CN102517240B - 适合白色念珠菌与葡萄球菌共同生长的固体培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于白色念珠菌和葡萄球菌共同培养的培养基，具体涉及不同营养组分、钙离子及血液对白色念珠菌及葡萄球菌生长的影响，探讨最适合二者生长的培养基配比。其配方包含如下组分且各组分按质量百分比为：酵母膏0.15％-0.25％，蛋白胨1.15％-1.25％，葡萄糖0.3％-0.5％，NaCl 0.375％-0.425％，牛肉粉0.25％-0.255％，琼脂粉1.575％-1.625％。本发明采用白色念珠菌及金黄色葡萄球菌/表皮葡萄球菌进行研究，通过平板划线法直接评价培养基对白色念珠菌及金黄色葡萄球菌/表皮葡萄球菌菌落大小及形态的影响。结果证实，采用本培养基白色念珠菌及金黄色葡萄球菌/表皮葡萄珠菌均可生长良好。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及适合白色念珠菌与葡萄球菌共同生长的固体培养基。
背景技术
近年来，随着恶性肿瘤、艾滋病、自身免疫病等发病率的增多，导管插管和器官移植等技术的开展，广谱抗生素、皮质激素和免疫抑制剂的广泛使用，真菌感染的发病率急剧上升(Georgopapadakou NH.Antifungals：mechanism of action and resistance，established andnovel drugs[J].Current Opinion in Microbiology，1998，1(5)：547-557.)，特别是呼吸机与大量生物材料的应用，使得生物膜(biofilm，BF)相关性真菌的感染发生率不断增加。生物膜是微生物生活的普遍形态。生物膜(bioflim，BF)是一种附着于组织或生物材料表面，由其自身产生的胞外基质(extracellular maxtrix)包裹的有结构的一种或多种菌细胞群体。BillCosterton经过30年的研究发现，生物膜是微生物(细菌和真菌)生存的普遍形式(TomCoenye，Hans J.Nelis In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation.Journal of Microbiological Methods 2010，83：89-105)。BF可以由一种菌形成，也可由多种微生物混合生长形成。
人体内存在多种BF混合感染的情况，白色念珠菌和葡萄球菌是常见的混合感染分离菌。念珠菌是人体内常见的共生菌，根据美国院内感染控制组织的资料，白色念珠菌是第4位引起院内血流感染的病原微生物，但却是死亡率最高的致病菌，死亡率可高达40％。白念具有较强的形成生物膜的能力，几乎于所有的医疗设备上均能形成生物膜。
葡萄球菌是院内感染的主要条件致病菌，大多数植入相关的感染都是由葡萄球菌引起的，特别是金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(Brian M.Peters，Mary Ann Jabra-Rizk，Mark A.Scheper，Jeff G.Leid，John William Costerton and Mark E.Shirtliff.Microbial interactions andprotein expression in Staphylococcus aureus Candida albicans dual-species biofilms.FEMS Immunol Med Microbiol 2010，59：493-503)。研究表明白色念珠菌形成生物膜的骨架结构，细菌生长依附于白念的菌丝周围，形成混合BF。其中金黄色葡萄球菌对白念的吸附能力最强。另有研究指出，在混合生物膜内表皮葡萄球菌和白色念珠菌表现出广泛的交互作用，并且某些表皮葡萄球菌株产生的胞外聚合物能阻止氟康唑渗入混合真菌-细菌生物膜(Adam B，Baillie GS，Douglas LJ，et al.Mixed species biofilms of Candida albicans andStaphylococcus epidermidis[J].Journal Of Medical Microbiology，2002，51(4)：344-349)。据报道，27％院内白色念珠菌血液感染伴有细菌感染，金黄色葡萄球菌是第三个常见的复合感染菌。真菌角膜炎是临床常见感染，研究表明，在亚洲30-60％的真菌角膜炎伴细菌混合感染(Douglas L.J.Candida biofilms and their role in infection[J].Trends Microbiol.2003，11(1)：30-36)。在50例口炎中，39例为白色念珠菌与葡萄球菌混合定植，这些混合共生菌群通常以混合生物膜的方式存在，治疗非常困难。
目前，有关抗真菌与细菌混合感染的研究不断增多，适合真菌与细菌分别培养与药效研究的培养基已有现成的产品。细菌培养常用的培养基是营养琼脂。YPD(Yeast ExtractPeptone Dextrose Medium)培养基，又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，主要配方是：1％YeastExtract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)，若制固体培养基，加入2％琼脂粉，主要用于酵母菌的培养，是目前常用的培养白色念珠菌的固体培养基之一，但适合念珠菌与葡萄球菌共同培养的培养基目前还没有成熟的产品可供使用。
本实验室前期研究发现，不同培养基对白色念珠菌及葡萄球菌生长的影响较为明显。二者在不同培养基培养时，由于培养基的营养限制，对其生长状态及敏感性都产生影响。因此，发现一种适用于白色念珠及金黄色葡萄球菌的培养基对研究混合生物膜及单一白色念珠菌生物膜具有实用意义。
现有研究中(Pate JC，Jones DB and Wilhelmus KR.Prevalence and spectrum of bacterialco-infection during fungal keratitis.Br.J.Ophthalmol.2006，90：289-292)，已有在液体培养基中对混合生物膜形态及BF中真菌及细菌的信号分子变化的研究，但没有对混合菌在固体培养基上形态及药效作用的观察实验。固体培养基作为微生物生长的基质，可以提供直观且真实的药效作用实验结果，因此，选用一种适合真菌和细菌同时生长的培养基、特别是适用于白色念珠菌与葡萄球菌共同培养与研究的固体培养基具有重要的科研意义。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种适合白色念珠菌与葡萄球菌共同生长的固体培养基。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种适合白色念珠菌与葡萄球菌共同生长的固体培养基，其配方包含如下组分且各组分按质量百分比为：酵母膏0.15％-0.25％，蛋白胨1.15％-1.25％，葡萄糖0.3％-0.5％，NaCl0.375％-0.425％，牛肉粉0.25％-0.255％，琼脂粉1.575％-1.625％，余量为水。
优选地，其配方包含如下组分且各组分按质量百分比为：酵母膏0.25％，蛋白胨1.25％，葡萄糖0.5％，NaCl 0.375％，牛肉粉0.25％，琼脂粉1.625％，余量为水。
其配方还包括质量百分比为4％-6％的羊血。
其配方还包括质量百分比为0.0005％-0.0015％的CaCl2。
本发明采用白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌进行研究，通过观察二者菌落大小、形态及颜色，评价不同营养成分的培养基对其生长的影响。具体内容如下：
A：白色念珠菌是临床真菌感染的常见致病菌，并且是BF相关感染及混合BF感染的致病菌之一。葡萄球菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)也是混合BF感染的常见致病细菌。研究适用于二者混合生长的培养基具有明显的可行性和实际的临床意义。
B：不同配方混合固体培养基对白色念珠菌和葡萄球菌生长形态的影响：以不同比例的酵母膏，蛋白胨，葡萄糖，NaCl，牛肉粉，琼脂粉配制培养基，观察不同配比组方对白色念珠菌和葡萄球菌生长状况、菌落大小及形态的影响，确定最佳配比。
C：羊血对白色念珠菌和葡萄球菌生长形态的影响：血平板是临床微生物学检查常用的培养基，理论上可以为真菌和细菌都提供良好的营养环境。本发明在上述不同配比的基础上加入质量百分比为4％-6％的羊血，观察对白色念珠菌和葡萄球菌菌落大小及形态的影响，确定最佳配比。
D：不同浓度钙离子(Ca2+)对白色念珠菌与葡萄球菌生长形态的影响：本发明在上述不同配比的基础上加入质量百分比为0.0005％-0.0015％的CaCl2，观察对白色念珠菌和葡萄球菌菌落大小及形态的影响，确定最佳配比。
本发现与现有技术相比，具有以下有益效果：
1.本发明考查了各种营养成分及羊血、钙离子对白色念珠菌和葡萄球菌共同培养的影响，可提供白色念珠菌和葡萄球菌良好的营养环境，使二者可在此培养基上具有良好的生长状态。
2.本发明所用培养基，配制方法简单，营养丰富，真菌细菌生长状态良好，是一种方便可行的用于白色念珠菌和葡萄球菌混合生长的培养基。
本发明还为抗白色念珠菌与葡萄球菌混合感染的实验室研究提供培养基选择的数据，为混合生物膜的研究提供载体，为克服混合生物膜耐药提供研究技术支持。
本发明采用不同敏感程度的白色念珠菌及金黄色葡萄球菌进行研究，通过平板划线法直接评价培养基对白色念珠菌及金黄色葡萄球菌菌落大小及形态的影响。
附图说明
图1是葡萄球菌与白色念珠菌于不同配比培养基上的生长(A-E所使用的培养基分别为表1中相应的培养基)；
图2是表皮葡萄球菌与白色念珠菌于增加配比培养基上的生长(F-I所使用的培养基分别为表2中相应的培养基)；
图3是羊血对菌株生长影响；
图4是Ca2+对菌株生长的影响。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实例1.用于真菌和细菌混合培养的固体培养基成分的筛选
1.实验材料
1.1菌株：
经鉴定的白色念珠菌CA1，由山东省千佛山医院临床分离获得，山东省卫生防疫站鉴定。金黄色葡萄球菌SA10，表皮葡萄球菌SE9，山东省医学科学院微生物室惠赠。
1.2试剂：
酵母膏，蛋白胨，葡萄糖，NaCl，牛肉粉，琼脂粉，购于鼎国生物科技有限公司；
无水氯化钙，天津市博迪化工有限公司，以无菌蒸馏水配成4.5mmol/L的储备液，备用；
磷酸盐缓冲液(PBS)：称取KH2PO4 0.24g，Na2HPO4·12H2O 1.44g，NaCl 0.2g，KCl 8g，调pH 7.4，定容1L，蒸汽灭菌，室温保存。
羊血：山东省千佛山医院感染科惠赠。
1.3仪器：
AB204-N电子天平(梅特勒-托利公司)，SVE-4A1超净工作台(新加坡ESCO公司)，INCUCELL 55恒温培养箱(德国MMM公司)，VENTICELL55干热灭菌箱(德国MMM公司)，可调式移液器(Thermo Electron公司)，SC-329常温冰箱(中国海尔公司)，G-560E涡旋混合器(美国Si公司)。
2.实验方法：
2.1菌液的制备
挑取传代后生长良好的白色念珠菌的单个菌落，用PBS配制成菌悬液，于涡旋器振荡混匀后以中国细菌浊度标准管比浊，使得样品管与标准管浊度基本一致，此时白色念珠菌的菌浓度约为4.5×106CFU/ml。将该浓度白色念珠菌株的菌悬液用PBS稀释30倍，成为约1.5×105CFU/ml浓度的工作菌液。
挑取传代后生长良好的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的单个菌落，用PBS配制成菌悬液，于涡旋器振荡混匀后以中国细菌浊度标准管比浊，使得样品管与标准管浊度基本一致，此时金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的菌浓度约为1.5×108CFU/ml。将该浓度的菌悬液用PBS稀释1000倍，成为约1.5×105CFU/ml浓度的工作菌液。
2.2不同配比培养基的制备
将酵母膏，蛋白胨，葡萄糖，NaCl，牛肉粉，琼脂粉按不同比例加入锥形瓶中(具体配比见表1，以无菌蒸馏水定容，于高压锅121℃灭菌15分钟。向上述培养基中加羊血(4％、5％、6％)和CaCl2溶液(0.0005％、0.001％和0.0015％)，形成不同组分配比的固体培养基。
表1 不同配比的培养基
2.3平板划线与培养
挑取头部大小一致的灭菌棉签，将其头部在4ml的工作菌液中完全润湿。划线前将菌液与棉签一起蜗旋震荡，使细菌和真菌细胞在棉签上均匀的附着，以蘸取出浓度基本一致的各工作菌液。用带菌棉签在各含药平板特定区域内均匀划线接种。最后，将平板于35℃恒温培养，观察生长24h和48h后的菌株情况。
3.实验结果
3.1各种营养成分配比的筛选
酵母膏，蛋白胨，葡萄糖，NaCl，牛肉粉，琼脂粉的不同配比对真菌和细菌的生长影响较大。随着酵母膏配比增加、牛肉粉的配比减少，白色念珠菌的长势变好；随着牛肉粉的配比增加、酵母膏配比减少，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的长势变好，两种菌株48h生长状态较24h旺盛，结果见图1。图1中前两行分别为表皮葡萄球菌与白色念珠菌于不同配比培养基上的生长的情况(24h和48h后)；后两行分别为金黄色葡萄球菌与白色念珠菌于不同配比培养基上的生长的情况(24h和48h后)。综合24h与48h的结果，确定D配比为初选方案。
3.2各种营养成分区间的确定
为了寻找更适合白色念珠菌和葡萄球菌共同生长的培养基并确定浓度区间，在D和E之间增加了四组浓度梯度F-I，见表2，其中白色念珠菌和表皮葡萄球菌的生长结果见图2。综合24h和48h的生长结果，确定：酵母膏0.15％-0.25％，蛋白胨1.15％-1.25％，葡萄糖0.3％-0.5％，NaCl 0.375％-0.425％，牛肉粉0.25％-0.255％，琼脂粉1.575％-1.625％的混合培养基为适合白色念珠菌和葡萄球菌共同生长的培养基。由图1与图2综合所见，D配比为最佳方案。
表2 增加了四组浓度梯度的培养基
实例2.羊血对菌株生长影响实验
1.实验材料
1.1菌株：
经鉴定的白色念珠菌CA1，由山东省千佛山医院临床分离获得，山东省卫生防疫站鉴定。金黄色葡萄球菌SA10，表皮葡萄球菌SE9，山东省医学科学院微生物室惠赠。
1.2试剂：
酵母膏，蛋白胨，葡萄糖，NaCl，牛肉粉，琼脂粉，购于鼎国生物科技有限公司；
无水氯化钙，天津市博迪化工有限公司，以无菌蒸馏水配成4.5mmol/L的储备液，备用；
磷酸盐缓冲液(PBS)：称取KH2PO4 0.24g，Na2HPO4·12H2O 1.44g，NaCl 0.2g，KCl 8g，调pH 7.4，定容1L，蒸汽灭菌，室温保存。
2.实验方法
菌液的制备与培养基的制备方法如上。在以上不同营养配比的基础上，加入4％-6％的羊血，观察其对菌白念珠菌与葡萄球菌生的的影响。
3.结果
加入羊血，对白色念珠菌的生长状态影响不大，能够略微促进金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生长，总体来讲对白念珠菌与葡萄球菌生的共同培养影响不大，其中加入5％羊血的结果见图3。
实例3.Ca2+对菌株生长影响实验
1.实验材料
1.1菌株：
经鉴定的白色念珠菌CA1，由山东省千佛山医院临床分离获得，山东省卫生防疫站鉴定。金黄色葡萄球菌SA10，表皮葡萄球菌SE9，山东省医学科学院微生物室惠赠。
1.2试剂：
酵母膏，蛋白胨，葡萄糖，NaCl，牛肉粉，琼脂粉，购于鼎国生物科技有限公司；
羊血：山东省千佛山医院感染科惠赠。
磷酸盐缓冲液(PBS)：称取KH2PO4 0.24g，Na2HPO4·12H2O 1.44g，NaCl 0.2g，KCl 8g，调pH 7.4，定容1L，蒸汽灭菌，室温保存。
2.实验方法
菌液的制备与培养基的制备方法如上。在以上不同营养配比的基础上，加入质量百分比为0.0005％-0.0015％的CaCl2，观察其对菌白念珠菌与葡萄球菌生的的影响。
3.结果
加入钙离子，对比24h和48h生长结果，发现Ca2+对菌株生长的促进作用并不显著，其结果见图4。
Claims (3)
1.一种适合白色念珠菌与葡萄球菌共同生长的固体培养基，其特征在于，其配方包含如下组分且各组分按质量百分比为：酵母膏0.25%，蛋白胨1.25%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.375%，牛肉粉0.25%，琼脂粉1.625%，余量为水。
2.根据权利要求1所述的适合白色念珠菌与葡萄球菌共同生长的固体培养基，其特征在于，其配方还包括质量百分比为5%的羊血。
3.根据权利要求1所述的适合白色念珠菌与葡萄球菌共同生长的固体培养基，其特征在于，其配方还包括质量百分比为0.0005％、0.001%或0.0015％的CaCl2。
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