CN100392096C - 双相罗氏培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属医学检测技术领域，具体涉及一种能促进分枝杆菌快速生长的新型培养基及其制备方法。该培养基由固体和液体二部分组成。固体部分是在国内外通用的改良罗氏培养基，液体部分由基础培养基、促生长剂和抑菌剂组成。该培养基既能选择性地促进分枝杆菌的快速生长，又能抑制其它杂菌，生长的分枝杆菌可在培养基的固体斜面上形成紫红色菌落，有利于分枝杆菌的初步鉴定。该培养基能显著缩短培养所需时间，大幅度提高培养阳性率，非常适用于待检样品的分枝杆菌快速检测。该培养基可用于各级医院和卫生防病部门。

Description

双相罗氏培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种能促进分枝杆菌快速生长的新型培养基及其制备方法。

发明背景

分枝杆菌是一类广泛分布于自然界的细菌，其中某些分枝杆菌可使人和动物致病。近年来，国内外普遍报道由分支杆菌感染引起的疾病日益增多。特别是免疫功能低下患者的继发感染、以及医院内感染的暴发流行显著增加。对于分枝杆菌引起的感染性疾病的诊断，只要从待检样品中培养出分枝杆菌即可确诊。

目前，国内外普遍使用改良罗氏培养基分离培养分枝杆菌(见中华医学会编著临床技术操作规范-结核病分册，人民军医出版社2004年10月第1版30～33页)。这种培养基培养需时较久(通常需4-8周)，阳性率不高(通常为10％-30％)，远不能满足临床诊治和防病的需要。因此，迫切需要研制一种快速、灵敏的分枝杆菌培养基。

发明内容

本发明的目的在于提出一种能促进分枝杆菌快速生长的培养基及其制备方法。

本发明提出的分枝杆菌培养基，是以传统的改进罗氏培养基为基础，再加入液体培养基培养组成，该液体培养基包括基础培养基、促生长剂和抑菌剂三种成份，其组成配比如下：

基础培养基：硫酸铜0.001～0.002克、硫酸锌0.001～0.002克、氯化钙0.001～0.002克、硫酸镁0.01～0.02克、油酸0.01～0.02克、枸橼酸铁铵0.05～0.1克、枸橼酸钠0.1～0.2克、硫酸铵0.2～0.4克、丙酮酸钠0.5～1克、吐温-800.5～1克、天门冬素1～2克、磷酸二氢钾1～2克、磷酸二氢钠2～4克、中性甘油8～12毫升、蒸馏水1000毫升。

促生长剂：盐酸吡哆醇0.01克～0.02克、生物素0.01克～0.02克，辅酶A 0.1克～0.2克，三磷酸腺苷0.1克～0.2克，过氧化氢酶0.1克～0.2克，α-萘乙酸0.1克～0.2克，蛋白胨1克～2克，葡萄糖10克～20克，牛血清白蛋白V5因子100克～200克。

抑菌剂：由浓度分别为50μg～100μg/ml的氨苄青霉素、二性霉素B、多粘菌素B、奈啶酮酸和阿洛西林的蒸馏水溶液等量混合而成。

改良罗氏培养基和上述液体培养基、促生长剂、抑菌剂的组份比例为：

改良罗氏培养基    8ml

基础培养基    4-8ml

促生长剂      1-2ml

抑菌剂        0.1-0.2ml。

上述分枝杆菌培养基中还加入氧化还原指示剂(也称显色剂)，加入量为：对应于1000ml改良罗氏培养基，加入4-6ml浓度为0.1％的显色剂溶液。得到染色培养基，用于对培养菌落显色，便于生化鉴定和药敏试验。加入的显色剂可根据实际检测要求而变化。主要有红四氮唑(TCC)等。

本发明提出的分枝杆菌培养基的制备方法如下：

1、将基础培养基的各组份用蒸馏水溶解，在115-125℃高温下灭菌10-15分钟，冷却，置于4℃冰箱保存；

2、将促生长剂的各组份用蒸馏水溶解，然后灭菌过滤、分装，置于4℃冰箱保存；

3、将抑菌剂的各组份分别用蒸馏水配制成浓度为50-100μg/ml的溶液，然后等量混合；

4、最后将基础培养基、促生长剂、抑菌剂加入改良罗氏培养基，各组份的投料比例为：

改良罗氏培养基    8ml

基础培养基        4-8ml

促生长剂          1-2ml

抑菌剂            0.1-0.2ml。

此外，在上述混合培养基中再加入显色剂，混和均匀，即得染色培养基。显色剂为红四氮唑，加入量为：对应于1000ml改良罗氏培养基，加入4-6ml浓度为1％显色剂溶液。

本发明提供的双相罗氏培养基的使用方法如下：

a.待检标本经抗污处理后进行离心洗涤；

b.取沉淀0.1ml，滴种于双相罗氏培养基的液体中；

c.斜置培养基于35-37℃温箱孵育；

d.每天观察结果一次，见有细菌生长即为培养阳性；

e.培养至30天仍未见细菌生长为培养阴性；

f.培养阳性，可见液体培养基中含有细菌形成的颗粒状物资，固体培养基斜面上出现紫红色的菌落。

本发明提供的能促进分枝杆菌快速生长的培养基，以改良罗氏培养基为基础，加入分枝杆菌液培养基和显色剂，使之成为既含固体成分又含液体成分，故称其为双相罗氏培养基。由于该培养基同时含有双重培养基的营养成分，因此能促进分枝杆菌的快速生长，提高培养阳性率；同时又因为含有显色剂，可使分枝杆菌在罗氏培养基表面形成紫红色的菌落，极易观察。通过观察菌落特征，有利于分枝杆菌的快速初步鉴定。也可从罗氏培养基表面挑取菌落进行涂片染色、生化鉴定和药敏试验，这样可尽快对患者作针对性的抗菌治疗。

具体实施方式

实施例1：本发明中的罗氏培养基就是目前国内外通用的改良罗氏培养基，在1000ml改良罗氏培养基中加入(也可不加入)4-6ml 0.1％的显色剂TTC溶液；液体培养基由基础培养基、促生长剂和抑菌剂组成。

基础培养基组成成分如下：硫酸铜0.001克，硫酸锌0.001克，氯化钙0.001克，硫酸镁0.01克，油酸0.01克，枸橼酸铁铵0.05克，枸橼酸钠0.1克，硫酸铵0.2克，丙酮酸钠0.5克，吐温-80 0.5克，天门冬素1克，磷酸二氢钾1克，磷酸二氢钠2克，中性甘油8毫升，蒸馏水1000毫升。配制方法是先将上述各成分用双蒸水溶解，然后115℃～121℃高压灭菌10～15分钟，冷却，经无菌试验后置4℃冰箱保存备用。

促生长剂组成成分如下：盐酸吡哆醇0.01克，生物素0.01克，辅酶A 0.1克，三磷酸腺苷0.1克，过氧化氢酶0.1克，α-萘乙酸0.1克，蛋白胨1克，葡萄糖10克，牛血清白蛋白V5因子100克。配制方法是先用双蒸水将上述成分溶解，然后无菌过滤、分装，经无菌试验后置4℃冰箱保存。

抑菌剂配制：分别将氨苄青霉素、二性霉素B、多粘菌素B、奈啶酮酸和阿洛西林配制成50μg～100μg/ml浓度的蒸馏水溶液，取等量混合而成。

然后取加有显色剂TTC溶液的改良罗氏培养基8ml，取上述组配的液体培养基，其中基础培养4-8ml，促生长剂1-2ml，抑菌剂0.1-0.2ml，混合均匀，即得所需双相罗氏培养基。该培养基经过实验，有良好的效果。

实施例2：

基础培养基组成成分如下：硫酸铜0.0015克，硫酸锌0.0015克，氯化钙0.0016克，硫酸镁0.018克，油酸0.016克，枸橼酸铁铵0.07克，枸橼酸钠0.15克，硫酸铵0.3克，丙酮酸钠0.7克，吐温-80 0.7克，天门冬素1.3克，磷酸二氢钾1.5克，磷酸二氢钠3克，中性甘油10毫升，蒸馏水1000毫升。配制方法是先将上述各成分用双蒸水溶解，然后115℃～121℃高压灭菌10～15分钟，冷却，经无菌试验后置4℃冰箱保存备用。

促生长剂组成成分如下：盐酸吡哆醇0.015克，生物素0.015克，辅酶A 0.15克，三磷酸腺苷0.15克，过氧化氢酶0.15克，α-萘乙酸0.15克克，蛋白胨1.5克，葡萄糖、15克，牛血清白蛋白V5因子150克。配制方法是先用双蒸水将上述成分溶解，然后无菌过滤、分装，经无菌试验后置4℃冰箱保存。

其余条件同实施例1，实验表明，该培养基具有良好的效果。

实施例3：基础培养基组成成分如下：硫酸铜0.002克，硫酸锌0.003克，氯化钙0.002克，硫酸镁0.02克，油酸0.02克，枸橼酸铁铵0.1克，枸橼酸钠0.2克，硫酸铵0.4克，丙酮酸钠1克，吐温-80 1克，天门冬素2克，磷酸二氢钾2克，磷酸二氢钠4克，中性甘油12毫升，蒸馏水1000毫升。配制方法是先将上述各成分用双蒸水溶解，然后115℃～121℃高压灭菌10～15分钟，冷却，经无菌试验后置4℃冰箱保存备用。

促生长剂组成成分如下：盐酸吡哆醇0.02克，生物素0.02克，辅酶A 0.2克，三磷酸腺苷0.2克，过氧化氢酶0.2克，α-萘乙酸0.2克，蛋白胨2克，葡萄糖20克，牛血清白蛋白V5因子200克。配制方法是先用双蒸水将上述成分溶解，然后无菌过滤、分装，经无菌试验后置4℃冰箱保存。

其余条件同实施例1，实验表明，该培养基具有良好的效果。

Claims (5)

1.一种双相罗氏培养基，以传统的改进罗氏培养基为基础，加入液休培养基组成，该液体培养基包括基础培养基、促生长剂和抑菌剂，其组份配比如下：

基础培养基：硫酸铜0.001～0.002克、硫酸锌0.001～0.002克、氯化钙0.001～0.002克、硫酸镁0.01～0.02克、油酸0.01～0.02克、枸橼酸铁铵0.05～0.1克、枸橼酸钠0.1～0.2克、硫酸铵0.2～0.4克、丙酮酸钠0.5～1克、吐温-80 0.5～1克、天门冬素1～2克、磷酸二氢钾1～2克、磷酸二氢钠2～4克、中性甘油8～12毫升、蒸馏水1000毫升；

促生长剂：盐酸吡哆醇0.01克～0.02克、生物素0.01克～0.02克，辅酶A 0.1克～0.2克，三磷酸腺苷0.1克～0.2克，过氧化氢酶0.1克～0.2克，α-萘乙酸0.1克～0.2克，蛋白胨1克～2克，葡萄糖10克～20克，牛血清白蛋白V5因子100克～200克；

抑菌剂：由浓度分别为50μg～100μg/ml浓度的氨苄青霉素、二性霉素B、多粘菌素B、奈啶酮酸和阿洛西林的蒸馏水溶液等量混合而成；

改良罗氏培养基和上述液体培养基、促生长剂、抑菌剂的组份比例为：

改良罗氏培养基  8ml

液体培养基      4-8ml

促生长剂        1-2ml

抑菌剂          0.1-0.2ml。

2.根据权利要求1所述的双相罗氏培养基，其特征在于还加入有显色剂红四氮唑，其加入量为：对应于1000ml改良罗氏培养基，加入4-6ml浓度为0.1％的显色剂溶液。

3.一种如权利要求1所述双相罗氏培养基的制备方法如下：

(1)将基础培养基的各组份用蒸馏水溶解，在115-125℃高温下灭菌10-15分钟，冷却，置于4℃冰箱保存；

(2)将促生长剂的各组份用蒸馏水溶解，然后灭菌过滤、分装，置于4℃冰箱保存；

(3)将抑菌剂的各组份分别用蒸馏水配制成浓度为50-100μg/ml的溶液，然后等量混合；

(4)最后将基础培养基、促生长剂、抑菌剂加入改良罗氏培养基，各组份的投料比例为：

改良罗氏培养基  8ml

基础培养基      4-8ml

促生长剂        1-2ml

抑菌剂          0.1-0.2ml。

4.根据权利要求3所述的双相罗氏培养基的制备方法，其特征在于还加入显色剂红四氮唑，加入量为：对应于1000ml改良罗氏培养基，加入4-6ml浓度为0.1％的显色剂溶液。

5.一种如权利要求1所述的双相罗氏培养基的使用方法，其特征在于具体步骤如下：

a.待检标本经抗污处理后进行离心洗涤；

b.取沉淀0.1ml，滴种于双相罗氏培养基的液体中；

c.斜置培养基于35-37℃温箱孵育；

d.每天观察结果一次，见有细菌生长即为培养阳性；

e.培养至30天仍未见细菌生长为培养阴性；

f.培养阳性，可见液体培养基中含有细菌形成的颗粒状物资，固体培养基斜面上出现紫红色的菌落。