CN101838626A - 巴尔通氏体固液双相斜面培养基及其制备及应用方法 - Google Patents
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Abstract
一种生物学技术领域的巴尔通氏体固液双相斜面培养基及其制备和应用方法，包括：由牛肉浸出液、淀粉、氯化钠、琼脂、脱纤维绵羊血和蒸馏水组成的斜面固体培养基以及酪蛋白胰酶水解物、大豆木瓜蛋白酶水解物、葡萄糖、氯化钠、磷酸二钾和蒸馏水组成的液体培养基。本发明制备得到的巴尔通氏体固液双相斜面培养基中达到107CFU/ml约需48小时，其生长数度提高2.5倍，成本节约500倍(血平板培养约需5天，达到107CFU需100个平皿)，弥补了目前巴尔通氏体体外培养方法细菌生长缓慢、费时费力、成本高等缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物学技术领域的培养基及制备方法，具体是一种巴尔通氏体固液双相斜面培养基及其制备及应用方法。
背景技术
巴尔通体(Bartonella)是一群革兰氏阴性、氧化酶阴性、营养条件要求苛刻兼性细胞内寄生的需氧杆菌，巴尔通体已包括19个种及亚种，其中已知7种可致人类疾病，分别是杆菌样、汉赛、五日热、伊丽莎白、格雷范姆、克氏及文氏巴尔通体伯格霍夫亚种巴尔通体。其中汉塞巴尔通体是致病谱最广的巴尔通体种，不仅可引起免疫缺陷病人的杆菌性血管瘤-杆菌性紫癜，还可致人类猫抓病、慢性淋巴结病、心内膜炎、视神经炎等疾病。
巴尔通氏体主要感染宿主红细胞及血管上皮细胞，目前该病原的分离培养方法主要为血平板培养方法，首次分离通常需3-5周时间方能在血平板表面长出肉眼可见的小菌落，次代培养生长周期可缩短为3-7天。但是血平板培养方法存在一下几点不足：
(1)生长周期较长；
(2)大规模培养需要大量平皿，耗费大量人力物力及时间；
(3)血平板培养只能收集菌落，而无法对细菌分泌蛋白进行研究。
经过对现有技术的检索发现，2005年Maggi等进行了巴尔通体液体培养基(BAPGM)研究(JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY，2005，2651-2655)，结果证实该液体培养基能支持7种不同巴尔通体生长，且细菌生长数度显著高于普通血平板培养基。但该液体培养基配方复杂，需要NAD、NADP、各种氨基酸盐等30余种物质，费用较高，对试剂配置实验人员要求也较严格。同时在培养基中加入了绵羊血，血细胞裂解释放的蛋白极大的提高了巴尔通体分泌蛋白分离工作的难度。因此开发一种操作简单、配方经济及方便后续研究工作开展的培养体系尤为重要。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种巴尔通氏体固液双相斜面培养基及其制备及应用方法，为动物感染模型构建提供充足病原，为其分泌蛋白鉴定等研究奠定重要基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种巴尔通氏体固液双相斜面培养基，包括斜面固体培养基及位于其上层的液体培养基，其中：斜面固体培养基与液体培养基的体积比为3∶5。
所述的斜面固体培养基是指血琼脂固体斜面培养基，其组分及含量为：牛肉浸出液23.0-30.0g/L、淀粉1.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂12.0g/L、占总体积5％的脱纤维绵羊血、余量为蒸馏水；
所述的液体培养基是指酪蛋白胰酶水解大豆液体培养基，其组分及含量为：酪蛋白胰酶水解物17.0-22.0g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3.0-5.0g/L、葡萄糖2.5g/L、氯化钠5g/L、磷酸二钾2.5g/L，余量为蒸馏水。
本发明涉及上述巴尔通氏体固液双相斜面培养基的制备方法，通过依次配置斜面固体培养基和液体培养基，并依次取3∶5的体积份混合后制备得到巴尔通氏体固液双相斜面培养基。
所述的配置斜面固体培养基是指：依次配取牛肉浸出液、淀粉、氯化钠和琼脂并加入蒸馏水后加热溶解，然后置于121℃环境下灭菌15min，待冷却至50℃后添加总量为5％的脱纤维绵羊血，最后倒入灭菌试管倾斜放置制成斜面固体培养基。
所述的牛肉浸出液通过以下方式制备得到：将切除脂肪、筋腱、肌膜的牛肉，用绞肉机绞碎或用刀剁碎，按1∶2比例加水放入适宜的玻璃容器内，搅拌均匀，置冰箱浸泡20-24h，取出逐渐加热煮沸lh，不断搅拌，纱布过滤后取滤液分装于瓶内，121℃高压蒸汽灭菌30min，待冷后，置冰箱保存备用。
所述的液体培养基通过以下方式制备得到：依次配取酪蛋白胰酶水解物、大豆木瓜蛋白酶水解物、葡萄糖、氯化钠和磷酸二钾并加入蒸馏水后加热溶解，然后置于121℃环境下灭菌15min，制成液体培养基。
所述的酪蛋白胰酶水解物为：经胰酶水解的全酪蛋白，主要产物为氨基酸及小分子量多肽，为培养基中的氮源。
所述的大豆木瓜蛋白酶水解物为：大豆经木瓜蛋白彻底水解，主要产物为细菌生长的必须氨基酸。
所述的依次取3∶5的体积份混合是指：向3体积份的斜面固体培养基的上表面加入5体积份的液体培养基，制成固液双相培养基。
本发明涉及上述巴尔通氏体固液双相斜面培养基的应用方法，通过挑取巴尔通氏体单菌落，无菌操作放入上述配置的固液双相斜面培养基中，盖上棉花塞，然后将试管放入二氧化碳浓度为5％，湿度为75％的培养箱中37℃培养。
与传统血琼脂固体平板培养方式作对比，本发明制备得到的巴尔通氏体固液双相斜面培养基中达到107CFU/ml约需48小时，其生长数度提高2.5倍，成本节约500倍(血平板培养约需5天，达到107CFU需100个平皿)。本发明弥补了目前巴尔通氏体体外培养方法细菌生长缓慢、费时费力、成本高等缺陷。本发明的意义在于可以为巴尔通氏体提供一种快速便捷的培养体系，为动物感染模型构建提供充足病原，为其分泌蛋白鉴定等研究奠定重要基础。
附图说明
图1为实施例固液双相斜面培养基示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明(选取营养条件需要不同的两种巴尔通氏体)，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1汉塞巴尔通氏体(Bartonella henselae)固液双相培养基配置及培养
(1)血琼脂固体斜面培养基及血琼脂平板培养基
牛肉浸出液23.0g，淀粉1.0g，氯化钠5.0g，琼脂12.0g，水1L，加热至50℃促其溶解。分装至合适的三角瓶内，121℃高压灭菌15min。
脱纤维绵羊血制备：采集100ml健康绵羊的静脉血，倒入无菌烧杯中，加入20颗灭菌玻璃珠，120rpm/min摇荡10min后，弃去玻璃珠，血液4℃保存待用。
待培养基冷却至50℃后添加总量为5％的脱纤维绵羊血，每管3ml倒入灭菌试管倾斜放置，制成血琼脂斜面培养基。
(2)酪蛋白胰酶水解大豆液体培养基
酪蛋白胰酶水解物17g，大豆木瓜蛋白酶水解物3g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g，磷酸二钾2.5g，加水至1L，45℃加热至完全溶解，121℃高压灭菌15min。
(3)在试管中已配置好的固体斜面培养基上层加入5ml酪蛋白胰酶水解大豆液体培养基固液双相斜面培养基，用棉花塞封口后待用。
(4)细菌培养
如图1所示，用接种环挑取单个汉塞巴尔通体菌落放入配置好的固液双相斜面培养基的上层液体培养基2中，棉花塞封口，放入二氧化碳浓度为5％，湿度为75％的培养箱中37℃培养。
(5)细菌浓度检测
每隔4小时进行一次细菌计数：吸管取出100μl双相斜面培养基中的上层液体培养基，l按照10-1倍比稀释，然后每个稀释度取100μl接种血液平板培养基中，待菌落形成后计数。结果显示培养48小时后菌液浓度为2.3×107CFU/ml，而血平板培养平均在98小时长出肉眼可见的菌落，每块平皿中含菌落大约为104CFU，因此固液双相培养基中汉塞巴尔通体生长速度提高了2.5倍，到达107CFU/ml浓度的菌液其成本只为普通血平板培养的1/100。
实施例2杆菌样巴尔通体(Bartonella bacilliformis)固液双相培养基配置及培养
(1)血琼脂固体斜面培养基及血琼脂平板培养基
牛肉浸出液30.0g，淀粉1.0g，氯化钠5.0g，琼脂12.0g，水1000ml加热促其溶解。分装至合适的三角瓶内，121℃高压灭菌15min。
脱纤维绵羊血制备：采集100ml健康绵羊的静脉血，倒入无菌烧杯中，加入20颗灭菌玻璃珠，120rpm/min摇荡10min后，弃去玻璃珠，血液4℃保存待用。
待培养基冷却至50℃后添加总量为8％的脱纤维绵羊血，每管3ml倒入灭菌试管倾斜放置，制成血琼脂斜面培养基。
(2)酪蛋白胰酶水解大豆液体培养基
酪蛋白胰酶水解物22g，大豆木瓜蛋白酶水解物3g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g，磷酸二钾2.5g，加水至1L，45℃加热至完全溶解，121℃高压灭菌15min。
(3)在试管中已配置好的固体斜面培养基上层加入5ml酪蛋白胰酶水解大豆液体培养基固液双相斜面培养基，用棉花塞封口后待用。
(4)细菌培养
如图1所示，用接种环挑取单个杆菌样巴尔通体菌落放入配置好的固液双相斜面培养基的上层液体培养基2中，棉花塞封口，放入二氧化碳浓度为5％，湿度为75％的培养箱中37℃培养。
(5)细菌浓度检测
每隔4小时进行一次细菌计数：吸管取出100μl双相斜面培养基中的上层液体培养基，l按照10-1倍比稀释，然后每个稀释度取100μl接种血液平板培养基中，待菌落形成后计数。结果显示培养48小时后菌液浓度为1.5×107CFU/ml，而血平板培养平均在138小时长出肉眼可见的菌落，每块平皿中含菌落大约为103CFU，因此固液双相培养基中杆菌样巴尔通氏体生长速度提高了3倍，到达107CFU/ml浓度的菌液其成本只为普通血平板培养的1/1000。
Claims (9)
1.一种巴尔通氏体固液双相斜面培养基，包括：斜面固体培养基及位于其上层的液体培养基，其特征在于：斜面固体培养基与液体培养基的体积比为3∶5；
所述的斜面固体培养基是指血琼脂固体斜面培养基，其组分及含量为：牛肉浸出液23.0-30.0g/L、淀粉1.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂12.0g/L、总体积5％的脱纤维绵羊血，余量为蒸馏水；
所述的液体培养基是指酪蛋白胰酶水解大豆液体培养基，其组分及含量为：酪蛋白胰酶水解物17.0-22.0g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3.0-5.0g/L、葡萄糖2.5g/L、氯化钠5g/L、磷酸二钾2.5g/L，余量为蒸馏水。
2.一种根据权利要求1所述的巴尔通氏体固液双相斜面培养基的制备方法，其特征在于，通过依次配置斜面固体培养基和液体培养基，并依次取3∶5的体积份混合后制备得到巴尔通氏体固液双相斜面培养基。
3.根据权利要求2所述的巴尔通氏体固液双相斜面培养基的制备方法，其特征是，所述的配置斜面固体培养基是指：依次配取牛肉浸出液、淀粉、氯化钠和琼脂并加入蒸馏水后加热溶解，然后置于121℃环境下灭菌15min，待冷却至50℃后添加总量为5％的脱纤维绵羊血，最后倒入灭菌试管倾斜放置制成斜面固体培养基。
4.根据权利要求3所述的巴尔通氏体固液双相斜面培养基的制备方法，其特征是，所述的牛肉浸出液通过以下方式制备得到：将切除脂肪、筋腱、肌膜的牛肉，用绞肉机绞碎或用刀剁碎，按1∶2比例加水放入适宜的玻璃容器内，搅拌均匀，置冰箱浸泡20-24h，取出逐渐加热煮沸1h，不断搅拌，纱布过滤后取滤液分装于瓶内，121℃高压蒸汽灭菌30min，待冷后，置冰箱保存备用。
5.根据权利要求2所述的巴尔通氏体固液双相斜面培养基的制备方法，其特征是，所述的液体培养基通过以下方式制备得到：依次配取酪蛋白胰酶水解物、大豆木瓜蛋白酶水解物、葡萄糖、氯化钠和磷酸二钾并加入蒸馏水后加热溶解，然后置于121℃环境下灭菌15min，制成液体培养基。
6.根据权利要求5所述的巴尔通氏体固液双相斜面培养基的制备方法，其特征是，所述的酪蛋白胰酶水解物为：经胰酶水解的全酪蛋白，主要产物为氨基酸及小分子量多肽，为培养基中的氮源。
7.根据权利要求5所述的巴尔通氏体固液双相斜面培养基的制备方法，其特征是，所述的大豆木瓜蛋白酶水解物为：大豆经木瓜蛋白彻底水解，主要产物为细菌生长的必须氨基酸。
8.根据权利要求5所述的巴尔通氏体固液双相斜面培养基的制备方法，其特征是，所述的依次取3∶5的体积份混合是指：向3体积份的斜面固体培养基的上表面加入5体积份的液体培养基，制成固液双相培养基。
9.一种根据权利要求5所述的巴尔通氏体固液双相斜面培养基的应用方法，其特征在于，将所述培养基至于二氧化碳浓度为5％、湿度为75％以及温度37℃的环境下进行细菌培养。
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