CN110205355A - 一种微生物高灵敏检测培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物检测的技术领域，尤其涉及一种微生物高灵敏检测培养基及其制备方法和应用。本发明提供了一种微生物高灵敏检测培养基，包括胰酪大豆胨液体培养基和胎牛血清。本申请的微生物高灵敏检测培养基的制备方法十分简单，还具有成本低廉的优点。本发明能快速、高灵敏检查细胞制品是否受到微生物污染，解决了现有技术仍缺少此类产品的技术缺陷。

Description

一种微生物高灵敏检测培养基及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物检测的技术领域，尤其涉及一种微生物高灵敏检测培养基及其制备方法和应用。

背景技术

细胞培养是一切生物实验的开始，也是生物技术的基础，因此，在进行生物实验时要保证培养的细胞是无菌的、清洁的。培养的细胞如果受到微生物的污染，会在污染的后期才能发现。如果是真菌感染，在感染后期，能在低倍镜下可以看到小黑点；细胞受到污染，其生长会发生异常，高倍镜下可以分辨，这时也是培养的后期了。如果细胞受到的污染，如枯草杆菌、大肠杆菌、假单孢菌、白色葡萄球菌的污染，在培养的后期，细胞液会变混浊，pH改变。

中国药典2015版无菌检查法中规定使用硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基(TSA)进行无菌检查，其中，硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需气菌培养；胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。然而无菌检查法主要指检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的其他品种是否无菌的一种方法，并非针对于细胞污染的检测方法。

然而，当前还没有一种针对干细胞的能快速、高灵敏检查细胞制品是否受到微生物污染的产品。

综上所述，研发一种能快速、高灵敏检查细胞培养过程是否受到污染的产品是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种微生物高灵敏检测培养基，能解决当前缺少一种快速、高灵敏检查细胞培养过程中，以及细胞制品是否受到微生物污染的产品的技术缺陷。

本发明提供了一种微生物高灵敏检测培养基，包括：胰酪大豆胨液体培养基和胎牛血清。

作为优选，所述胰酪大豆胨液体培养基和所述胎牛血清的质量比为(100-400):1。

作为优选，所述胰酪大豆胨液体培养基包括：胰酪胨、氯化钠、大豆木瓜蛋白酶消化物、葡萄糖、磷酸氢二钾和水。

作为优选，所述胰酪大豆胨液体培养基中各成分的用量为胰酪胨14-20g/L、氯化钠4.0-6.0g/L、大豆木瓜蛋白酶消化物2.4-3.6g/、葡萄糖2.0-3.0g/L、磷酸氢二钾2.0-3.0g/L和水。

作为优选，所述胰酪大豆胨液体培养基的水为余量。

作为优选，每一升所述胰酪大豆胨液体培养基，所述胎牛血清的添加量为2.5-10.0g。

进一步的，本发明公开的一种微生物高灵敏检测培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)将胰酪胨、氯化钠、大豆木瓜蛋白酶消化物、磷酸氢二钾和水混合后，得到混合物；

2)将葡萄糖和胎牛血清加入所述混合物中，制备得到微生物检测培养基。

作为优选，所述步骤1)还包括：将胰酪胨、氯化钠、大豆木瓜蛋白酶消化物、磷酸氢二钾和水混合后，得到混合物依次进行过滤、pH值调节和灭菌处理。

作为优选，所述步骤1)的pH值调节至7.0±0.2。

作为优选，所述步骤2)还包括：将葡萄糖加入混合物中进行pH值调节和灭菌处理，然后添加胎牛血清，制备得到微生物检测培养基。

作为优选，所述步骤2)的pH值调节至7.0±0.2。

进一步的，所述灭菌处理具体为：煮沸灭菌、过滤灭菌、微波灭菌、射线灭菌或高压灭菌。

更为优选，所述步骤1)中还包括琼脂粉，本发明还提供另一种微生物高灵敏检测培养基的制备方法，包括以下步骤：

一、将胰酪胨、氯化钠、大豆木瓜蛋白酶消化物、磷酸氢二钾和水混合后，得到混合物1；

二、将葡萄糖和琼脂粉加入所述混合物中，进行pH值调节和灭菌处理，得到混合物2，待所述混合物2的温度下降到40℃以下仍为液体状态，将无菌胎牛血清加入所述混合2中，制备得到微生物高灵敏检测培养基。

进一步的，本发明公开的所述的微生物高灵敏检测培养基在制备检测细胞制品的微生物的产品中的应用。

更为选的，本申请提供的微生物高灵敏检测培养基在制备检测腊叶芽枝菌的产品中的应用。

更为选的，本申请提供的微生物高灵敏检测培养基在制备检测霉菌的产品中的应用。

具体的，所述细胞制品是指应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。所述细胞优选为干细胞。

此外，本申请的用于检测细胞制品中微生物的培养基除了可以检测细胞或药品外，还可以检测细胞用培养基、细胞用冻存液、细胞用培养仪器和细胞用培养工具。细胞用培养仪器可以为二氧化碳培养箱等，细胞用培养工具可以为细胞用枪头，细胞用培养皿等。

本发明创造性的将胰酪大豆胨液体培养基和胎牛血清混合在一起，制备得到一种能快速，高灵敏的检测出细胞制品或培养细胞用物品是否受到微生物的污染的产品，细胞制品包括细胞和药品；培养细胞用物品包括细胞培养基、培养细胞的培养箱、培养细胞的工具等；其中的胎牛血清(fetalbovine semm，FBS)含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，尤其是丰富的生长因子和低分子营养物质能促进微生物的生长，此外，胎牛血清由胎牛血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，一般来说，胎牛血清由于其含有丰富的生长因子只会使用在细胞培养中，并不会使用到微生物的培养和检测中。本申请巧妙的利用胎牛血清中含有丰富的生长因子使用到细胞制品的微生物的检测中，利用胎牛血清含有多种生长因子能促进微生物的生长，从而大大提高细胞制品的微生物检测的灵敏度，提高无菌检测方法的准确性。

本申请尤其针对干细胞的细胞制品的微生物的检测，因此，在培养干细胞的同时可以检测干细胞的培养基或者干细胞培养用具的微生物，无需等到干细胞出现污染特征即能检测出干细胞是否发生微生物污染。

具体实施方式

本发明提供了一种微生物高灵敏检测培养基及其制备方法和应用，用于解决当前缺少一种快速、高灵敏检查细胞制品是否受到微生物污染的产品的技术缺陷。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

其中，本发明实施例的原料均为市售或自制，CFU为菌落形成单位。

实施例1

配置实施例1的微生物高灵敏检测培养基，具体操作步骤如下：

1、按照表1的成分配置微生物高灵敏检测培养基，其中先将胰酪胨、氯化钠、大豆木瓜蛋白酶消化物、磷酸氢二钾和水混合，过滤，调节pH值后高压灭菌，pH值在灭菌后在25℃的pH值为7.0±0.2。

2、将步骤1灭菌后的混合物加入葡萄糖混合后，分装和灭菌。

3、完成步骤2后添加无菌胎牛血清，制备得到微生物高灵敏检测培养基。

表1微生物高灵敏检测培养基组分表

名称	含量
		胰酪胨	17.0g
氯化钠	5.0g
		大豆木瓜蛋白酶消化物	3.0g
胎牛血清	5mL
		葡萄糖	2.5g
磷酸氢二钾	2.5g
		水	1000ml

实施例2

配置实施例2的微生物高灵敏检测琼脂培养基，具体操作步骤如下：

1、按照表2的成分配置微生物高灵敏检测琼脂培养基，其中先将胰酪胨、氯化钠、大豆木瓜蛋白酶消化物、磷酸氢二钾和水混合，过滤，调节pH值后高压灭菌，pH值在灭菌后在25℃的pH值为7.0±0.2。

2、将步骤1灭菌后的混合物加热融化后加入琼脂粉，然后加葡萄糖混合，分装，灭菌。

3、完成步骤2趁热添加无菌胎牛血清制备得到实施例2的微生物高灵敏检测琼脂培养基。

表2微生物高灵敏检测琼脂培养基组分表

名称	含量
		胰酪胨	17.0g
氯化钠	5.0g
		大豆木瓜蛋白酶消化物	3.0g
胎牛血清	5mL
		葡萄糖	2.5g
磷酸氢二钾	2.5g
		琼脂粉	1.75g
水	1000ml

实施例3

将实施例1的微生物高灵敏检测培养基与普通胰酪大豆胨液体培养基进行灵敏度验证和对比试验，具体操作步骤如下：

1、获得以下菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)((编号为CMCC(B)63501))、白色念珠菌(Candidaalbicans)((编号为CMCC(F)98001))、生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)((编号为CMCC(B)64941))、腊叶芽枝霉((编号为CMCC(F)7702))、藤黄微球菌((编号为CMCC(B)28001))、霉菌(从实验室环境中分离所得)。

2、将步骤1的菌种制备菌液，具体步骤如下：

2.1、将腊叶芽枝霉、藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌接种至胰酪大豆胨液体培养基中，置于35℃培养24小时，对培养液用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100CFU(菌落形成单位)的菌悬液。

2.2、将白色念珠菌和霉菌接种至沙氏葡萄糖液体培养基，置于35℃培养48小时，对培养液用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100CFU(菌落形成单位)的菌悬液。

2.3、将黑曲菌接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，置于25℃培养5天，加入4ml含0.05％(v/v)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％(v/v)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100CFU的孢子悬液。

3、将实施例1的微生物高灵敏检测培养基和普通胰酪大豆胨液体培养基接种步骤2中的菌液，具体步骤如下：

3.1、取每管装量为9ml的普通胰酪大豆胨液体培养基610支，以100支为一组，每组分别接种小于100CFU的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、生孢梭菌、腊叶芽枝霉、藤黄微球菌和霉菌，另10支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。

3.2、取每管装量为9ml的本实施例1的微生物高灵敏检测培养基610支，以100支为一组，每组分别接种小于100CFU的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、生孢梭菌、腊叶芽枝霉、藤黄微球菌和霉菌，另10支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。

3.3、结果判定：空白对照管无微生物生长，普通胰酪大豆胨液体培养基和本实施例1的微生物高灵敏检测培养基若加菌的培养基管均生长良好，判该灵敏度检查符合规定。实验结果如下：

根据上表中各菌种的生长百分比来判断实施例1的微生物高灵敏检测培养基和普通胰酪大豆胨液体培养基检测微生物的灵敏度。实施例1的微生物高灵敏检测培养基中微生物生长良好的百分比均在96％以上，均高于普通胰酪大豆胨液体培养基的百分比，特别是在检测腊叶芽枝菌和霉菌上。上表说明实施例1对于6种不同菌种的灵敏度均优于普通胰酪大豆胨液体培养基，本实施例说明，若细胞制品中含有以上菌种，以上菌种会在实施例1的微生物高灵敏检测培养基快速生长，导致实施例1的微生物高灵敏检测培养基变得浑浊，则可知该细胞制品被微生物污染。

实施例4

将实施例2的微生物高灵敏检测琼脂培养基与普通TSA培养基(胰酪胨大豆肉汤培养基)进行平皿计数法试验，按照《中国药典》(2010年版)微生物限度检查法中的平皿计数法定量考察枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、腊叶芽枝霉、藤黄微球菌和霉菌的菌种在本发明实施例2的微生物检测培养基及普通TSA琼脂培养基上的生长能力，具体操作步骤如下：

1、在普通TSA培养基和实施例2的微生物检测培养基处方中分别加入琼脂(14.0g)配制成相应的适合于菌数计数的普通TSA琼脂培养基和实施例2的微生物检测琼脂培养基。

2、按照实施例4的菌液制备的方法制备得到草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、腊叶芽枝霉、藤黄微球菌和霉菌的菌液。

3、接种培养，具体操作步骤为：将草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、腊叶芽枝霉、藤黄微球菌和霉菌的菌液分别接种于普通TSA琼脂培养基和实施例2的微生物检测琼脂培养基上，每种实验菌为平行4个平皿，倾注平皿，凝固后置于25℃培养箱中培养5d。每天观察菌落生长情况并记录菌落数。以菌落回收率比较普通TSA琼脂培养基和实施例2的微生物检测琼脂培养基的促菌生长能力，记录结果。其中，菌落回收率＝待测培养基平皿上的平均菌落数/对照培养基平板上的平均菌数。

结果如下表所示。

上表说明，实施例2的菌落回收率均高于100％以上，说明本申请配方对于各类菌种生长有促进作用，尤其是腊叶芽枝菌和藤黄微球菌，菌落回收率高达120.45％和128.73％，以普通TSA琼脂培养基作为标准，通过计算两种培养基上菌落生长的回收率，说明实施例的配方对各菌落有促进生长的作用。本实施例说明，若细胞制品中含有以上菌种，以上菌种会在实施例2的微生物高灵敏检测琼脂培养基快速生长，导致实施例2的微生物高灵敏检测琼脂培养基平板上长出菌落，则可知该细胞制品被微生物污染。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种微生物高灵敏检测培养基，其特征在于，包括胰酪大豆胨液体培养基和胎牛血清。

2.根据权利要求1所述的微生物高灵敏检测培养基，其特征在于，所述胰酪大豆胨液体培养基和所述胎牛血清的质量比为(100-400):1。

3.根据权利要求1所述的微生物高灵敏检测培养基，其特征在于，所述胰酪大豆胨液体培养基包括：胰酪胨、氯化钠、大豆木瓜蛋白酶消化物、葡萄糖、磷酸氢二钾和水。

4.根据权利要求1所述的微生物高灵敏检测培养基，其特征在于，所述胰酪大豆胨液体培养基中各成分的用量为胰酪胨14-20g/L、氯化钠4.0-6.0g/L、大豆木瓜蛋白酶消化物2.4-3.6g/、葡萄糖2.0-3.0g/L、磷酸氢二钾2.0-3.0g/L和水。

5.根据权利要求1至4任意一项所述的微生物高灵敏检测培养基，其特征在于，所述微生物检测培养基还包括琼脂粉；

所述琼脂粉的用量为1.5-2.0g/L。

6.一种微生物高灵敏检测培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将胰酪胨、氯化钠、大豆木瓜蛋白酶消化物、磷酸氢二钾和水混合后，得到混合物；

2)将葡萄糖和胎牛血清加入所述混合物中，制备得到微生物检测培养基。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)还包括：将胰酪胨、氯化钠、大豆木瓜蛋白酶消化物、磷酸氢二钾和水混合后，得到混合物依次进行过滤、pH值调节和灭菌处理。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)还包括：将葡萄糖加入混合物中进行pH值调节和灭菌处理，然后添加胎牛血清，制备得到微生物检测培养基。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述pH值为6.8-7.2。

10.权利要求1至4任意一项所述的微生物高灵敏检测培养基在制备检测细胞制品的微生物的产品中的应用。