CN101177668B - 淋球菌培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淋球菌培养基，其特征在于，组分包括基础培养基、羊血和抑菌剂：①基础培养基：蛋白胨1.0～2.0份，玉米淀粉0.05～0.15份，K₂HPO₄0.2～0.8份，KH₂PO₄0.05～0.2份，NaCl0.25～1.0份，琼脂1～3份；②羊血3～10份；③抑菌剂：万古霉素0.003～0.005份或者林可霉素0.003～0.01份、多粘菌素0.0075～0.015份、制霉菌素0.417～0.667份和三甲氧苄二氨嘧啶0.005～0.01份。该培养基适于基层医疗机构，性能优良的，制备方法简单合理，既克服现有技术中所存在的缺点，又保证分离培养效果。

Description

淋球菌培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及体外生物诊断试剂技术领域，具体涉及一种淋球菌培养基及其制备方法。

背景技术

淋病是由淋病奈瑟菌所引起的泌尿生殖系统化脓性炎症，在所有传染性疾病中发病人数仅次于流行性感冒而居第二位。由于其自身的危害性及其同艾滋病的协同作用，严重威胁我国人民的健康生活。

淋球菌培养法是WHO推荐的诊断淋病的“金标准”。其培养质量的关键之一个是淋球菌培养基的性能。目前国内使用的培养基主要是进口淋球菌培养基如T-M培养基、进口分装淋球菌培养基、国产桂敏培养基和自制巧克力培养基等。一般认为这些经典培养基性能稳定，没有缺陷，其实不然，根据我室10多年使用进口培养基的经验和文献报道，国外有名的培养基如有许多不尽人意的地方，主要有这几方面1、一般培养基采用的抑菌剂，多为万古霉素，据报道有5％～30％临床分离株对万古霉素敏感，而在培养基上不能生长，我们在门诊标本中也遇到类似情况；2、在培养基中葡萄糖含量过低，在此培养基上生长的细菌，做进一步确认试验时，一般是阴性结果，不能支持临床；3、进口培养基多采用大包装，价格较贵，转运周期长，实际使用期短，导致标本少的基层医疗单位浪费严重。进口分装淋球菌培养基如珠海黑马生物技术公司产的MTM淋球菌选择培养基培养性能较高，实际使用期较长，但是其价格较贵，7cm/个规格10元人民币。

国产淋球菌培养基普遍具有原材料易得，价格便宜，适合基层医疗单位等优点，但是也存在培养性能不高，自制过程繁琐，质量参差不齐，不易控制等问题。国家性病防治中心所推荐的桂敏淋球菌培养基价格适中，但是培养性能不高，其淋球菌检出率仅80％～90％，仍然存在10％～20％的漏检。关于巧克力色培养基，有研究者报道，其成本低廉，但对淋球菌分离培养的效果不理想，检出率仅为50％～60％；卵黄选择培养基，以卵黄代替ISO-vitalex液和血红蛋白粉，加入一定比例的酵母浸液和葡萄糖，当淋球菌浓度为2×10⁴cfu/ml时，卵黄选择培养基上菌落数量显著高于T-M培养基，生长速度基本相当，但卵黄液制作过程烦琐，不适宜推广应用。有将1640应用于淋球菌分离培养基的研究，其结果是，该培养基临床分离率与桂敏培养基分离率完全一致。到目前为止，国内还没有一种获得许可商品化生产的淋菌培养基。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提供一种淋球菌培养基及其制备方法，该培养基适于基层医疗机构，性能优良的，制备方法简单合理，既克服现有技术中所存在的缺点，又保证分离培养效果。

本发明所提出的技术问题是这样解决的：提供一种淋球菌培养基，其特征在于，组分包括基础培养基、羊血和抑菌剂：

①基础培养基：蛋白胨1.0～2.0份，玉米淀粉0.05～0.15份，K₂HPO₄0.2～0.8份，KH₂PO₄ 0.05～0.2份，NaCl 0.25～1.0份，琼脂1～3份；

②羊血3～10份；

③抑菌剂：万古霉素0.003～0.005份或者林可霉素0.003～0.01份、多粘菌素0.0075～0.015份、制霉菌素0.417～0.667份和三甲氧苄二氨嘧啶0.005～0.01份；

制备方法包括以下步骤：

①按照上述重量比将蛋白胨，玉米淀粉，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钠依次加入蒸馏水中，加热搅拌，使其充分溶解；

②再将琼脂加入，继续加热至完全融化；

③用pH试纸测试步骤②所得溶液的pH值，调节pH值为7.2～7.4为止；

④将步骤③所得溶液高压灭菌后取出，待冷却到50～60℃左右，无菌操作加入上述比例羊血和抑菌剂，充分混匀；

⑤缓缓倾注于容器中，待培养基凝固后，放置检查，如末长杂菌，既为成品。

按照本发明所提供的淋球菌培养基，其特征在于，还包括添加剂，所述添加剂为：皂素、活性碳粉和胎牛血清，其重量比如下：

皂素                2～8份

活性碳粉            0.5～3份

胎牛血清            3～8份。

上述淋球菌培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①按比例将蛋白胨，玉米淀粉，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钠，活性炭粉，依次加入蒸馏水中，加热搅拌，使其充分溶解；②再将称好的琼脂加入，继续加热至完全融化；③用pH试纸测试步骤②所得溶液的pH值，调节到培养基pH值为7.2～7.4为止；④在抽取的羊血中加入皂素，使红细胞充分溶解，待用；⑤步骤③所得溶液高压灭菌15分钟后取出，待冷却到50～60℃左右，无菌操作加入羊血、胎牛血清及抑菌剂，充分混匀；⑥缓缓倾注于容器中，待培养基凝固后，放置检查，如末长杂菌，既为成品。

按照本发明所提供的淋球菌培养基的制备方法，其特征在于，在步骤③中，用10％HCl或10％NaOH进行所得溶液的pH值调节。

本发明所提供的淋球菌培养基，质优且经济，真正适于基层医疗机构广泛应用的新型的、性能优良的、使用方便的单人单份国产化淋菌培养基，该淋球菌既克服以上所述的缺点，又保证分离培养效果，将对我国淋病实验室诊断水平的提高产生重要意义。另外制备方法简单合理。

具体实施方式

下面结合试验以及具体实施例对本发明作进一步的说明。

初步确定本发明的培养基的各成分及其比例：基础培养基(1.0～2.0％蛋白胨，0.05～0.15％玉米淀粉，0.2～0.8％K₂HPO₄，0.05～0.2％KH₂PO₄，0.25～1.0％Nacl，琼脂1～3％)，3％～10％羊血，抑菌剂(0.003～0.005％万古霉素、0.0075～0.015％多粘菌素、0.417～0.667％制霉菌素、0.005～0.01％三甲氧苄二氨嘧啶)。

培养基的配制：1、用清洁的1000ml量筒量取852ml蒸馏水，加入到2000ml烧杯中；2、使用电子天平称取蛋白胨15克，玉米淀粉1克，磷酸氢二钾(K2HPO4)4克，磷酸二氢钾(KH2PO4)1克，氯化钠(NaCl)5克，琼脂10克；3、将蛋白胨，玉米淀粉，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钠依次加入蒸馏水中，加热搅拌，使其充分溶解，再将称好的琼脂加入，继续加热至完全融化，并不断搅拌，以免琼脂糊底烧焦；4、用pH试纸测试培养基的pH值，如不符合需要，可用10％HCl或10％NaOH进行调节，直到调节到培养基pH值为7.2～7.4为止；5、将溶解的培养基转入到1000ml规格的三角烧瓶中，用棉塞堵住瓶口，塞好棉塞，盖上厚纸用绳捆紧。121℃高压灭菌15分钟后取出，待冷却到50～60℃左右，于事先灭菌好的超净工作台上，无菌操作加入8％羊血，及抑菌剂，充分混匀；6、缓缓倾注于9cm的一次性塑料平皿中。每个培养皿中约倒入10毫升，以以铺满皿底为度。铺放培养基后放置15分钟左右，待培养基凝固后，再5个培养皿一叠，倒置过来，平放在恒温箱里，24小时后检查，如培养基末长杂菌，即可使用。

另实验后确定配方范围(百分比中其他为蒸馏水)：基础培养基(1.0～2.0％蛋白胨，0.05～0.15％玉米淀粉，0.2～0.8％K₂HPO₄，0.05～0.2％KH₂PO₄，0.25～1.0％NaCl，琼脂1～3％)，3％～10％羊血，2～8％皂素，0.5～3％活性炭粉，3～8％胎牛血清，抑菌剂(0.003～0.01％林可霉素、0.0075～0.015％多粘菌素、制霉菌素0.417～0.667％(1250～2000U/ml)、0.005～0.01％三甲氧苄二氨嘧啶)，其中皂素、活性碳粉和胎牛血清属于添加剂。另外最佳配方(各组份的重量比)为蛋白胨1.5份或1.8份、玉米淀粉0.1份或者0.12份，K₂HPO₄0.5份或0.6份，KH₂PO₄0.15份或者0.18份，NaCl0.5份或者0.6份，琼脂1.5份或2份，羊血5份或6份，皂素5份或6份，活性碳粉2份或1.5份，胎牛血清4份或7份，抑菌剂中林可霉素0.008份或0.009份、多粘菌素0.008或0.014份、制霉菌素0.45或0.5份(1250～2000U/ml)、三甲氧苄二氨嘧啶0.006或0.008份。

配制过程：1、用清洁的1000ml量筒量取852ml蒸馏水，加入到2000ml烧杯中；2、使用电子天平称取蛋白胨15克，玉米淀粉1克，磷酸氢二钾(K2HPO4)4克，磷酸二氢钾(KH2PO4)1克，氯化钠(NaCl)5克，活性炭粉10克，琼脂10克；3、将蛋白胨，玉米淀粉，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钠，活性炭粉，依次加入蒸馏水中，加热搅拌，使其充分溶解。再将称好的琼脂加入，继续加热至完全融化。并不断搅拌，以免琼脂糊底烧焦；4、用pH试纸测试培养基的pH值，如不符合需要，可用10％HCl或10％NaOH进行调节，直到调节到培养基pH值为7.2～7.4为止；5、在抽取的羊血中加入3％皂素，使红细胞充分溶解，待用；6、将溶解的培养基转入到1000ml规格的三角烧瓶中，用棉塞堵住瓶口。塞好棉塞，盖上厚纸用绳捆紧。121℃高压灭菌15分钟后取出，待冷却到50～60℃左右，于事先灭菌好的超净工作台上，无菌操作加入8％羊血，5％胎牛血清及抑菌剂(3～10mg/L林可霉素、7.5mg/L多粘菌素、1250U/ml制霉菌素、5mg/L三甲氧苄二氨嘧啶)，充分混匀；7、缓缓倾注于9cm的一次性塑料平皿中。每个培养皿中约倒入10毫升，以铺满皿底为度。铺放培养基后放置15分钟左右，待培养基凝固后，再5个培养皿一叠，倒置过来，平放在恒温箱里，24小时后检查，如培养基末长杂菌，即可使用。

试验部分

取性病病人男性尿道或女性宫颈分泌物20例于英国Oxoid公司生产的T-M培养基分离培养，24h或48h后挑取可疑单个菌落，经革兰染色、氧化酶实验及糖发酵实验鉴定。涂片为G^-双球菌，氧化酶阳性，只分解葡萄糖而不分解乳糖、麦芽糖和蔗糖。

将确认为淋病奈瑟菌的菌落接种于不含抗生素的T-M培养基上增菌，分离后的纯菌收集于30％甘油肉汤-70℃保存。

标本来源及菌株收集：临床菌株20株，分纯增菌，收集于30％甘油肉汤，-70℃保存。淋球菌菌株：WHO的质控菌株A、B、C、D、E及WQ3TRNG株均由中国协和医科大学皮肤病研究所提供，四川省皮肤病性病研究所实验室保存。对照菌株：大肠埃希菌(ATCC-25922)、普通变形杆菌(ATCC-13315)、金黄色葡萄球菌(ATCC-25923)、白色念珠菌均由中国协和医科大学皮肤病研究所提供，四川省皮肤病性病研究所实验室保存。

试验所需组分：1、T-M培养基，进口T-M培养基(英国Oxiod公司，按说明书配制)；2、国产淋球菌培养基，淋球菌培养基(中国珠海黑马公司)；3、菌株保存培养基：30％甘油肉汤，高压灭菌，-20℃冰箱保持备用，菌株保存-70℃，4、抗生素：万古霉素、林可霉素、多粘菌素、制霉菌素、三甲氧苄二氨嘧啶等由中国医学科学院皮肤病研究所提供；

主要化学试剂：1、氧化酶试剂：1％新配制的盐酸四甲基对苯二胺水溶液，工作液每天配制；2、生化试剂：葡萄糖培养管、麦芽糖培养管、蔗糖培养管：杭州天和微生物试剂有限公司；3、化学试剂：葡萄糖、溴甲酚紫乙醇、K₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl：成都豪迈公司提供；

主要仪器：1、移液器(法国GILSON公司)；2、显微镜(日本奥林帕斯公司)；3、培养箱(上海跃进医疗器械厂)；4、烛缸(成都玻璃器皿厂)；5、NW系列超纯水系统(力康生物医疗科技集团)。

一、预实验：

(1)淋球菌菌株准备：复苏5株淋球菌，用无抑菌剂的T-M培养基24h培养增菌；

(2)培养效果预实验：

①分别挑取5株淋球菌单个菌落于生理盐水，配成0.5麦氏单位浓度(相当于1.5×10⁸cfu/ml)菌悬液；

②将菌悬液用生理盐水稀释到10⁴cfu/ml，再依次倍比稀释至10^-2cfu/ml；

③将不同浓度的菌悬液分别吸取10ul接种于新型培养基，置烛缸35℃培养，24h后观察记录淋球菌生长情况；

④根据实验结果确定对比实验中的淋球菌浓度梯度范围。(表1-1)

(3)抑菌效果预实验：

①将标准菌株大肠杆菌ATCC-25922、普通变形杆菌ATCC-13315、金黄色葡萄球菌ATCC-25923、白色念珠菌传代培养；

②分别挑取单个菌落于生理盐水配成0.1麦氏单位浓度(相当于3×10⁷cfu/ml)菌悬液；

③将菌悬液用生理盐水稀释成10⁷cfu/ml，再依次倍比稀释至10²cfu/ml；

④将不同浓度的菌悬液均匀涂布于新型培养基，37℃培养48h，逐日观察细菌生长情况；

⑤根据实验结果确定抑菌实验中的细菌浓度梯度范围。(表1-2)

校正培养基：(1)根据培养效果，调整培养基的成份和抑菌剂(见结果4.3)；(2)在培养基中加入10g/L葡萄糖和1.6％溴甲酚紫乙醇，观察淋球菌在培养基上的产酸情况；

二、本发明所提供的培养基的性能测定：

实验分组如下：

实验组：本发明所提供的新型淋球菌培养基

对照组：选用英国Oxoid公司生产的T-M培养基和国产MTM选择培养基(珠海黑马公司生产)共2组

1.培养效果对比实验：

(1)复苏20株淋球菌，用无抑菌剂的T-M培养基24h培养增菌；

(2)分别挑取单个菌落于生理盐水，根据预实验确定的浓度范围配成浓度1×10⁴cfu/ml的菌悬液；

(3)吸取10ul接种经预热的三种培养皿，置烛缸35℃培养，在不同时间段观察细菌生长情况，记录菌落大小、菌落数。见表2-1，表2-2

2.抑菌效果测试：

(1)将标准菌株大肠杆菌ATCC-25922、普通变形杆菌ATCC-13315、金黄色葡萄球菌ATCC-25923、白色念珠菌传代培养；

(2)将四种细菌分别挑取单个菌落于生理盐水，根据预实验确定的浓度范围配成1×10⁷cfu/ml菌悬液；

(3)取菌悬液50ul均匀涂布于三种培养基各10个，37℃培养24-48h，每天观察细菌生长情况。见表2-3

3.临床标本分离培养效果测定：

(1)取我所性病门诊病人男性尿道或女性宫颈分泌物，涂片染色镜检有G^-双球菌的疑似淋病患者100例，取其分泌物同时划线接种三种培养基，置烛缸35℃培养；

(2)每24h观察一次培养基，若有可疑菌落生长，挑取涂片染色镜检，氧化酶实验和糖发酵实验确证为淋球菌，作96小时动态观察；

(3)比较三种培养基在不同时段对临床标本的的分离率。见表2-4

4.稳定性实验：

(1)将配制好的培养基置于2-8℃冰箱保存：

(2)每两周观察其外观、颜色、重量，并用复苏后的纯菌稀释到淋球菌的最适生长浓度，接种5个新型培养基，置烛缸35℃培养，24h及48h观察细菌生长情况，记录菌落大小、菌落数。见表2-5

5.试验结果

淋球菌培养浓度实验

表1-1     不同浓度淋球菌培养效果(cfu/ml)

根据实验结果，确定对比实验中的淋球菌浓度为1×10⁴cfu/ml

培养基抑菌效果预实验：

表1-2    不同浓度杂菌株抑制效果(cfu/ml)

根据实验结果，确定对比实验中的杂菌株浓度为3×10⁷cfu/ml。

新型淋球菌培养基成分：确定培养基的各成分及其比例为：基础培养基(蛋白胨1.5％，玉米淀粉0.1％，K₂HPO₄ 0.4％，KH₂PO₄ 0.1％，NaCl 0.5％，琼脂1％)，羊血3～10％，特殊添加剂，抑菌剂(3～10mg/L林可霉素、7.5mg/L多粘菌素、1250U/ml制霉菌素、5mg/L三甲氧苄二氨嘧啶)

新型淋球菌培养基培养效果对比试验

不同培养基之间菌落数的比较：3种淋球菌培养基问各时间段的菌落数不一样，18h和24h时菌落数由多到少排列为：实验组＞国产MTM＞TM，实验组与其它两组之间的差异具有显著性(P＜0.05)(见表2-1)。36h和48h时菌落数由多到少排列为：实验组＞国产MTM＞TM，实验组与TM之间的差异具有显著性(P＜0.05)(见表2-1)。

表2-1    3种淋球菌培养基间不同时间菌落数的统计结果

时间	菌落数(个)	F值	实-TM	实-国
					18h	实(62±3)＞国(54±3)＞TM(48±4)	8.042<sup>*</sup>	*	*
24h	实(78±2)＞国(69±3)＞TM(64±2)	6.270<sup>*</sup>	*	*
					36h	实(81±3)＞国(78±2)＞TM(75±3)	5.731<sup>*</sup>	*	-
48h	实(81±3)＞国(78±2)＞TM(75±2)	5.369<sup>*</sup>	*	-

注：SAS8.01统计分析软件，方差统计分析*表示具有显著性差异，-表示无显著性差异；( )内表示菌落数；检验水准α为0.05

培养基内部各时间段菌落数的比较：3种淋球菌培养基内各时间段内的菌落数也有差异。其中实验组18h与24h间菌落数的差异具有显著性(P＜0.05)(见表2-2)。TM培养基18h与24h间菌落数的差异具有显著性(P＜0.05)(见表2-2)。国产MTM18h与24h，24h与36h间菌落数的差异具有显著性(P＜0.05)(见表2-2)。

表2-2    3种淋球菌培养基内不同时间菌落数的统计结果

培养基	菌落数(个)	F值	18h-24h	24h-36h	36h-48h
						实验组	18h(62±3)＜24h(78±2)＜36h(81±3)≤48h(81±3)	956.861<sup>*</sup>	*	-	-
TM	18h(48±4)＜24h(64±2)＜36h(75±3)≤48h(75±3)	561.448<sup>*</sup>	*	*	-
						国产	18h(54±3)＜24h(69±3)＜36h(78±2)≤48h(78±2)	247.982<sup>*</sup>	*	*	-

注：SAS8.01统计分析软件，方差统计分析；*表示具有显著性差异，-表示无显著性差异；( )内表示菌落数；检验水准α为0.05

不同培养基之间菌落大小的比较：18h时菌落大小由大到小排列为实验组＞国产MTM＞TM，TM和其它两者之间的差异具有显著性(P＜0.05)。24h时，菌落大小由大到小排列为国产MTM＞实验组＞TM。TM与国产MTM之间的差异具有显著性(P＜0.05)。36h时菌落大小由大到小排列为国产MTM＞TM＞实验组。实验组与其它两组之间的差异具有显著性(P＜0.05)。48h时菌落大小由大到小排列为国产MTM＞TM＞实验组。实验组与国产MTM间的差异具有显著性(P＜0.05)(见表2-3)。

表2-3    3种淋球菌培养基间不同时间菌落大小的统计结果

时间	菌落大小	F值	实-TM	实-国	TM-国
						18h	实(0.25±0.02)≥国(0.25±0.02)＞TM(0.14±0.03)	6.959<sup>*</sup>	*	-	*
24h	国(0.60±0.05)＞实(0.53±0.05)＞TM(0.42±0.05)	5.363<sup>*</sup>	-	-	*
						36h	国(1.52±0.2)＞TM(1.35±0.1)＞实(1.13±0.13)	7.889<sup>*</sup>	*	*	-
48h	国(1.84±0.25)＞TM(1.70±0.1)＞实(1.50±0.1)	4.275<sup>*</sup>	-	*	-

注：SAS8.01统计分析软件，方差统计分析；*表示具有显著性差异，-表示无显著性差异；( )内表示菌落大小；检验水准α为0.05

培养基内部各时间段菌落大小的比较：3种培养基内的菌落大小均随时间增长而增长，各时间段间菌落大小的差异均具有显著性(P＜0.05)(见表2-4)。

表2-4    3种淋球菌培养基内不同时间菌落大小的统计结果

培养基	菌落大小(mm)	F值	18h-24h	24h-36h	36h-48h
						实验组	18h(0.25±0.02)＜24h(0.53±0.05)＜36h(1.13±0.13)＜48h(1.50±0.1)	956.861<sup>*</sup>	*	*	*
TM	18h (0.14±0.03)＜24h(0.42±005)＜36h (1.35±0.1)＜48h(1.70±0.1)	561.448<sup>*</sup>	*	*	*
						国产	18h(0.25±0.02)＜24h(0.60±0.05)＜	247.982<sup>*</sup>	*	*	*
	36h(1.52±0.2)＜48h(1.84±0.25)

注：SAS8.01统计分析软件，方差统计分析；*表示具有显著性差异，-表示无显著性差异；( )内表示菌落大小；检验水准α为0.05

本发明所提供的淋球菌培养基抑菌效果实验：常见的淋球菌培养基杂菌大肠埃希菌、普通变形杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌，三种培养基均有一定的抑制效果。大肠埃希菌抑制，三种培养基抑制作用无显著差异；普通变形杆菌抑制，新型淋球菌培养基优于TM培养基和国产MTM培养基；金黄色葡萄球菌抑制，新型淋球菌培养基优于TM培养基和国产MTM培养基；白色念珠菌抑制，新型淋球菌培养基优于TM培养基和国产MTM培养基；

表2-5    三种培养基的抑菌效果比较(3×10⁷cfu/ml)

注：SAS8.01统计分析软件，X²-test统计分析；

*P＞0.05大肠埃希菌抑菌效果同T-M组、国产组比较；▲P＜0.01普通变形杆菌抑菌效果同T-M组、国产组比较；◆P＜0.01金黄色葡萄球菌抑菌效果同T-M组、国产组比较：★P＜0.01白色念珠菌抑菌效果同T-M组、国产组比较；

临床标本分离培养效果测定：淋球菌临床菌株分离率分别为新型淋球菌(96％)＞T-M培养基(91％)＞国产淋球菌培养基(85％)。统计分析表明，淋球菌临床分离效果，新型淋球菌培养基同T-M培养基无显著差异，优于国产淋球菌培养基。

表2-6    新型淋球菌培养基临床菌株分离效果测试：

培养基	存活株	接种株	存活率	X<sup>2</sup>	P
						新型淋球菌培养基	96	100	96％
T-M培养基<sup>*</sup>	91	100	91％	2.06	＞0.05
						MTM选择培养基<sup>**</sup>	85	100	85％	7.04	＜0.01

注：经SAS8.01统计分析软件，采用X²统计分析方法

*临床菌株分离阳性率P＜0.01(同巧克力培养基比较)

**临床菌株分离阳性率P＞0.05(同T-M培养基比较)

稳定性实验：接种定量淋球菌悬液于不同保存期内新型淋球菌培养基，就培养菌落数和菌落大小分析其培养性能稳定性，单因素方差统计分析结果表明，在6个月内，其各个时间段内培养菌落数及菌落大小均无显著差异，培养性能稳定。

表2-7新型淋球菌培养基培养性能稳定性测试

注：经SAS8.01统计分析软件，采用单因素方差统计分析方法

*P＞0.05同保存4周的培养基相比较。

Claims (2)

1.一种淋球菌培养基，其特征在于，组分包括基础培养基、羊血、抑菌剂和添加剂：

①基础培养基：蛋白胨1.0～2.0份，玉米淀粉0.05～0.15份，K₂HPO₄0.2～0.8份，KH₂PO₄ 0.05～0.2份，NaCl 0.25～1.0份，琼脂1～3份；

②羊血3～10份；

③抑菌剂：万古霉素0.003～0.005份或者林可霉素0.003～0.01份、多粘菌素0.0075～0.015份、制霉菌素0.417～0.667份和三甲氧苄二氨嘧啶0.005～0.01份；

④添加剂：皂素2～8份、活性碳粉0.5～3份和胎牛血清3～8份；

制备方法包括以下步骤：

①按照上述重量比将蛋白胨，玉米淀粉，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钠，活性炭粉依次加入蒸馏水中，加热搅拌，使其充分溶解；

②再将称好的琼脂加入，继续加热至完全融化；

③用pH试纸测试步骤②所得溶液的pH值，调节pH值为7.2～7.4为止；

④在抽取的羊血中加入皂素，使红细胞充分溶解，待用；

⑤步骤③所得溶液高压灭菌15分钟后取出，待冷却到50～60℃，无菌操作加入羊血、胎牛血清及抑菌剂，充分混匀；

⑥缓缓倾注于容器中，待培养基凝固后，放置检查，如末长杂菌，既为成品。

2.根据权利要求1所述的淋球菌培养基的制备方法，其特征在于，在步骤③中，用10％HCl或10％NaOH进行所得溶液的pH值调节。