CN103173517B - 微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌和最小杀菌浓度的方法 - Google Patents
微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌和最小杀菌浓度的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103173517B CN103173517B CN201310065813.4A CN201310065813A CN103173517B CN 103173517 B CN103173517 B CN 103173517B CN 201310065813 A CN201310065813 A CN 201310065813A CN 103173517 B CN103173517 B CN 103173517B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- concentration
- bacterial suspension
- mhb
- bacterial
- substratum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 38
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 108010050820 Antimicrobial Cationic Peptides Proteins 0.000 title abstract description 11
- 102000014133 Antimicrobial Cationic Peptides Human genes 0.000 title abstract description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 64
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 45
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 18
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 15
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 9
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- -1 polypropylene Polymers 0.000 claims description 8
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 6
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 claims 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 claims 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 230000001408 fungistatic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 5
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 5
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 108010078777 Colistin Proteins 0.000 description 3
- 241001360526 Escherichia coli ATCC 25922 Species 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N chlorotetracycline Natural products C1=CC(Cl)=C2C(O)(C)C3CC4C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)C4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004475 chlortetracycline Drugs 0.000 description 3
- CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N chlortetracycline Chemical compound C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N 0.000 description 3
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 229960001127 colistin sulfate Drugs 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- ZESIAEVDVPWEKB-ORCFLVBFSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(3s,6s,9s,12s,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1r)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-h Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O.CCC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O ZESIAEVDVPWEKB-ORCFLVBFSA-N 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000004099 Chlortetracycline Substances 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N framycetin Chemical class N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O2)N)O[C@@H]1CO PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008316 intracellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940053050 neomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004260 plant-type cell wall biogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法，包括以下步骤：1）试剂配制：配制MHB培养基；2）细菌悬液制备：复苏细菌至对数生长期，制备浓度一定的细菌悬液；3）细菌悬液计数：倍比稀释步骤2）中的细菌悬液后滴板计数；4）药剂稀释：倍比稀释药剂至不同测试浓度梯度；5）测定最小抑菌浓度：将步骤4）中稀释好的药剂与步骤2）中制备的细菌悬液混合后培养，观察是否有肉眼可见的细菌沉淀；6）测定最小杀菌浓度：将步骤5）中有抑菌效果的测试滴板后培养，观察是否有菌落生长。采用该方法测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度具有干扰小、微量、方便、快捷的特点。
Description
技术领域
本发明属于一种测定微量抗菌物质最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，特别是适用于阳离子抗菌肽测定的方法。
背景技术
抗菌肽是动物体内一大类具有抗菌活性和免疫功能的生物活性物质。抗菌肽具有广谱抗菌活性和丰富的作用机制。不仅和传统抗菌活性物质一样，具有胞内作用机制，包括：与核酸物质结合，阻断DNA复制、RNA合成；影响蛋白质合成；抑制隔膜、细胞壁合成，阻碍细胞分裂；抑制胞内酶的活性。抗菌肽尤其是阳离子抗菌肽有膜作用机制，目前认为存在：“桶板”模型、“毯式”模型，“环形孔”模型和“凝聚”模型等理论。由于抗菌肽的来源天然和作用机制特殊，不易产生耐药性，对人和动物的副作用小，所以备受关注，是抗生素的理想替代品。研究其菌株耐药性、杀菌效果及其杀菌机制则尤为重要，而最小抑菌浓度和最小杀菌浓度是评价抗菌物质抗菌效果和进一步实验的基础指标。
由于阳离子抗菌肽携带有正电荷，一般检测方法使用的抗生素敏感测定培养基中的阳离子浓度以及所用器皿的吸附作用对检测会造成较大影响。加之一般抗菌肽的待测样品量微少，不能满足一般检测方法的需求量。所以找到一种能够适用于阳离子抗菌肽的，检测干扰小、微量样品即可操作，并且在实验过程中根据需要可以相应调节的方法，显得尤为迫切。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种干扰小、微量、方便、快捷的测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法，包括以下步骤：
1） 试剂配制
①MHB（Mueller Hinton Broth）培养基：21 g MHB培养基粉末溶于1 L蒸馏水中，121 ℃灭菌20 min，室温冷却，4 ℃保存备用。
②MHB琼脂培养基：21 g MHB培养基粉末、15 g琼脂粉溶于1 L蒸馏水中，121 ℃灭菌20 min，倒入无菌培养皿中，以刚好覆盖培养皿底部为宜，室温冷却凝固，4℃保存备用。
③药剂储存液：准确称取2 mg待测药剂，用无菌水溶解至4 mg/ml，4 ℃保存备用。
2） 细菌悬液制备
①选取-80 ℃保存的测试菌种的甘油菌，室温解冻后混悬，用接种环划线MHB琼脂培养基，37 ℃培养12 hr，待长出单菌落后，4 ℃保存备用。
②用接种环挑取步骤2）①中的单菌落，接种于5 ml MHB培养基试管，37 ℃、250 rpm培养12 hr，待菌液浑浊后，4 ℃保存备用。
③混悬步骤2）②中的菌液，移取50 μl接种于5 ml MHB培养基试管，37 ℃、250 rpm培养约2 hr。
④测定步骤2）③中菌液的OD600值，OD600值约为0.5时可使用。0.6<OD600<1.0时，可用MHB培养基稀释至适宜范围。
⑤将步骤2）④中的菌液与MHB培养基以30 μl:30 ml混合制成细菌悬液，制备好的细菌悬液应在30 min内使用完毕。
3） 细菌悬液计数
①步骤2）⑤中的细菌悬液与MHB培养基以10 μl:90 μl混合稀释，连续4次，分别得到10、10^2、10^3和10^4倍稀释细菌悬液。
②取1块MHB琼脂培养基（提前2 hr在37 ℃培养箱中缓解），记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区。从步骤3）①中的10、10^2、10^3和10^4等4个浓度稀释梯度细菌悬液中移10 μl滴加在MHB琼脂培养基标记好的对应扇区，每个梯度3个重复。
③待步骤3）②中的细菌悬液被培养基吸收，37 ℃培养12 hr，选取3个重复菌落总数为30~200的扇区计数，计算CFU=3个重复菌落总数/30×稀释倍数×1000，CFU值在0.5~1×10^6/ml为宜。
4） 药剂稀释
取1块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，第1列每孔加入32 μl步骤1）③中的药剂储存液和168 μl无菌水，终浓度为640 μg/ml。第2~10列每孔加入100 μl 无菌水。从第1列起移取100 μl加入次列，如此逐级等比稀释至第10列，第10列移去100 μl。得到640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25共10个浓度梯度，每孔100 μl，现用现配。
5） 最小抑菌浓度（MIC）的测定
①取1块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，每行作为1个测试，第1~10列每孔加入90 μl细菌悬液，第11列加入100 μl细菌悬液作为有菌对照，第12列加入100 μl MHB培养基作为无菌对照。
②从步骤4）中的药剂稀释板移取10 μl稀释药剂加入步骤5）①中96孔板对应的孔中，终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/ml以及有菌和无菌对照，终体积100 μl。每种药剂对每种细菌进行3次重复测试。
③步骤5）②中的96孔板用保鲜膜包好，放入湿盒（置于容器中覆盖湿润纱布即可），37 ℃培养12 hr。肉眼无可见细菌沉淀的孔所对应的最小浓度数值即为最小抑菌浓度（MIC）。
6） 最小杀菌浓度（MBC）的测定
①MHB琼脂培养基提前2 hr在37 ℃培养箱中缓解，记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区。
②从步骤5）③中最小抑菌浓度对应的孔起，向高浓度选取4个浓度梯度，每个浓度梯度取10 μl滴加在步骤6）①中MHB琼脂平板对应扇区，做好标记，每个梯度3个重复。待细菌悬液被培养基吸收，37 ℃培养12 hr。肉眼无菌落生长的扇区所对应的最小浓度数值即为最小杀菌浓度（MBC）。
作为本发明的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法的改进：1）使用非阳离子调节的培养基，或者说是低阳离子培养基。
作为本发明的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法的改进：4）和5）使用未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板。
本发明中，待测药剂是各类具有抗菌活性的物质，特别是阳离子抗菌肽。
本发明方法的检测结果表明：测试方法能够满足微量抗菌活性物质的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定的需求，结果重复性好。
本发明具有如下有益效果：
1 可以微量测定，满足抗菌活性物质样品少时的测定需求，2 mg即可测定，且节约试剂。
2 可以测定阳离子抗菌肽，排除了反应体系中阳离子的干扰，以及96孔板对阳离子抗菌肽的吸附作用。
3 本方法操作简便，所用设备简单常见，所用试剂经济实惠，方法简单易行。
附图说明
图1是细菌悬液计数滴板培养后培养皿照片。
图2是药剂稀释及与细菌悬液混合铺96孔板的结果示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。
实施例1
2012年9月18日，测定抗菌肽PR-39和抗生素金霉素、新霉素及硫酸粘菌素对大肠杆菌CMCC 44103和ATCC 25922的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。
）试剂配制
①MHB培养基：21 g MHB培养基粉末（BD Difco，货号275730 ）溶于1 L蒸馏水中，121 ℃灭菌20 min，室温冷却，4 ℃保存备用。
②MHB琼脂培养基：21 g MHB培养基粉末、15 g琼脂粉溶于1 L蒸馏水中，121 ℃灭菌20 min，倒入无菌培养皿中，以刚好覆盖培养皿底部为宜，室温冷却凝固，4℃保存备用。
③药剂储存液：准确称取2 mg待测药剂，用无菌水溶解至4 mg/ml，4 ℃保存备用。
）细菌悬液制备
①选取-80 ℃保存的甘油菌，室温解冻后混悬，用接种环划线MHB琼脂培养基，37 ℃培养12 hr，待长出单菌落后，4 ℃保存备用。
②用接种环挑取步骤2）①中的单菌落，接种于5 ml MHB培养基试管，37 ℃、250 rpm培养12 hr，待菌液浑浊后，4 ℃保存备用。
③混悬步骤2）②中的菌液，移取50 μl接种于5 ml MHB培养基试管，37 ℃、250 rpm培养约2 hr。
④测定步骤2）③中菌液的OD600值，大肠杆菌CMCC 44103的OD600值为0.456，大肠杆菌A细胞培养C 25922的OD600值为0.476。
⑤将步骤2）④中的菌液与MHB培养基以30 μl:30 ml混合制成细菌悬液，制备好的细菌悬液应在30 min内使用完毕。
）细菌悬液计数
①步骤2）⑤中的细菌悬液与MHB培养基以10 μl:90 μl混合稀释，连续4次，分别得到10、10^2、10^3和10^4倍稀释细菌悬液。
②取1块MHB琼脂培养基（提前2 hr在37 ℃培养箱中缓解），记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区。从步骤3）①中的10、10^2、10^3和10^4等4个浓度稀释梯度细菌悬液中移10 μl滴加在MHB琼脂培养基标记好的对应扇区，每个梯度3个重复。方法如图1所示。
③待步骤3）②中的细菌悬液被培养基吸收，37 ℃培养12 hr，选取3个重复菌落总数为30~200的扇区计数，计算CFU=3个重复菌落总数/30×稀释倍数×1000，CFU值在0.5~1×10^6/ml为宜。结果如下表1所示：
表1
| 菌 种 | 稀释100倍 | 折CFU | 稀释1000倍 | 折CFU |
| 大肠杆菌CMCC 44103 | 231 | 7.7×10^5 | 99 | 3.3×10^6 |
| 大肠杆菌ATCC 25922 | 139 | 4.6×10^5 | 36 | 1.2×10^6 |
4）药剂稀释
取1块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，第1列每孔加入32 μl步骤1）③中的药剂储存液和168 μl无菌水，终浓度为640 μg/ml。第2~10列每孔加入100 μl 无菌水。从第1列起移取100 μl加入次列，如此逐级等比稀释至第10列，第10列移去100 μl。得到640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25共10个浓度梯度，每孔100 μl，现用现配。
）最小抑菌浓度（MIC）的测定
①取1块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，每行作为1个测试，第1~10列每孔加入90 μl细菌悬液，第11列加入100 μl细菌悬液作为有菌对照，第12列加入100 μl MHB培养基作为无菌对照。方法如图2所示。
②从步骤4）中的药剂稀释板移取10 μl稀释药剂加入步骤5）①中96孔板对应的孔中，终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/ml以及有菌和无菌对照，终体积100 μl。每种药剂对每种细菌进行3次重复测试。
③步骤5）②中的96孔板用保鲜膜包好，放入湿盒（置于容器中覆盖湿润纱布即可），37 ℃培养12 hr。肉眼无可见细菌沉淀的孔所对应的最小浓度数值即为最小抑菌浓度（MIC，μg/ml）。结果如下表2所示：
表2
| 菌 种 | 金霉素 | 新霉素 | 硫酸粘菌素 | PR-39 |
| 大肠杆菌CMCC 44103 | 1 | 1 | 0.5 | 4 |
| 大肠杆菌ATCC 25922 | 1 | 2 | 0.5 | 4 |
6）最小杀菌浓度（MBC）的测定
①MHB琼脂培养基提前2 hr在37 ℃培养箱中缓解，记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区。
②从步骤5）③中最小抑菌浓度对应的孔起，向高浓度选取4个浓度梯度，每个浓度梯度取10 μl滴加在步骤6）①中MHB琼脂平板对应扇区，做好标记，每个梯度3个重复。待细菌悬液被培养基吸收，37 ℃培养12 hr。肉眼无菌落生长的扇区所对应的最小浓度数值即为最小杀菌浓度（MBC， μg/ml），结果如下表3所示：
表3
| 菌 种 | 金霉素 | 新霉素 | 硫酸粘菌素 | PR-39 |
| 大肠杆菌CMCC 44103 | 4 | 2 | 1 | 4 |
| 大肠杆菌ATCC 25922 | 8 | 8 | 1 | 8 |
最后，还需要注意的是，本发明同样适用于其他阳离子抗菌物质测定和非阳离子抗菌物质微量测定的需求。以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出和联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）试剂配制：配制Mueller Hinton Broth培养基；
2）细菌悬液制备：培养细菌至对数生长期，制备细菌悬液；
3）细菌悬液计数：倍比稀释所述的步骤2）中的细菌悬液后滴板计数；
4）阳离子抗菌肽稀释：倍比稀释阳离子抗菌肽至不同测试浓度梯度；
5）测定最小抑菌浓度：将所述的步骤4）中的不同测试浓度梯度的阳离子抗菌肽与步骤2）中制备的细菌悬液混合后培养，观察是否有肉眼可见的细菌沉淀，无肉眼可见细菌沉淀的孔对应的最小浓度即为最小抑菌浓度；
6）测定最小杀菌浓度：将步骤5）中有抑菌效果的测试孔滴板后培养，观察是否有菌落生长无菌落生长扇区对应的最小浓度即为最小杀菌浓度；
所述的步骤1）中的试剂配制过程如下：
1.1) MHB培养基：21 g MHB培养基粉末溶于1 L蒸馏水中，121 ℃灭菌20 min，室温冷却，4 ℃保存备用;
1.2) MHB琼脂培养基：21 g MHB培养基粉末、15 g琼脂粉溶于1 L蒸馏水中，121 ℃灭菌20 min，倒入无菌培养皿中，以刚好覆盖培养皿底部为宜，室温冷却凝固，4℃保存备用;
1.3)药剂储存液：准确称取2 mg待测药剂，用无菌水溶解至4 mg/ml，4 ℃保存备用；
所述的步骤2）中细菌悬液制备过程如下：
2.1)选取-80 ℃保存的测试菌种的甘油菌，室温解冻后混悬，用接种环划线MHB琼脂培养基，37 ℃培养12 hr，待长出单菌落后，4 ℃保存备用；
2.2)用接种环挑取步骤2.1)中的单菌落，接种于5 ml MHB培养基试管，37 ℃、250 rpm培养12 hr，待菌液浑浊后，4 ℃保存备用；
2.3)混悬步骤2.2)中的菌液，移取50 μl接种于5 ml MHB培养基试管，37 ℃、250 rpm培养约2 hr；
2.4)测定步骤2.3)中菌液的OD600值，OD600值约为0.5时可使用，0.6<OD600<1.0时，可用MHB培养基稀释至适宜范围；
2.5)将步骤2.4)中的菌液与MHB培养基以30 μl:30 ml混合制成细菌悬液，制备好的细菌悬液应在30 min内使用完毕；
所述的步骤3）中细菌悬液计数过程如下：
3.1）所述的2.5)中的细菌悬液与MHB培养基以10 μl:90 μl混合稀释，连续4次，分别得到10、102、103和104倍稀释细菌悬液；
3.2）取1块MHB琼脂培养基，记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区，从步骤3.1）中的10、102、103和104等4个浓度稀释梯度细菌悬液中移10 μl滴加在MHB琼脂培养基标记好的对应扇区，每个梯度3个重复；
3.3）待步骤3.2）中的细菌悬液被培养基吸收，37 ℃培养12 hr，选取3个重复菌落总数为30~200的扇区计数，计算CFU=3个重复菌落总数/30×稀释倍数×1000，CFU值在0.5~1×106/ml为宜；
所述的步骤4）中药剂稀释过程如下：
取1块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，第1列每孔加入32 μl步骤1.3)中的药剂储存液和168 μl无菌水，终浓度为640 μg/ml；第2~10列每孔加入100 μl 无菌水；从第1列起移取100 μl加入次列，如此逐级等比稀释至第10列，第10列移去100 μl；得到640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25共10个浓度梯度，每孔100 μl，现用现配；
所述的步骤5）中最小抑菌浓度的测定过程如下：
5.1）取1块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，每行作为1个测试，第1~10列每孔加入90 μl细菌悬液，第11列加入100 μl细菌悬液作为有菌对照，第12列加入100 μl MHB培养基作为无菌对照；
5.2）从步骤4）中的96孔板移取10 μl稀释药剂加入步骤5.1）中96孔板对应的孔中，终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/ml以及有菌和无菌对照，终体积100 μl；每种药剂对每种细菌进行3次重复测试；
5.3）步骤5.2）中的96孔板用保鲜膜包好，放入湿盒37 ℃培养12 hr，肉眼无可见细菌沉淀的孔所对应的最小浓度数值即为最小抑菌浓度（MIC）；
所述的步骤6）中最小杀菌浓度的测定过程如下：
6.1）MHB琼脂培养基提前2 hr在37 ℃培养箱中缓解，记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区;
6.2）从步骤5.3）中最小抑菌浓度对应的孔起，向高浓度选取4个浓度梯度，每个浓度梯度取10 μl滴加在步骤6.1）中MHB琼脂培养基对应扇区，做好标记，每个梯度3个重复；待细菌悬液被培养基吸收，37 ℃培养12 hr；肉眼无菌落生长的扇区所对应的最小浓度数值即为最小杀菌浓度；
所述的步骤4）和步骤5）使用未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310065813.4A CN103173517B (zh) | 2013-03-01 | 2013-03-01 | 微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌和最小杀菌浓度的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310065813.4A CN103173517B (zh) | 2013-03-01 | 2013-03-01 | 微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌和最小杀菌浓度的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103173517A CN103173517A (zh) | 2013-06-26 |
| CN103173517B true CN103173517B (zh) | 2014-07-30 |
Family
ID=48633705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310065813.4A Active CN103173517B (zh) | 2013-03-01 | 2013-03-01 | 微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌和最小杀菌浓度的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103173517B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104293661B (zh) * | 2014-10-22 | 2016-08-24 | 哈德逊（天津）生物技术有限责任公司 | 一种快速抗菌试验方法及试剂盒 |
| CN105018568B (zh) * | 2015-08-07 | 2018-08-07 | 齐鲁工业大学 | 一种确定大豆球蛋白碱性多肽抑菌机制的方法 |
| CN108060207B (zh) * | 2017-12-29 | 2021-10-15 | 河南科技大学 | 一种基于微量天然化合物的最小杀菌浓度测定方法 |
| CN108359709B (zh) * | 2018-04-04 | 2021-05-14 | 浙江大学 | 一种用于脂溶性物质的抑菌特性检验方法 |
| CN116076621A (zh) * | 2023-04-06 | 2023-05-09 | 四川省畜牧科学研究院 | 猪饲料有机酸适宜添加量算法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1966709A (zh) * | 2006-11-09 | 2007-05-23 | 新疆大学 | 一种重组新疆家蚕抗菌肽制备方法及其获得的新疆家蚕抗菌肽与应用 |
| CN101319007A (zh) * | 2007-06-06 | 2008-12-10 | 中国农业科学院饲料研究所 | 具有高抑菌活性的新抗菌肽设计与合成 |
| CN102477457A (zh) * | 2010-11-23 | 2012-05-30 | 深圳市圣西马生物技术有限公司 | 一种适合工业化生产的检测抗菌肽产品的灵敏精确直观的方法 |
-
2013
- 2013-03-01 CN CN201310065813.4A patent/CN103173517B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1966709A (zh) * | 2006-11-09 | 2007-05-23 | 新疆大学 | 一种重组新疆家蚕抗菌肽制备方法及其获得的新疆家蚕抗菌肽与应用 |
| CN101319007A (zh) * | 2007-06-06 | 2008-12-10 | 中国农业科学院饲料研究所 | 具有高抑菌活性的新抗菌肽设计与合成 |
| CN102477457A (zh) * | 2010-11-23 | 2012-05-30 | 深圳市圣西马生物技术有限公司 | 一种适合工业化生产的检测抗菌肽产品的灵敏精确直观的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| "Antimicrobial Activity of Novel Dendrimeric Peptides Obtained by Phage Display Selection and Rational Modification";Alessandro Pini et.al.;《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》;20050731;第49卷(第7期);第2666页右栏第2-3自然段；第2667页左栏第1自然段，右栏第3-4自然段；第2668页左栏第1自然段；表1；图1 * |
| Alessandro Pini et.al.."Antimicrobial Activity of Novel Dendrimeric Peptides Obtained by Phage Display Selection and Rational Modification".《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》.2005,第49卷(第7期), |
| Approved Guideline".《NCCLS》.1999,第19卷(第18期), |
| Arthur L. Barry et.al.."Methods for Determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents |
| 李小芳等."重组抗菌肽S-thanatin的表达纯化及不同MIC鉴定方法对其结果的影响".《东南大学学报（医学版）》.2011,第30卷(第2期), |
| 李小芳等."重组抗菌肽S-thanatin的表达纯化及不同MIC鉴定方法对其结果的影响".《东南大学学报(医学版)》.2011,第30卷(第2期), * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103173517A (zh) | 2013-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2505813C1 (ru) | Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам | |
| CN103173517B (zh) | 微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌和最小杀菌浓度的方法 | |
| CN101961014A (zh) | 一种防治蔬菜真菌病害微生物农药的制备方法 | |
| CN103289963A (zh) | 一株具有环境消毒能力的噬菌体及其用途 | |
| CN107164454A (zh) | 苯扎氯铵溶液微生物限度检查方法 | |
| CN104004663B (zh) | 捕食线虫性真菌生物冻干制剂的制备方法 | |
| CN102021131A (zh) | 一种地衣芽孢杆菌菌株及其应用 | |
| CN105018395B (zh) | 一株短小芽孢杆菌及其在防治苹果斑点落叶病中的应用 | |
| CN104293661A (zh) | 一种快速抗菌试验方法及试剂盒 | |
| CN101381762A (zh) | 一种改进的拮抗细菌生物测定方法 | |
| CN108633909A (zh) | 氧化石墨烯在防治植物疫霉病菌方面的应用 | |
| CN115633697A (zh) | 一种含小檗碱的组合物、药肥及其制备方法和应用 | |
| CN104450546A (zh) | 一种防治由镰刀菌引起辣椒土传病害的sy-17菌株及其生防菌剂 | |
| CN109400444A (zh) | 抑制植物病源真菌的倍半萜类化合物及其制备方法 | |
| CN108812699A (zh) | 一种氧化石墨烯和拮抗菌复配的植物疫霉病抗菌剂 | |
| CN108991006A (zh) | 一种防治植物疫霉病的氧化石墨烯复配拮抗菌剂 | |
| CN111066821A (zh) | 解淀粉芽胞杆菌在防治烟草白粉病和烟草黑胫病中的应用及其菌剂 | |
| CN204185488U (zh) | 一种快速抗菌试验试剂盒 | |
| Kumar et al. | Leucas cephalotes (Spreng): photochemical investigation and antimicrobial activity via cylinder-plate method or cup-plate method | |
| CN109628226B (zh) | 孔雀草精油及其应用 | |
| Dinesh et al. | Study of antifungal activity of boric acid on vaginal pathogens | |
| Gowri et al. | In-Vitro antimicrobial screening of naphthalene acetic acid compounds. | |
| CN104651475A (zh) | 一种稀土抗菌剂实验菌接种方法 | |
| CN104651255A (zh) | 一种豆粉琼脂培养基及其应用 | |
| CN108782610A (zh) | 氧化石墨烯和拮抗菌复配在防治植物疫霉病方面的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Li Zhixue Inventor after: Wang Yizhen Inventor after: Han Feifei Inventor after: Huang Xia Inventor after: Liu Dan Inventor before: Wang Yizhen Inventor before: Li Zhixue Inventor before: Han Feifei Inventor before: Huang Xia Inventor before: Liu Dan |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: WANG YIZHEN LI ZHIXUE HAN FEIFEI HUANG XIA LIU DAN TO: LI ZHIXUE WANG YIZHEN HAN FEIFEI HUANG XIA LIU DAN |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |