失抗菌能力。从而证明本发明的快速抗菌试验方法适合于快速检测抗菌剂的抗菌效果。
以上对本发明的较佳实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.一种快速抗菌试验试剂盒,其特征在于:包括无菌多孔检测板、保湿保温培养盒、培养液、试验菌、阳性对照抗菌剂，所述无菌多孔检测板含有3个或3个以上大小均等的检测孔，检测孔底部为厚薄一致、质地均匀的透明材料，所述保湿保温培养盒由盒身和盒盖组成，盒身内能够平放1-10个检测板，所述培养液为试验菌生长所需培养液。
2.根据权利要求1所述的一种快速抗菌试验试剂盒，其特征在于：所述无菌多孔检测板含有3行5列共15个检测孔，左边3列为试样孔，右边2列为对照孔，每个检测孔的容积为0.1-0.5ml。
3.根据权利要求1或2所述的一种快速抗菌试验试剂盒，其特征在于：所述试验菌装在带盖的瓶子内，瓶子内装有斜面琼脂培养基，试验菌长在斜面琼脂培养基上。
4.根据权利要求3所述的一种快速抗菌试验试剂盒，其特征在于：所述试验菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌或待查菌。
5.根据权利要求1或2所述的一种快速抗菌试验试剂盒，其特征在于：所述阳性对照抗菌剂是水溶性抗菌试剂。
6.根据权利要求1或2所述的一种快速抗菌试验试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括3个或以上大小均等的细菌培养管，细菌培养管是透明的玻璃管或塑料管。
7.一种快速抗菌试验方法，其特征在于：在波长470nm下检测菌液的吸光度来判定试验菌的密度。
8.根据权利要求7所述的一种快速抗菌试验方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)试验菌液准备：试验菌液的OD470达到0.5-0.8；
(2)试样液及对照液准备；
(3)抗菌反应及终止；
(4)检测抗菌效果：将菌液起始OD值控制在OD470为0.1-0.3，通过在470nm波长下检测菌液在后续培养过程中的吸光度变化来判定试样的抗菌效果。
9.根据权利要求8所述的一种快速抗菌试验方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)试验菌液准备：挑取经24h斜面培养的试验菌或过夜摇菌培养的试验菌，用培养液稀释至OD470为0.2-0.3,然后摇床培养至OD470达到0.5-0.8；
(2)试样液及对照液准备：分别配制0.2-1ml的等量各待测试样液和对照液，对照液包括阳性对照液和阴性对照液，所述的阴性对照液是不含任何抗菌剂的溶剂；
(3)抗菌反应及终止：取0.01-0.1ml的定量试验菌液，分别与各试样液及对照液混合，试验菌液与试样液或对照液的混合体积比例为1：2-1：10；混合后计时，反应1-20min，然后，离心、除去上清、加入0.2-5ml的等量培养液重悬以终止反应；
(4)检测抗菌效果：分别取0.1-1ml各试样组和对照组的等量的重悬菌液，用培养液稀释1-5倍至OD470为0.1-0.3后分置于无菌多孔检测板的不同孔中，检测起始OD470，然后在保湿保温培养盒底部放置无菌湿纸巾，将无菌多孔检测板置于无菌湿纸巾上，在37℃摇床中摇动培养1-5h，每小时检测一次OD470，通过OD470的数值变化判断各待测试样的抗菌效果。
10.一种快速抗菌试验方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)试验菌液准备：挑取经24h斜面培养的试验菌或过夜培养的试验菌，用培养液稀释5-20倍后摇床培养至可见混浊；
(2)试样液及对照液准备：分别配制0.5-2ml的等量各待测试样液和对照液，对照液包括阳性对照液和阴性对照液，所述阴性对照液是不含任何抗菌剂的溶剂；
(3)抗菌反应及终止：取0.05-0.2ml的定量试验菌液分别与各待测试样液及对照液混合，反应1-20min，然后加入5-10倍培养液以终止反应；
(4)检测抗菌效果：分别取0.1-1ml各试样组和对照组的终止反应后的等量菌液置于不同细菌培养管中，用培养液稀释1-5倍至无明显可见混浊止，然后置于37℃摇床中培养1-2h或室温培养18-24h，观察并对比各管中液体的混浊程度判断各待测试样的抗菌效果。
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