CN1038851C - 分枝杆菌干燥培养基及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明分枝杆菌干燥培养基，涉及微生物存在测定的选择性培养基，主要由磷酸盐，柠檬酸盐，氨基酸，葡萄糖酸盐，葡萄糖，镁盐，丙酮酸钠，嘧啶，锌盐，硒酸钠，泛酸钙，孔雀绿，DNA，琥珀酸钙，酵母粉，淀粉和琼脂，通过大规模干燥培养生技术，经脱水、吸附、干燥、球磨等工艺配制而成，具有操作简便、检测快速，阳性检出率高，价格低廉，易于标准化生产，便于运输和保藏的优越性。
Description
本发明分枝杆菌干燥培养基及其生产方法，涉及微生物存在测定的选择性培养基。
结核病是一种存在于世界范围发病率很高的传染性疾病之一，虽是一种病因明确，治有办法，防有措施的病种，但关键的问题仍是要早期发现，及时治疗，才能无虞。因此，尽早鉴别和诊断是控制该病的首要步骤，
在传统的X放射线放射诊断、OT试验和细菌培养三大诊断结核病技术中，尤以细菌培养发现结核菌生长最为直接。而细菌培养检测技术本身，需要解决的是优质，价廉的分枝杆菌生长培养基的供应问题。目前，已有的培养基多数由于“原料来源困难”、“难以获得纯菌液”、“操作繁琐”、“观察不便”、“检出阳性率低”等原因得不到推广。以罗氏鸡蛋基培养基和琼脂培养基为代表的固体培养基，虽是当前分枝杆菌分离培养和药敏检测最主要的手段，但均有局限性。罗氏培养基、改良罗氏培养基、酸罗氏培养基、丙酮酸钠培养基、小川氏培养基均为传统以鸡蛋为赋形剂和营养成分的培养基，配制过程繁琐，只能小量制备，质量差异大，易发生药物加热失效和蛋白质吸附消耗等缺陷，难以保证检测的准确性，且需用血清凝固器等，不利于基层及非专科医院推广应用；米氏培养基是以琼脂为赋形剂的培养基，由于需牛血清白蛋白第V部分(Fv)和过氧化物酶，价格昂贵，且需二氧化碳培养箱及特殊滤菌设备，仅能在发达国家使用，广大第三世界无法推广。近年来，由于吡嗪酰胺(PZA)在短程化疗中的重要作用已引起学者们的日益重视，鉴于上述传统培养基时PZA药敏试验存在困难，因此，寻找一种简便、可靠的方法来检测药敏已迫在眉睫，鉴于PZA最佳杀菌酸度要求在pH5.6，这一特性给研制一种菌株生长良好、结果准确的培养基增加了难度。
本发明的目的在于要提供一种具有操作简便，检测快速，阳性检出率高，价格低廉，便于运输和保藏的分枝杆菌干燥培养基。
本发明是这样实现的，培养基以琼脂和淀粉为赋形剂，加入分枝杆菌生长所需的碳源、氮源、磷酸盐、硫酸盐和以及微量刺激生长因子组合群及其他辅剂构成，其各主要组分的重量配比为∶磷酸二氢钾68-88、磷酸氢二钠10-15，柠檬酸三铵10.5-14，柠檬酸三钠9-11，柠檬酸铁铵0.5-1.1，L-谷氨酸或天门冬氨酸10.5-14.5，葡萄糖酸钠或葡萄糖酸钾10.5-14.5，葡萄糖45-48，硫酸镁或氯化镁1.2-2.5，丙酮酸钠10.5-14.5，尿嘧啶或/和胸腺嘧啶0.8-1.0，一磷酸腺苷(AMP)或鸟嘌呤核苷酸(GMP)0.4-0.6，硫酸锌或氯化锌0.2-0.68，偏重亚硫酸钠2-3，硒酸钠0.05-0.16，泛酸钙0.04-0.05，孔雀绿0.05-0.16，DNA0.10-0.50，琥珀酸钙3-4.5，酵母粉4.6-10.0，淀粉150-270，琼脂487-664。
其制备方法为：按上述重量比分别称取本发明各组分原料，以下列步骤配制培养基：
1，磷酸盐、硫酸盐等无机盐分别置烤箱内在100℃下烘烤，脱去结晶水；
2，将孔雀绿吸附于上述磷酸盐，研磨均匀，以10-50份淀粉收底；
3，将上述柠檬酸盐，L-谷氨酸，葡萄糖酸盐，葡萄糖，镁盐，丙酮酸钠，置粉碎器内磨匀，在烤箱内80-90℃烘1-2小时，加入淀粉10-50份混合；
4，DNA，用适量蒸镏水加热溶解，以适量琼脂吸附，置烤箱中80-90℃下烘24小时，加入与琼脂量相同的牛肉膏，蛋白胨以及酵母粉适量球磨，300转/分，混匀2小时；
5，将上述嘧啶，核苷酸，锌盐，偏重亚硫酸钠，硒酸钠，泛酸钙和琥珀酸钙研磨均匀，置37℃温箱过夜；
6，取上述处理后的各成分，补足琼脂和淀粉，酵母粉所需量后，置球磨机混匀，300转/分×1小时，仃半小时，再球磨，反复4次，取出置80℃烘箱烘1小时，即得淡黄色粉末状的本发明干燥培养基。产品用铝塑封口袋包装，暂不包装则置塑料瓶密封，放置避光干燥处保存。
使用本培养基时，只需加入适量的甘油和蒸镏水，混匀，在高温高压下灭菌15-20分钟，冷却后再加入小牛血清，不需用血清凝固器等专用设备，接着参照中国防痨协会细菌学标准操作规程，即可进行分枝杆菌的分离培养、鉴定的工作。由于使用了磷酸盐缓冲液，使培养基的pH稳定在5.6±0.10内，为PZA药敏检测提供了最佳酸度，且可以大规模生产，消除了质量差异，从而为检测结果的准确性提供了可靠的保证。经用于分枝杆菌的分离培养证明，菌株生长迅速，六周可出报告，用于PZA药敏试验，大多数菌株三周内即可报告，而用酸罗氏培养基则需10周，本发明还可反应菌株对药物的真实耐药性。故本发明培养基，及其生产方法，具有操作简便，检测快速，阳性检出率高，价格低廉，易于标准化生产，便于运输和保藏的优点，对于指导常规用药以及PZA临床用药具有重大意义。
以下实施例将对本发明的技术特征作进一步描述。
实施例1，将磷酸二氢钾68克，磷酸二氢钠10克于烤箱内100℃烘烤4小时，脱去结晶水；将孔雀绿0.05克吸附于上述磷酸盐，研磨均匀，以50克淀粉收底；称取柠檬酸三铵10.5克，柠檬酸三钠9克，柠檬酸铁铵0.5克，L-谷氨酸10.5克，葡萄糖酸钠10.5克，葡萄糖45克，硫酸镁1.2克，丙酮酸钠10.5克，置粉碎器内磨匀，烤箱内80-90℃烘1小时，加入淀粉50克混合；称取DNA0.10克，以适量蒸镏水加热溶解，吸附于适量琼脂，80-90℃烤箱烘24小时，加入与琼脂等量的牛肉膏，蛋白胨以及1-2克酵母粉，球磨，300转/分，混匀2小时：称取尿嘧啶0.8克，一磷酸腺苷0.4克，硫酸锌0.2克，偏重亚硫酸钠2克，硒酸钠0.05克，泛酸钙0.04克和琥珀酸钙3克研磨均匀，置37℃温箱过夜；取上述处理后的成分，补足一琼脂和淀粉所需量，置球磨机混匀，300转/分×1小时，隔半小时，反复4次，取出置80℃烘箱烘1小时，用铝塑封口袋包装，暂不包装则置500克塑料瓶密封，放置避光干燥处保存。
实施例2，将磷酸二氢钾68克，磷酸二氢钠10克于烤箱内100℃烘烤4小时，脱去结晶水；将孔雀绿0.05克吸附于上述磷酸盐，研磨均匀，以50克淀粉收底；称取柠檬酸三铵10.5克，柠檬酸三钠9克，柠檬酸铁铵0.5克，天门冬氨酸10.5克，葡萄糖酸钾10.5克，葡萄糖45克，氯化镁1.2克，丙酮酸钠10.5克，置粉碎器内磨匀，烤箱内80-90℃烘1小对，加入淀粉50克混合； 称取DNA0.10克，以适量蒸镏水加热溶解，吸附于适量琼脂，80-90℃烤箱烘24小时，加入与琼脂等量的牛肉膏，蛋白胨以及1-2克酵母粉，球磨，300转/分，混匀2小时；称取胸腺嘧啶0.8克，鸟嘌呤核苷酸0.4克，氯化锌0.2克，偏重亚硫酸钠2克，硒酸钠0.05克，泛酸钙0.04克和琥珀酸钙3克研磨均匀，置37℃温箱过夜；取上述处理后的成分，补足琼脂和淀粉至全量，置球磨机混匀，300转/分×1小时，隔半小时，反复4次，取出置80℃烘箱烘1小时，用铝塑封口袋包装，暂不包装则置500克塑料瓶密封，放置避光干燥处保存。实施例3-15，操作工艺同实施例1，培养基各组分的含量为：
| 组成成分 | 实 施 例 | ||||||
| 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
| 磷酸二氢钾磷酸氢二钠柠檬酸三铵柠檬酸三钠柠檬酸铁铵L-谷氨酸或天门冬氨酸葡萄糖酸钠或葡萄糖酸钾葡萄糖硫酸镁或氯化镁丙酮酸钠尿嘧啶或胸腺嘧啶一磷酸腺苷或鸟嘌呤核苷酸硫酸锌或氯化锌偏重亚硫酸钠硒酸钠泛酸钙孔雀绿DNA琥珀酸钙酵母粉淀粉琼脂 | 7210.1190.71111451.5110.80.420.252.10.060.050.100.153.14.6150655 | 75111190.81111451.5110.80.420.422.10.070.050.100.153.14.6180623 | 80121190.81111451.7110.80.420.422.10.080.050.100.203.24.6180616 | 82131190.91111452110.90.50.272.70.100.050.100.263.47240549 | 8313.713.7111.113.713.745213.70.90.550.272.70.110.050.050.273.47240534 | 841414111.11414452140.90.550.272.70.110.050.050.273.87240531 | 8514.514111.114.514.545214.51.00.60.283.00.160.050.100.274.07240528 |
| 组成成分 | 实 施 例 | |||||
| 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | |
| 磷酸二氢钾磷酸氢二钠柠檬酸三铵柠檬酸三钠柠檬酸铁铵L-谷氨酸或天门冬氨酸葡萄糖酸钠葡萄糖酸钾葡萄糖硫酸镁或氯化镁丙酮酸钠尿嘧啶或胸腺嘧啶一磷酸腺苷或鸟嘌呤核苷酸硫酸锌或氯化锌偏重亚硫酸钠硒酸钠泛酸钠孔雀绿DNA琥珀酸钙酵母粉淀粉琼脂 | 8714.514111.114.514.548214.51.00.60.283.00.160.050.100.274.07270493 | 8714.514111.114.514.5482.514.51.00.60.283.00.160.050.100.274.09270490 | 881514111.114.514.5482.514.51.00.60.283.00.180.050.100.274.29.5270488 | 881514111.114.514.5482.514.51.00.60.283.00.180.050.100.274.510.0270487 | 841014111.114.514.5482.514.51.00.60.283.00.180.050.100.274.210.0270536 | 8510.514111.114.514.5482.514.51.00.60.283.00.180.050.100.274.510.0270534 |
实施例13，本发明用于分枝杆菌分离培养，
一，菌株来源：牛型、鸟结核分枝杆菌标准菌株来源于美国。其余由日本清濑市结核病研究室提供。临床标本来源于上海市及全国各大医院收治患者。
二，培养基制备及使用
1，称取10克包装干燥培养基粉剂，加入甘油3～4毫升，蒸镏水250毫升，摇匀，115℃高压灭菌10分钟；
2，待冷却至60-65℃，加10毫升小牛血清，混匀无菌分装，放置斜面，凝固后37℃增菌过夜待用。室温或4℃箱保存，4周内用毕；
3，以2％NaOH处理标本，振荡消化痰液至透明或半透明，半小时内接种毕，每支0.1毫升37 ℃温箱培养，每周观察一次，第6周报告结果；
三，菌落形态
保持人形结核杆菌基本特征，与传统罗氏培养基比较菌落稍细小，湿润，光滑，呈表面生长。
四，结果
1，标准菌株在干燥培养基的生长试验
人型分枝杆菌(H37Rv)牛型菌株及9株非典型标准菌株在干燥培养基与罗氏培养基比较，无论大接种量(10-3mg/ml)和小接种量(10-5mg/ml)生长速度和最终菌量均无差异：
| 大接种量 | 小接种量 | |
| 初生长时间(天)最终菌量 | 初生长时间(天)最终菌量 | |
| 人型无毒株卡介苗堪萨斯分枝于菌鸟结核分枝杆菌瘰疠分枝杆菌胞内分枝杆菌无色分枝杆菌次要分枝杆菌偶发分枝杆菌人型分枝杆菌牛型分枝杆菌 | 干燥 罗氏 干燥 罗氏12 10 +++ +++12 12 +++ +++10 10 +++ +++10 10 ++++ ++++6 6 ++++ ++++6 6 ++++ ++++4 4 ++++ ++++8 8 +++ +++3 3 ++++ ++++10 10 ++++ ++++2 3 +++ +++ | 干燥 罗氏 干燥 罗氏14 12 ++ ++13 13 +++ +++13 12 ++ ++10 12 +++ +++7 7 +++ ++++7 7 ++++ ++++6 6 ++++ ++++9 9 +++ +++3 3 +++ +++14 14 +++ ++++3 4 +++ +++ |
2，临床标本分离培养试验
用2％NaOH前处理，与酸性罗氏对照，统计1133例临床标本，干燥培养基阳性为121例，酸罗氏为103例，统计学分析P＞0.05，无显著性差异：
(P＞0.05)
| 干燥培养基阳性 阴性 总计 | |
| 酸 阳性罗 阴性氏 总计 | 81 22 10340 990 1030121 1012 1133 |
干燥培养基，经6家医院共计2068例标本，比较5种培养基生长试验结果，证明其阳性率均高于罗氏及小川氏，仅略低于丙酮酸钠培养基：
| 标本数 | 阳性率(96％) | |
| 干 燥 酸罗氏 丙酮酸 小川氏 改罗氏 | ||
| 上海肺科二院上海肺科一院上海虹口区结防院上海县结防院北京309医院牡丹江市结防院合 计 | 1281 8.82 8.58 9.29 - -196 17.35 17.35 17.35 14.80 16.84200 13.00 8.50 - - -204 6.37 6.37 - - -38 36.84 34.2 - - -149 73.15 - - - 65.102068 15.33 13.40 | |
从上列三种培养基生长曲线比较图表明，干燥培养基的生长速度，快于鸡蛋基培养基，6周可出报告，3周生长达到高峰。而酸罗氏、丙酮酸钠培养基生长曲线相似，8周后仍有少量阳性，4周后才达到高峰。干燥培养基可提前二周出报告：
实施例14，本发明干燥培养基用于分枝杆菌吡嗪酰胺(PZA)药敏试验：
1，菌株来源：标准株中牛型、鸟结核分枝杆菌来源于美国。其余由日本清濑市结核病研究室提供。临床初、复治菌株来源于上海市各大医院。
2，培养基制备
基础液A：取10克包装干燥培养基粉剂，加入甘油3毫升，蒸镏水250毫升，加热溶解，10磅灭菌15分钟；基础液B：新鲜小牛衅血清10ml。
待A液冷却至50-65℃，将B液倒入混匀，分别加入PZA药粉，得最终浓度0，25，50，250μg/ml四组，趁热分装，放置斜面。凝固后置37℃温箱增菌过夜，室温保存，4周内用完。
3，操作方法
参照中国防痨协会细菌学标准操作规程，做分枝杆菌各群标准菌株生长试验和临床初复治菌间接药敏试验，药敏试验最终接种量为10-8mg/ml。
4，结果观察
于接种后2、3用各观察一次，第4周出报告。原则上以空白管生长至“+”以上，即可报告药敏结果。
按上述操作所得158株临床分离菌PZA药敏试验结果为：
| 初 治菌株数 | 已用PZA治疗复治菌株数 | |
| 用药史：＜3月 3-月 6月-1年 ＞1年 | ||
| 试验株数耐药株数耐药率(％) | 11864.2 | 23 5 2 1011 4 1 948 30 50 90 |
结果显示初治菌绝大多数敏感，复治菌株耐药产生快，三个月内即可达48％，用药1年者90％耐药。
118株初治菌各浓度管生长情况空白管 各浓度管生长例数(μg/ml)生长例数 25 50 250生长例数 118 34 4 1各占百分率(％) 100 28.8 3.4 0.8
Claims (2)
1，分枝杆菌干燥培养基，其特征在于，培养基包括：磷酸二氢钾68-88(重量份)，磷酸氢二钠10-15(重量份)，柠檬酸三铵10.5-14(重量份)，柠檬酸三钠9-11(重量份)，柠檬酸铁铵0.5-1.1(重量份)，L-谷氨酸10.5-14.5(重量份)，葡萄糖酸钠10.5-14.5(重量份)，葡萄糖45-48(重量份)，硫酸镁1.2-2.5(重量份)，丙酮酸钠10.5-14.5(重量份)，尿嘧啶0.8-1.0(重量份)，一磷酸腺苷0.4-0.6(重量份)，硫酸锌0.2-0.28(重量份)，偏重亚硫酸钠2-3(重量份)，硒酸钠0.05-0.16(重量份)，泛酸钙0.04-0.05(重量份)，孔雀绿0.05-0.16(重量份)，DNA 0.10-0.27(重量份)，琥珀酸钙3-4.5(重量份)，酵母粉4.6-10.0(重量份)，淀粉150-270(重量份)，琼脂487-664(重量份)，和适量牛肉膏，蛋白胨。
2，一种分枝杆菌干燥培养基的生产方法：其特征在于：按如权利要求1所述的分枝杆菌干燥培养基组分配比，分别称取原料，通过以下步骤配制培养基：
(1)，磷酸盐、硫酸盐等无机盐分别置烤箱内在100℃下烘烤，脱去结晶水和表面吸附水；
(2)，将孔雀绿吸附于上述磷酸盐，研磨均匀，以适量淀粉收底；
(3)，将柠檬酸盐，氨基酸，葡萄糖酸盐，葡萄糖，镁盐，丙酮酸钠，置粉碎器内磨匀，在烤箱内80-90℃烘1-2小时，加入适量淀粉混合；
(4)，DNA，以适量蒸镏水加热溶解，用适量琼脂吸附，置烤箱中80-90℃下烘24小时，加入与琼脂量相同的牛肉膏，蛋白胨以及酵母粉适量球磨，300转/分，混匀2小时；
(5)，将嘧啶，核苷酸，锌盐，偏重亚硫酸钠，硒酸钠，泛酸钙和琥珀酸钙研磨均匀，置37℃温箱过夜；
(6)，取上述处理后的各成分，补足琼脂、淀粉、酵母至全量后，混合置球磨机混匀，300转/分×1小时，仃半小时，再球磨，反复4次，取出置80℃烘箱烘1小时，即得培养基产品；
(7)将上述培养基产品密封置避光干燥处保存。
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