CN101574516A - 草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及预防草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮的疫苗及其制备方法。该疫苗包括柱状屈桡杆菌培养物、嗜水气单胞菌培养物、萤光极毛杆菌培养物，MONTANIDE ISA 763A VG和白油。一种草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗的制备方法，将柱状屈桡杆菌培养物，嗜水气单胞菌培养物、萤光极毛杆菌培养物按比例混合，加入生理盐水搅拌均匀后；加入MONTANIDE ISA 763A VG和白油，充分混匀后乳化成烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗。本发明的有益效果是，能批量提供安全、有效、质量可控的草鱼烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗；增强抗原所激发的抗体应答，促进免疫细胞的协同作用，从而增强草鱼对烂鳃病、败血病和赤皮病综合免疫功能，免疫草鱼后烂鳃、败血、赤皮的免疫保护率都达80％以上。

Description

草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物工程领域，涉及预防草鱼细菌性烂鳃病、败血病、赤皮病的疫苗，本发明还涉及该疫苗的制备方法。

背景技术

根据本项目委托广东省科技情报研究所查新检索国外文献、专利结果：未见有草鱼病疫苗或有关鱼虾烂鳃、败血、赤皮等病疫苗的研发应用报导。国内从70年代开始，珠江水产研究所首先利用病鱼肝、胰、肾等组织制备组织疫苗，免疫草鱼能有效预防草鱼出血、烂鳃、赤皮、肠炎等病发生，但是该法存在一定缺点：1、必须取材于发病鱼，原材料受限；2、质量不稳定。80年代后在全国范围开始草鱼出血病灭活疫苗、活疫苗研发，并获得成功。四川大学、广东省药物研究所与广东省水产养技术推广总站、武汉市水产科学研究所、湖南草鱼免疫技术协作组等单位研发过草鱼细菌性烂鳃病、赤皮病、肠炎病疫苗；并投入过中试，试用后养殖成活率提高至70％以上。但是，涉及本项：草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗的研究与应用未见报导。

发明内容

为了解决草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗纯正抗原培育，“三病”抗原及佐剂的合理配制；克服全菌灭活疫苗免疫力低的不足。本发明提供一种草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗，包括抗原和佐剂，其特征在于所述抗原为如下抗原组合物：柱状屈桡杆菌培养物、嗜水气单胞菌培养物、萤光极毛杆菌培养物，所述佐剂为MONTANIDE ISA 763AVG和白油，其中柱状屈桡杆菌培养物20～30亿CFU/ml，30～39％，嗜水气单胞菌培养物80亿CFU/ml，8％，萤光极毛杆菌培养物80亿CFU/ml，10％，佐剂MONTANIDE ISA 763AVG 14％和白油10％。

本发明还提供该种草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于该方法包括：

(1)柱状屈桡杆菌培养物的制备

a菌种复苏、复壮：将冻干菌种启封后，接入液体胰蛋白胨培养基培养；

b种子鉴定及扩大培养：取培养菌种，划线接种于胰蛋白胨琼脂平板若干个，28℃培养48h，挑取至少5个假树根状菌落，接种于胰蛋白胨液体培养基，置28℃扩大培养成菌种；

c制苗菌液培养：将检验合格的菌种按胰蛋白胨培养基量2％接种到培养罐，以恒温28℃、6M²/h的通气量培养20～24h收获20～30亿CFU/ml培养物；

d纯粹检验、活菌计数：在培养菌液中，取样，分别接种适宜生长培养基斜面和硫乙醇酸盐培养基小管各二支，每种培养基其中一支置37℃，另一支置25℃培养，观察3～5天，菌种生长应纯粹，采用10倍系列稀释，选择适宜稀释度接种适宜生长琼脂平板，每个稀释度接种3个，每个接种0.2ml，使菌液均匀分布，晾干后翻转平板，28℃培养48h；选择菌落在40～200个之间计数，然后将平板平均数乘以稀释倍数除以2，作为配苗参考；

e灭活：按细菌培养物体积比(V/V)加入终浓度为0.02％的硫柳汞溶液，30℃灭活2天。

f灭活检验：取经灭活的细菌培养物样品，每个样品1ml，接种于50ml胰蛋白胨培养基中，28℃，培养2天，再从培养物中取样，接种胰蛋白胨培养基琼脂斜面2支，每支接种0.2ml，28℃下培养3～5天，应无菌生长；

(2)嗜水气单胞菌培养物的制备

A菌种复苏、复壮：用少许蛋白胨培养基将冻干的嗜水气单胞菌稀释后，接种于蛋白胨培养基培养；

b种子鉴定及扩大培养：取复壮种子划线接种于蛋白胨琼脂平板若干个，置28℃培养48h，挑取单个形成圆整、隆起、平滑和透明的菌落，由灰白至淡黄色，并有特殊气味，不产色素的菌落至小5个，接种于蛋白胨培养基，28℃下扩大培养成菌种；

c制苗菌液培养：将检验合格的种子按培养基量2％接种量接种置种子罐，以恒温28℃、40L/min的通气量，搅拌培养20h，再接种置发酵罐，10M³/h通气量，搅拌培养20h，收获80亿CFU/ml以上培养物；

d纯粹检验、活菌计数：与“柱状屈桡杆菌培养物纯粹、活菌计数”方法相同；

e灭活：按嗜水气单胞菌菌液体积比(V/V)加入终浓度为0.2％的甲醛溶液，37℃灭活2天。

f灭活检验：取经灭活的嗜水气单胞菌菌液，每个样品1ml，接种于50ml蛋白胨培养基中，28℃下培养3天，再从蛋白胨培养物中取样，接种蛋白胨琼脂斜面2支，每支接种0.2ml在28℃下培养3～5天，应无菌生长。

(3)萤光极毛杆菌培养物的制备

A菌种复苏、复壮：用少许蛋白胨培养基将冻干萤光极毛杆菌种稀释后，接种于蛋白胨培养基培养；

b种子鉴定及扩大培养：取复壮的种子，划线接种于蛋白胨琼脂平板若干个培养，挑取置28℃培养48h，挑取单个圆形微凸，表面光滑，边缘整齐，灰白色或黄白色菌落至少5个，接种于蛋白胨液体培养基，28℃，扩大培养成菌种；

c制苗菌液培养：将检验合格的种子按蛋白胨培养基量2％接种量接种置种子罐，以恒温28℃、40L/min通气量，搅拌培养后20h，再接种置发酵罐，10M³/h通气量，拌搅培养20h收获80亿CFU/ml以上培养物；

d纯粹检验、活菌计数：与“柱状屈桡杆菌培养物纯粹、活菌计数”方法相同；

e灭活：按菌液体积比(V/V)加入甲醛溶液，使甲醛溶液最终浓度为0.24％，37℃，灭活3天；

f灭活检验：与“嗜水气单胞菌灭活检验”方法和结果相同；

(4)配苗、乳化：在水相罐中配备生理盐水28％～19％，加入检验合格的30～39％柱状屈桡杆菌培养物，8％嗜水气单胞菌培养物、10％萤光极毛杆菌培养物，搅拌均匀后；加入灭菌的14％MONTANIDE ISA 763A VG和10％白油混合佐剂，充分混匀后用管线式剪切机乳化成烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗。

本发明的有益效果是，能批量提供安全、有效、质量可控的草鱼烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗。该疫苗为白色油乳剂，注射免疫草鱼能延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和释放，增强抗原所激发的抗体应答；同时促进免疫细胞的协同作用，从而增强草鱼对烂鳃病、败血病和赤皮病综合免疫功能，免疫草鱼后烂鳃、败血、赤皮的免疫保护率都达80％以上。

具体实施方式

实施例1：

疫苗批号：2009001         产量：400L

1.制造疫苗的菌种

(1)柱状屈桡杆菌(Cytophaga Columnars)由珠江水产研究所鉴定、保存。1998重新鉴定检验，验证该菌种可作草鱼烂鳃病疫苗生产菌种。生产使用菌种代次为13代内。保存条件：冻干菌种在4℃保存期为8年。由珠江水产研究所鱼病中心保存，发放；

(2)嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)2002年珠江水产研究所从广东省增城市三，江镇患病草鱼中分离、鉴定、保存；生产用菌种代次为25代内。保存条件：冻干菌种在4℃环境中8年。由珠江水产研究所鱼病中心保存，发放；

(3)萤光极毛杆菌(Pseudomonas fluorecens)1998年从江西南昌县坝上分离到草鱼赤皮病病原菌：萤光极毛杆菌JP₈₀₂菌株，由珠江水产研究所鉴定和检验，菌种可作草鱼赤皮疫苗生产菌种；使用代次为引进后第25代内。保存条件：冻干菌种在4℃，保存期为8年。由珠江水产研究所鱼病中心保存，发放。

2.细菌培养基

(1)柱状屈桡杆菌培养基  按重量百分比计：胰蛋白胨0.5％，酵母粉0.05％，牛肉膏0.02％，乙酸钠0.02％，碳酸氢钠调节pH值至7.4。胰蛋白胨琼脂斜面培养基加入2％琼脂粉；

(2)嗜水气单胞菌培养基  按重量百分比计：蛋白胨1％、牛肉膏0.3％、氯化钠0.25％、酵母粉0.05％、葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾0.1％，pH7.4，蛋白胨琼脂斜面培养基加入2％琼脂粉；

(3)萤光极毛杆菌培养基  按重量百分比计：蛋白胨1％、牛肉膏0.4％、氯化钠0.3％、葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾0.1％，酵母粉0.05％、pH 7.5，蛋白胨琼脂斜面培养基加入2％琼脂粉。

3.疫苗制造及半成品检验

(1)柱状屈桡杆菌菌液制备

a菌种复苏、复壮：将冻干菌种启封后，接入液体胰蛋白胨培养基，28℃下培养24h，再置摇床振动培养24h；

b种子鉴定及扩大培养：取液状菌种，划线接种于胰蛋白胨琼脂平板若干个，置28℃培养48h，挑取至少5个单独，黄色、假树根状扩散型的菌落，接种于胰蛋白胨液体培养基，置28℃，扩大培养成3L种菌；

c菌种的纯粹检验：菌种取样后置4℃冰箱暂存，样品分别接种于胰胨培养基斜面，硫乙醇酸盐培养基(T.G)小管各二支，胰蛋白胨培养基斜面、乙醇酸盐培养基小管各一支置37℃；另一支置25℃，培养3～5天，观察生长纯粹；

d制苗菌液培养：配胰蛋白胨培养150L，加入0.1％植物油消泡剂。116℃下灭菌30min，待罐中培养基温度下降到29℃，接入3L菌种。然后输入过滤除菌空气，气量6M²/h，28±1℃，培养21h。收获柱状屈桡杆菌培养物；

e制苗菌液纯粹检验和活菌计数：将柱状屈桡杆菌培养物样品，接种于T.G小管、胰蛋白胨斜面各二支，每支0.2ml。T.G小管、胰蛋白胨斜面各一支置37℃，一支置25℃培养，另取样0.2ml接种酪胨琼脂培养基(G.P)置25℃，均培养观察3-5天，生长应纯粹。取柱状屈桡杆菌培养物1ml，用灭菌蒸馏水作10倍系列稀释，选择第6、第7管稀释管，各接胰胨琼脂平板3个，每个接种0.2ml，使菌液均匀分布，晾干后翻转平板，28℃培养48h。选择第7管，平均50个菌落，乘以稀释倍数除以2得25亿CFU/ml；

f柱状屈桡杆菌培养物灭活  按菌液体积比(V/V)加入硫柳汞钠溶液，使硫柳汞的最终浓度为0.02％，在30℃灭活2天。灭活期间灭活罐抖搅；

g柱状屈桡杆菌培养物灭活检验  抽取1ml灭活菌液，接种于50ml，0.5％胰蛋白胨培养基小瓶，置28℃下培养3天，然后从50ml小瓶取样移植接种胰胨培养基斜面二支，每支接种0.2ml，28℃下培养5天，观察无菌生长。

(2)嗜水气单胞菌菌液制备

a菌种复苏、复壮：用少许蛋白胨培养基将冻干的嗜水气单胞菌稀释后，接种于蛋白胨培养基的斜面若干支；28℃培养24h；

b种子鉴定及扩大培养：取斜面菌种，划线接种于蛋白胨琼脂平板若干个，置28℃培养24h，挑取至少5个单独，形成圆整、隆起、平滑和透明的菌落，由灰白至淡黄色，并有特殊气味，不产色素的菌落，接种于蛋白胨培养基，28℃下扩大培养成0.7L种子；

c菌种的纯粹检验：菌种取样后置4℃冰箱保存，样品接种蛋白胨琼脂斜面、接种硫乙酸盐培养基小管T.G小管各二支，蛋白胨培养基斜面、乙醇酸盐培养基小管各一支置37℃；另一支置25℃，培养3～5天，观察生长纯粹；

d制苗用菌液制备：配蛋白胨培养基35L，加入1％消泡剂，116℃下灭菌30min，待罐中培养基温度下降到29℃，接入0.7L菌种。然后输入过滤除菌空气，40L/min的通气量，搅拌培养，28±1℃，培养20h。收获嗜水气单胞菌培养物；

e纯粹检验及活菌计数：将嗜水气单胞菌培养物样品，接种于T.G小管、蛋白胨斜面各二支，每支0.2ml。T.G小管、蛋白胨斜面各一支置37℃，一支置25℃培养，另取样0.2ml接种G.P培养基置25℃，均培养观察3-5天，生长应纯粹。取嗜水气单胞菌培养物1ml，用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，选择第7管稀释管，接蛋白胨琼脂平板3个，每个接种0.2ml，使菌液均匀分布，晾干后翻转平板，28℃培养48h。选择第7管，平均186个菌落，乘以稀释倍数除以2得93亿CFU/ml；

f嗜水气单胞菌培养物灭活：接嗜水气单胞菌培养物体积比(V/V)加入甲醛溶液，使甲醛溶液最终浓度为0.2％，在37℃下灭活2天；

g嗜水气单胞菌培养物灭活检验：取灭活的嗜水气单胞菌培养物样品1ml，接种于50ml蛋白胨培养基中，28℃下培养3天，再从蛋白胨培养物中取样，接种蛋白胨琼脂斜面2支，每支接种0.2ml在28℃下培养3～5天，无菌生长。

(3)萤光极毛杆菌菌液制备

a菌种复苏、复壮：用少许蛋白胨培养基将冻干的萤光极毛杆菌稀释后，接种于蛋白胨培养基的斜面若干支；28℃培养24h；

b种子鉴定及扩大培养：取斜面菌种，划线接种于蛋白胨琼脂平板若干个，置28℃培养24h，挑取至少5个单独，圆形微凸，表面光滑，边沿整齐灰白色或黄白色菌落，接种于蛋白胨培养基，28℃下扩大培养成0.8L种子；

c菌种的纯粹检验：菌种取样后置4℃冰箱保存，样品接种蛋白胨琼脂斜面、接种硫乙酸盐培养基小管(T.G)小管各二支，蛋白胨培养基斜面、乙醇酸盐培养基小管各一支置37℃；另一支置25℃，培养3～5天，观察生长纯粹；

d制苗用菌液制备：配蛋白胨培养基40L，加入1％消泡剂，116℃下灭菌30min，待罐中培养基温度下降到29℃，接入0.8L菌种。然后输入过滤除菌空气，40L/min的通气量，搅拌培养，28±1℃，培养20h。收获嗜水气单胞菌培养物；

e纯粹检验及活菌计数：将萤光极毛杆菌培养物样品，接种于T.G小管、蛋白胨斜面各二支，每支0.2ml。T.G小管、蛋白胨斜面各一支置37℃，一支置25℃培养，另取样0.2ml接种(G.P)置25℃，均培养观察3-5天，生长应纯粹。取萤光极毛杆菌培养物1ml，用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，选择第7管稀释管，接蛋白胨琼脂平板3个，每个接种0.2ml，使菌液均匀分布，晾干后翻转平板，28℃培养48h。选择第7管，平均178个菌落，乘以稀释倍数除以2得89亿CFU/ml；

f萤光极毛杆菌培养物灭活：接萤光极毛杆菌培养物体积比(V/V)加入甲醛溶液，使甲醛溶液最终浓度为0.24％，37℃灭活3天；

g萤光极毛杆菌培养物灭活检验：取灭活的萤光极毛杆菌养物样品1ml，接种于50ml蛋白胨培养基中，28℃下培养3天，再从蛋白胨培养物中取样，接种蛋白胨琼脂斜面2支，每支接种0.2ml在28℃下培养3～5天，无菌生长。

(4)配苗、乳化

a油相罐灭菌：将56L MONTANIDE ISA 763A VG，40L白油，司本1L灌入油相罐中拌匀后121℃灭菌30min，冷却至15℃；

b水相罐灭菌：配生理盐水86L，加入吐温1L拌匀后121℃灭菌30min，冷却至15℃；

c配苗：将144L柱状屈桡杆菌培养物、32L嗜水气单胞菌培养物、40L萤光极毛杆菌培养物加入置水相罐中与生理盐水充分混匀后，加入至乳化罐中与MONTANIDE ISA 763A VG和白油混合佐剂混合；

d乳化分装：开动管线式剪切机乳化60min后，定量分装置疫苗，加盖密封，4℃保存。

4.疫苗成品检验：

物理性状：白色均匀乳剂，静置一段时间后，上层白色乳剂、底部为水沁出层。振摇后呈均匀乳状液。

无菌检验按《中华人民共和国兽药典》2005年版、第三部附录15页进行，检验结果无菌生长。

汞类残留量测定按《中华人民共和国兽药典》2005年版、第三部附录24页进行，检验结果：汞类残留量0.0074％。

甲醛含量测定按《中华人民共和国兽药典》2005年版、第三部附录25页进行，检验结果：甲醛残留量0.011％。

安全检验：每批疫苗随机抽样3瓶，混合均匀后，以0.2ml/尾，腹腔注射体重13g/尾草鱼20尾，放水簇箱饲养观察15天，免疫鱼应全部存活，没有不良反应。

效力检验：用13g左右的健康草鱼60尾，各肌肉或腹腔注射草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗0.2ml，在28℃的水体中饲养9天后，连同条件相同的对照草鱼60尾，各随机分成三个攻毒试验组；每个攻毒试验组，免疫鱼20尾、对照鱼20尾。

草鱼烂鳃病效力检验：免疫9天后用柱状屈桡杆菌强毒株腹腔注射攻毒，每尾注射0.88亿个菌，对照鱼组草鱼死亡18尾，死亡率90％；免疫鱼组死亡2尾，死亡率10％；用以下公式计算免疫鱼组免疫保护率为88.8％。

草鱼败血病效力检验：免疫12天后用嗜水气单胞菌强毒株腹腔注射攻毒，每尾注射0.14亿个活菌，对照组草鱼死亡15尾，死亡率75％；免疫鱼组死亡1尾，死亡率5％；用以上公式计算免疫鱼组免疫保护率为93.3％。

草鱼赤皮病效力检验：免疫12天后用萤光极毛杆菌强毒株腹腔注射攻毒，每尾注射1亿个活菌对照组草鱼死亡13尾，死亡率65％；免疫鱼组死亡1尾，死亡率5％；用以上公式计算免疫鱼组免疫保护率为92.3％。

Claims (7)

1.一种草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗，包括抗原和佐剂，其特征在于所述抗原为如下抗原组合物：柱状屈桡杆菌培养物、嗜水气单胞菌培养物、萤光极毛杆菌培养物。

2.权利要求1所述一种草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗，其特征在于所述佐剂为MONTANIDE ISA 763AVG和白油。

3.权利要求2所述一种草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗，其特征在于所述组分按体积百分比计如下：

柱状屈桡杆菌培养物20～30亿CFU/ml，30～39％，

嗜水气单胞菌培养物80亿CFU/ml，8％，

萤光极毛杆菌培养物80亿CFU/ml，10％，

MONTANIDE ISA 763A VG 14％，

白油10％。

4.一种草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：将柱状屈桡杆菌培养物，嗜水气单胞菌培养物、萤光极毛杆菌培养物按比例混合，加入生理盐水搅拌均匀后，加入MONTANIDE ISA 763AVG和白油混合佐剂，充分混匀后乳化成烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗。

5.权利要求4所述一种草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述柱状屈桡杆菌培养物的制备包括以下步骤：

a菌种复苏、复壮：将冻干菌种启封后，接入液体胰蛋白胨培养基培养；

b种子鉴定及扩大培养：取培养菌种，划线接种于胰蛋白胨琼脂平板，28℃培养48h，挑取至少5个假树根状菌落，接种于胰蛋白胨液体培养基，置28℃扩大培养成菌种；

c制苗菌液培养：将检验合格的菌种按胰蛋白胨培养基量2％接种到培养罐，以恒温28℃、6M²/h的通气量培养20～24h收获20～30亿CFU/ml培养物；

d灭活：按细菌培养物体积比(V/V)加入终浓度为0.02％的硫柳汞溶液，30℃灭活2天。

6.权利要求4所述一种草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述嗜水气单胞菌培养物的制备包括以下步骤：

a菌种复苏、复壮：用少许蛋白胨培养基将冻干的嗜水气单胞菌稀释后，接种于蛋白胨培养基培养；

b种子鉴定及扩大培养：取复壮种子划线接种于蛋白胨琼脂平板若干个，置28℃培养48h，挑取单个形成圆整、隆起、平滑和透明的菌落，由灰白至淡黄色，并有特殊气味，不产色素的菌落至小5个，接种于蛋白胨培养基，28℃下扩大培养成菌种；

c制苗菌液培养：将检验合格的种子按培养基量2％接种量接种置种子罐，以恒温28℃、40L/min的通气量，搅拌培养20h，再接种置发酵罐，10M³/h通气量，搅拌培养20h，收获80亿CFU/ml以上培养物；

d灭活：加入甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，37℃灭活2天。

7.权利要求4所述一种草鱼细菌性烂鳃、败血、赤皮三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述萤光极毛杆菌培养物的制备包括以下步骤：

a菌种复苏、复壮：用少许蛋白胨培养基将冻干萤光极毛杆菌种稀释后，接种于蛋白胨培养基培养；

b种子鉴定及扩大培养：取复壮的种子，划线接种于蛋白胨琼脂平板若干个培养，挑取置28℃培养48h，挑取单个圆形微凸，表面光滑，边缘整齐，灰白色或黄白色菌落至少5个，接种于蛋白胨液体培养基，28℃，扩大培养成菌种；

c制苗菌液培养：将检验合格的种子按蛋白胨培养基量2％接种量接种置种子罐，以恒温28℃、40L/min通气量，搅拌培养后20h，再接种置发酵罐，10M³/h通气量，拌搅培养20h收获80亿CFU/ml以上培养物；

d灭活：加入甲醛溶液，甲醛溶液最终浓度为0.24％，37℃，灭活3天。