CN108865931A - 一株芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株芽孢杆菌，该菌株的分类命名为地衣芽孢杆菌，编号为BLCC1‑0441，已于2018年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2018253。该芽孢杆菌既能高产碱性磷酸酶，又能高效发酵，而且具有良好肠道定植性能以及在肉鸡饲养具有良好的应用。

Description

一株芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株芽孢杆菌及其应用。
背景技术
目前已经阐明有害菌是通过它们所释放的内毒素脂多糖，与宿主动物肠道上皮细胞膜的Toll样受体互作，来诱导产生不良的免疫反应并导致感染性疾病。内毒素(LPS)是革兰氏阴性细菌生长时释放或死亡时裂解出来的细胞壁脂多糖成分。LPS基本结构由3部分共价键连接而成，即O-特异性抗原多糖、核心多糖和类脂A。类脂A已被证实为内毒素的活性分子，可介导几乎所有的内毒素生物学特性，而类脂A的双磷键又是其生物学活性的主要基团。碱性磷酸酶(ALP)是一种广泛分布的单脂磷酸水解酶，几乎能催化所有的磷酸单酯的水解反应，它可以水解类脂A功能基团的双磷键，而酶水解脱磷产生的单磷类脂A基团会使得内毒素脂多糖LPS的毒性大减。
碱性磷酸酶ALP广泛存在于细菌、真菌、高等动物中，国外从20世纪50年代开始就对产ALP的微生物展开了研究，已报道的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、霍乱弧菌、索多恩微球菌、喜寒节杆菌、产酶溶杆菌、粗糙脉孢菌和嗜热细菌等，大肠杆菌ALP已能工业化生产。而我国在这方面一直较为滞后，动物源ALP研究方面的报道不少，而从微生物中分离筛选产酶菌株却少有报道。目前，国内已报道的地衣芽孢杆菌HB1产碱性磷酸酶活力最高，优化发酵后HB1菌株细胞内外酶活分别达到5.3U/mL和5.9U/mL(庄百川等，2009)。
芽孢杆菌是一种新型的饲料添加剂，研究表明，它可以平衡动物的肠道菌群，提高机体免疫力，提高动物的生产性能等，被开发作为动物饲料微生态制剂。但是具有这些作用的前提是该菌种能够良好的定植在动物肠道内。不同菌株由于其自身性能和筛选条件等的不同，其应用也会相应不同。经发明人研究，目前国外研发的一株Bacillus licheniformisMTCC 1483虽然有较高的产ALP能力，但是其肠道定植性能比较欠缺，因此无法应用在肉鸡等动物的饲养应用上。由此可见，开发更高的定植性能的菌种在肉鸡等动物的饲养上具有重要意义。
工业化生产动物饲料微生态制剂常采用发酵菌液热处理制粒的方法，然而目前的芽孢杆菌的耐热性较差，热处理过程中会降低活菌数量以及分泌的碱性磷酸酶的酶活，从而无法保证微生态制剂产品的有效活菌数量和酶活力，从而降低了其在动物饲料上的应用水平。
另外，目前现有的芽孢杆菌的发酵周期比较长，前期的菌种生长、繁殖占用了一部分的发酵周期，而且产碱性磷酸酶较低。
综上可见，目前的芽孢杆菌的产碱性磷酸酶、定植性能、高效发酵的生产技术等问题都有待于研究解决。
因此，目前有必要开发一种综合性能较好的芽孢杆菌，以期在肉鸡饲养上获得较高的应用水平。
发明内容
针对上述现有技术，本发明经过筛选获得一株芽孢杆菌BLCC1-0441，该芽孢杆菌既能高产碱性磷酸酶，又能高效发酵，而且具有良好肠道定植性能以及在肉鸡饲养具有良好的应用。
本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一个方面，提供了一株地衣芽孢杆菌，该菌株的分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，编号为BLCC1-0441，已于2018年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M2018253。
本发明的地衣芽孢杆菌的菌体形态及生理生化特征为：LB培养基37℃培养24h，形成杏仁白色菌落，湿润，边缘有羽毛状分裂；显微镜下观察菌体呈杆状，两端钝圆。有芽孢，芽孢近椭圆形，革兰氏染色阳性。将生理生化鉴定结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》上关于芽孢杆菌属的描述相对照，BLCC1-0441属于芽孢杆菌(Bacillus sp.)。
在本发明的第二个方面，提供了一种微生物混合物，其特点是至少包含本发明的菌株；所述微生物混合物还包含其他具有高产碱性磷酸酶的特性或具有良好定植性能并与本发明菌株共生的微生物。
在本发明的第三个方面，提供了一种包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品，该产品可以是菌剂的形式，所述菌剂的活性成分为本发明菌株，该活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。
在本发明的第四个方面，提供了一种本发明的菌株、本发明的微生物混合物或者本发明的包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品在制备具有高产碱性磷酸酶和具有良好定植性能的微生态制剂中的应用。
在本发明的第五个方面，提供了一种具有高产碱性磷酸酶和具有良好定植性能的微生态制剂，其特点是：该微生态制剂包括所述的地衣芽孢杆菌或所述的微生物混合物或所述的产品。
在本发明的第六个方面，提供了一种具有高产碱性磷酸酶和具有良好定植性能的微生态制剂的制备方法，包括：
(1)菌种的发酵：
发酵培养基配方为，以质量百分比计：葡萄糖0.6％、酵母膏0.5％、L-谷氨酸钠0.8％、MnSO4·H2O 0.05％、NaCl 0.5％，35～40℃通气发酵培养14～18h；
(2)将步骤(1)中得到的发酵液处理得到微生态制剂。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
本发明筛选获得的地衣芽孢杆菌BLCC1-0441具有高产碱性磷酸酶的特性，胞外碱性磷酸酶活力高达40U/mL；且得到的碱性磷酸酶具有较高的热稳定性，这一热稳定性在应用上具有较大的价值。
同时，本发明筛选获得的地衣芽孢杆菌BLCC1-0441具有较强的耐热性，在工业化生产微生态制剂方面具有广阔的应用前景，能够保证微生态制剂产品的有效活菌数量。
还有，本发明筛选获得的地衣芽孢杆菌BLCC1-0441在动物肠道内的定植性能较好，将其应用于肉鸡饲养，用来有效替代饲料抗生素，达到改善动物肠道健康、提高其生产性能的目的。
另外，本发明筛选获得的地衣芽孢杆菌BLCC1-0441的发酵周期短，具有较高的发酵性能，更有利于工业化推广使用。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：菌株BLCC1-0441的菌落形态。
图2：菌株BLCC1-0441的菌体形态(1000×)。
图3：菌株BLCC1-0441PCR扩增产物琼脂凝胶电泳结果。M:Marker DL2000；CK：空白对照；1、2:菌株BLCC1-0441PCR产物。
图4：菌株BLCC1-0441的系统发育进化分析。
图5：不同pH缓冲液对菌株BLCC1-0441碱性磷酸酶活力影响。
图6：菌株BLCC1-0441碱性磷酸酶耐热性能测定。
图7：菌株BLCC1-0441碱性磷酸酶最适作用温度测定。
图8：菌株BLCC1-0441发酵产酶曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中的芽孢杆菌的产碱性磷酸酶、定植性能、发酵的生产技术等存在一定的不足，为了解决如上的技术问题，本发明筛选得到一株地衣芽孢杆菌，该菌株的分类命名为地衣芽孢杆菌，编号为BLCC1-0441，已于2018年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCCNO：M 2018253。
在本发明的一个典型的实施方式中，提供了一种微生物混合物，其特点是至少包含本发明的菌株；所述微生物混合物还包含其他具有高产碱性磷酸酶的特性或具有良好定植性能并与本发明菌株共生的微生物。
在本发明一个典型的实施方式中，提供了一种包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品，该产品可以是菌剂的形式，该菌剂包括活性成分和载体，该菌剂的活性成分为本发明菌株，该活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。
优选的，所述产品为粉末形式、溶液形式、悬浮剂形式、片剂形式或颗粒形式。
优选的，所述载体可以为固体载体或液体载体。所述固体载体或液体载体均为常规的载体材料，其中，固体载体可以选自粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳的一种或多种；液体载体可以为植物油、矿物油或水。
在本发明的一个典型的实施方式中，提供了一种本发明的菌株、本发明的微生物混合物或者本发明的包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品在制备具有高产碱性磷酸酶和具有良好定植性能的微生态制剂中的应用。
在本发明的一个典型的实施方式中，提供了一种具有高产碱性磷酸酶和具有良好定植性能的微生态制剂，其特点是：该微生态制剂包括所述的地衣芽孢杆菌或所述的微生物混合物或所述的产品。
优选的，在该微生态制剂中所述地衣芽孢杆菌的活菌数为9.0～10.0×1010cfu/g。进一步优选的，所述活菌数为9.60×1010cfu/g。
优选的，所述微生态制剂为颗粒形式、粉末形式、溶液形式、悬浮剂形式或片剂形式。
在本发明的一个典型的实施方式中，提供了一种具有高产碱性磷酸酶和具有良好定植性能的微生态制剂的制备方法，包括：
一种具有高产碱性磷酸酶和具有良好定植性能的微生态制剂的制备方法，包括：
(1)菌种的发酵：
菌株活化：以新鲜LB斜面接种菌株BLCC1-0441，35～40℃培养18～30h，镜检芽孢率在90％以上后斜面保存备用。
种子液的制备：以LB液体培养基制备种子液，装液量为18～22(v/v)％；从斜面接种两环至新鲜培养基中，35～40℃、150～200r/min培养，至镜检芽孢率90％以上时进行发酵罐接种。
发酵培养：发酵培养基配方为，以质量百分比计：葡萄糖0.6％、酵母膏0.5％、L-谷氨酸钠0.8％、MnSO4·H2O 0.05％、NaCl 0.5％，pH 7.0，灭菌；接种量为10～14(v/v)％，通气量为1：0.4～0.8(V/V·min)，35～40℃发酵培养14～18h。
(2)将步骤(1)中得到的发酵液进一步处理得到微生态制剂。
优选的，步骤(1)中，菌株活化：37℃培养24h；
种子液的制备：装液量为20(v/v)％；37℃、180r/min培养；
发酵培养：121℃灭菌30min，接种量为10(v/v)％，通气量为1：0.6(V/V·min)，37℃发酵培养16h。
步骤(2)中的处理包括，采用常规技术手段将微生态制剂制备成颗粒形式、粉末形式、溶液形式、悬浮剂形式或片剂形式。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
本项目采用微孔板以磷酸苯二钠法筛选到产碱性磷酸酶较强的芽孢菌株，对菌株碱性磷酸酶性质进行研究，并对其发酵条件进行优化，提高菌株产酶活力。
1菌种筛选
1.1待筛选菌株
待筛选菌株均来自山东宝来利来生物工程股份有限公司生物工程研究院菌种保藏中心，自泰安市泰山区畜禽养殖粪便分离筛选而得。
1.2试剂
(1)0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0)：称取无水碳酸钠0.64g、碳酸氢钠0.34g、4-氨基安替比林0.15g，定溶于100mL蒸馏水中。
(2)0.02mol/L磷酸苯二钠溶液：称取二水磷酸苯二纳0.51g，使其定容于100mL沸水中，冷却后加入0.5mL的氯仿，置冰箱保存。
(3)铁氰化钾溶液：称取铁氰化钾0.25g、硼酸1.7g，各溶于40mL水中，二液体混合后定容至100mL，置冰箱保存。
以上试剂置冰箱保存一般不超过一周，每次都尽量现配现用。
1.3培养基配方
芽孢培养基LB：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 5g/L、葡萄糖2g/L，pH 7.0，121℃灭菌30min。
1.4试验方法
1.4.1产碱性磷酸酶菌株的筛选
以微孔板法初筛产碱性磷酸酶的菌株。具体方法为：将0.1mol/L碳酸盐缓冲液(含4-氨基安替比林，pH 10.0)50μL，点样于96孔微孔板中(对照孔加量为55μL)，用灭菌牙签取各菌种等量菌苔与缓冲液充分混匀，于37℃温预5min，再加入已预热的磷酸苯二钠溶液(0.02mol/L)50μL，37℃反应15min，加入铁氰化钾溶液150μL，显色并终止反应。重复二板，以红色深浅初筛碱性磷酸酶产生菌。
1.4.2产酶菌株碱性磷酸酶活力的测定
取目的菌株一环接于10mL LB培养液中，摇床培养过夜，取菌悬液l mL接种于20mLLB培养液中，37℃，180r/min摇床培养，发酵24h～72h，取5mL发酵液，4℃、5000rpm离心10min，收集上清液备用。
以磷酸苯二钠比色法测定碱性磷酸酶活性。具体方法为：取上清液0.5mL加入到1.0mL含有0.15％4-氨基安替比林的碳酸盐缓冲液(0.1M，pH10)，37℃水浴5min，再加入0.02M磷酸苯二钠1.0mL，37℃水浴15min后立即加入3mL铁氰化钾溶液显色立即充分混匀，用分光光度计于510nm波长处比色，用蒸馏水调零，以未接种的培养液为对照。
酶活定义为：37℃下每分钟产生1μmol游离酚的酶量为一个酶活单位(U)。
1.4.3耐热性菌株的筛选和测定
将初筛得到的“+++”强阳性菌株在水浴中进行加热处理，在85℃、95℃分别处理15min，然后按照稀释平板计数法分别测定热处理前后菌株的活菌数，计算存活率。
稀释平板法：分别用1.0mL灭菌吸管吸取菌液1mL，沿管壁徐徐注入含有9.0mL灭菌生理盐水(0.90％)的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：10的稀释液；另取1.0mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液。将此溶液作适当梯度稀释后，分别吸取1.0mL稀释菌液放入无菌平板中，加入15mL LB培养基，充分混匀。每个梯度2个重复，室温下静置5～10min后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24h，选取30～300个菌落之间的平板进行计数，根据其稀释倍数即可换算出菌液活菌数。
1.5筛选结果
1.5.1以微孔板法对芽孢菌株进行了初筛，结果见表1。
表1产碱性磷酸酶菌株初筛结果
注：“ALP”强阳性“+++”表示颜色深红，中强阳性“++”表示颜色中等，弱阳性“+”表示稍有红色，“-”表示没有变红。
由表1看出，微孔板法共初筛56株菌，46株菌检测到ALP活性，其中包含中强阳性菌株20株，强阳性菌株12株，强阳性菌株分别为：BLCC1-0441、BLCC1-0455、BLCC1-0015、BLCC1-0037、BLCC1-0101、BLCC1-0157、BLCC1-0126、BLCC1-0169、BLCC1-0246、BLCC1-0418、BLCC1-0014及BLCC1-0168。
1.5.2对初筛菌株进行耐热筛选，结果见表2
表2初筛ALP强阳性“+++”菌株耐热性复筛结果
由表2看出，初筛的12株“+++”强阳性菌株其中9株耐热性较强，分别为BLCC1-0015、BLCC1-0037、BLCC1-0157、BLCC1-0169、BLCC1-0418、BLCC1-0441、BLCC1-0455、BLCC1-0014及BLCC1-0168菌株。
1.5.3以磷酸苯二钠法进行第二次复筛，结果见表3。
表3耐热性菌株复筛结果
由表3看出，耐热性较强的菌株其中3株产ALP活力较强，分别为BLCC1-0441、BLCC1-0014及BLCC1-0168菌株，且随发酵时间延长，酶活不断增加，37℃、180r/min发酵48h后ALP活力分别为3.046U/mL、3.598U/mL及3.438U/mL。
经过后续多次重复和验证试验，最终选择产碱性磷酸酶活力较高且性能稳定的BLCC1-0441菌株作为研究对象。
2.菌种的鉴定与安全试验
2.1材料与方法
2.1.1菌种：BLCC1-0441
2.1.2细菌的常规生化鉴定：除特别说明外，一般形态、生理生化性状试验均参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版)和《微生物学实验手册》进行。
2.1.3 16S rDNA的扩增与序列分析
目的菌株接种于新鲜的LB培养基中培养18h，采用天根公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16S rDNA序列扩增。所用引物为通用引物：1492r 5’-ggttaccttgttacgactt-3’，如SEQ ID NO:1所示，27f 5’-agagttgatcctggctcag-3’，如SEQID NO:2所示，PCR反应体系(50μL)为:Mixture 25μL(含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天根生化科技有限公司)，上下游引物各1μL，模板DNA 2μL，超纯水21μL。PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。
2.1.4安全性试验：包含急性毒性试验及慢性毒性试验。
2.1.4.1急性毒性试验：
将小鼠预饲3d后，按照体重差异不显著原则，将48只昆明小鼠随机分为高剂量组(5.0×1010CFU/mL)、中计量组(2.5×1010CFU/mL)、低剂量组(1.0×1010CFU/mL)及生理盐水对照组，每组12只，雌雄各半。取活化菌株BLCC1-0441接种于LB液体培养基中，37℃培养24h，4℃、5000r/min离心20min，弃上清，用无菌生理盐水调整菌液至相应浓度。各组小鼠均一次性灌胃，剂量为0.2mL/只。在灌胃前8h灌胃后4h小鼠禁食不禁水，灌胃后每天观察记录小鼠临床表现。观察7d后处死存活小鼠，剖检，出现异常变化的器官制作组织切片。
2.1.4.2慢性毒性试验：
将小鼠预饲3d后，按照体重差异不显著原则，将80只昆明小鼠随机分为高剂量组(1.0×1010CFU/mL)、中计量组(2.5×109CFU/mL)、低剂量组(5.0×108CFU/mL)及生理盐水对照组，每组20只，雌雄各半。各组每天灌胃1次，连续灌胃30d，剂量为0.2mL/只。每天观察试验鼠临床症状，试验期间每周称重，计算增重。试验结束时处死存活小鼠，剖检，并称量肝脏、肾脏等脏器重量，计算脏器系数。脏器指数(％)＝脏器重量(g)×100/小鼠体重(g)
2.2结果
2.2.1菌种形态鉴定
挑取菌株BLCC1-0441纯培养物种接于LB培养基平皿，37℃培养24h，形成杏仁白色菌落，湿润，边缘有羽毛状分裂。显微镜下观察菌体呈杆状，两端钝圆。有芽孢，芽孢近椭圆形，革兰氏染色阳性，见图1、2。菌株BLCC1-0441生理生化特性如表4所示。
表4 BLCC1-0441生理生化特征
将上述鉴定结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》上关于芽孢杆菌属的描述相对照，BLCC1-0441属于芽孢杆菌(Bacillus sp.)。
2.2.2 16S rDNA的鉴定结果：
菌株BLCC1-0441的16S rRNA PCR电泳图如图3所示，条带在1000～2000bp之间，约为1500bp。由测序结果可知，其序列长度为1466bp。其具体序列如下(SEQ ID NO:3)：
菌株BLCC1-0441的16S RNA PCR条带在1000～2000bp之间，约为1.5kb的单一扩增产物。将该序列与GenBank的核酸数据作同源性比对。结果表明(见图4)，与已知地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)16S rDNA序列JN366762.1、FJ493045.1等的同源率为98％～100％。综合菌落及菌体形态，菌株BLCC1-0441鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。
2.2.3安全性试验
2.2.3.1急性毒性试验结果
结果发现，各试验组与对照组小鼠的精神、食欲、行为、粪便等均未见异常，试验组小鼠未出现死亡。观察7d后处死存活小鼠，剖检内脏器官未见异常变化，表明菌株BLCC1-0441无急性毒性。
2.2.3.2慢性毒性试验结果
试验期间，各试验组及对照组均无异常临床症状，剖检小鼠各脏器器官也未见病变。由表5可知，各组小鼠的体重均随着日龄的增加而增加，且各组间差异均不显著(P＞0.05)。
表5慢性毒性试验各组小鼠体重的变化(g)
注：同行肩标字母不同表示差异显著(P＜0.05)，肩标字母相同或无字母表示差异不显著(P＞0.05)。下同
由表6可知，各剂量试验组与对照组间的各脏器指数均差异不显著(P＞0.05)。
表6慢性毒性试验各组小鼠脏器指数(％)
急性毒性、慢性毒性试验结果表明，本发明菌株BLCC1-0441无致病性，安全性良好。
2.3与文献对比
本发明将菌株BLCC1-0441与文献(庄百川等，2009)中菌株HB1的初始产碱性磷酸酶能力进行比较。菌株的培养方法及碱性磷酸酶活性测定方法完全按照文献中操作步骤进行。具体如下：
取目的菌种两环接种于10mLLB培养液培养18h，取菌悬液1mL接种于文献中基础培养液A(蛋白胨5g，酵母粉5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，水1000mL，pH7.0)，30℃，150r/min震荡培养24h、48h取样，5℃、5000r/min离心30min，收集上清液(细胞外酶液)，测酶活性。细胞沉淀用生理盐水洗涤一次，5℃、5000r/min离心20min。弃上清，细胞沉淀加5mL0.1mol/L碳酸盐缓冲液制成细胞悬液，冰水浴超声波粉碎细胞(120W，处理4s，间隔4s，处理99次)。5℃、8000r/min、离心30min，收集上清液(细胞内酶液)，测酶活性。
碱性磷酸酶活性测定方法同对比文献，具体方法同1.4.2。酶活性测定结果见表7。
表7菌株碱性磷酸酶活性对比测定结果(U/mL)
表7中HB1的酶活数据出自对比文献图(庄百川等，2009)。通过同发酵条件同酶活测定方法的对比结果可以看出，本发明中BLCC1-0441菌株的产碱性磷酸酶性能明显优于菌株HB1。
3菌株碱性磷酸酶的性能研究
3.1不同pH缓冲液对菌株碱性磷酸酶活力影响
为确定最佳的缓冲液，选择在不同pH(8.0、9.0、10.0、10.5、11.0)的缓冲溶液中用磷酸苯二钠比色法测定菌株BLCC1-0441碱性磷酸酶活力，并计算剩余酶活力，结果见图5。
由图5看出，当缓冲液pH为10.0左右时，测得菌株BLCC1-0441发酵液酶活力最高。当pH低于10.0时，酶活力迅速降低，pH 8.0时酶活力仅有pH 10.0时酶活力的38.7％，而略高于10.0的pH对酶活力的影响有限。这证明该酶为碱性磷酸酶。
3.2菌株碱性磷酸酶的热稳定性研究
用不同的温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)预处理上清液20min，然后用磷酸苯二钠比色法于37℃测定菌株BLCC1-0441碱性磷酸酶活力，并计算剩余酶活力，结果见图6。
由图6看出，经过不同温度(20℃～90℃)的热处理后，菌株BLCC1-0441碱性磷酸酶活力并没有降低，有升高趋势，80℃时酶活力最高，表明该酶具有良好的耐热性。
并以磷酸苯二钠比色法分别于不同的温度(37℃、45℃、55℃、65℃、70℃、75℃)测定菌株BLCC1-0441碱性磷酸酶活力，计算剩余酶活力。由图7看出，菌株BLCC1-0441碱性磷酸酶的最适作用温度为70℃左右。
4菌株产碱性磷酸酶条件优化
以单因素及正交设计方法，对菌株BLCC1-0441发酵培养基及发酵条件进行优化，提高菌株产酶活力。
4.1葡萄糖含量对菌株产酶影响
添加不同含量葡萄糖，研究葡萄糖含量对菌株BLCC1-0441产酶能力影响，结果见表8。
表8葡萄糖含量对菌株BLCC1-0441产酶能力影响
由表8看出，随着葡萄糖添加量增大，菌体密度和ALP均是先升高后降低，葡萄糖含量为4g/L时菌体密度和ALP活力达最大，ALP活力最大为6.368U/mL。葡萄糖含量过低时不利于菌株生长，且含量过高会抑制菌株产酶能力。因此，发酵培养基中葡萄糖含量确定为4g/L。
4.2氮源对菌株产酶影响
以LB为基础发酵培养基，分别选取硫酸铵、蛋白胨、L-谷氨酸、酵母膏、甘氨酸及尿素为单一氮源，添加量为15g/L，每种氮源做3瓶，发酵培养48h后检测发酵液的ALP活力，结果见表9。
表9添加量一致时不同氮源对菌株BLCC1-0441产酶影响
由表9看出，不同氮源对菌株BLCC1-0441发酵产酶影响很大，蛋白胨作为单一氮源时发酵效果最好，ALP最高为9.018U/mL，其次为酵母膏、尿素、L-谷氨酸，硫酸铵、甘氨酸的效果最差，只有0.129U/mL。且蛋白胨、酵母膏作单一氮源时ALP活力均高于二者复合作氮源的发酵效果，但蛋白胨作氮源时菌体密度较低，OD600为1.292，酵母膏作氮源时OD600为2.581。因此，发酵培养基中确定以酵母膏作氮源，添加量为15g/L。
4.3不同离子对菌株产酶影响
在发酵培养基中分别添加0.5g/L的CoCl6·H2O、LiSO4·H2O、CaSO4·2H2O、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O，研究不同离子对菌株BLCC1-0441产酶能力的影响，结果见表10。
表10不同离子对菌株BLCC1-0441产酶能力影响
由表10看出，不同离子对菌株BLCC1-0441产酶能力的影响不同，其中Zn2+、Ca2+对其有抑制作用，Mg2+、Li2+、Co2+对其无明显作用，Mn2+对其起促进作用，ALP酶活升高约2倍。
4.4正交试验设计优化产酶培养基
100mL三角瓶装液20mL，每个正交试验号设置2个瓶子，放置同一摇床中发酵培养，水平因素表及正交试验结果见表11及表12。
表11正交试验四因素三水平表
表12正交试验结果
由表12看出，7号组合酶活力最高，为13.53U/mL。四个因素对菌株BLCC1-0441产ALP活力影响顺序为：L-谷氨酸钠＞葡萄糖＞MnSO4·H2O＞酵母膏，最优试验组合为A3B3C3D2，正交试验中没有这个组合，故进行了验证试验。最终确定发酵培养基配方为：葡萄糖0.6％、酵母膏0.5％、L-谷氨酸钠0.8％、MnSO4·H2O 0.05％、NaCl 0.5％，pH 7.0。4.5装液量对菌株产酶影响
在100mL三角瓶中，分别加入10mL、15mL、20mL、25mL、30mL的培养基，接种后培养48h，分别测定酶活力和生长量，结果见表13。
表13装液量对菌株BLCC1-0441产酶能力影响
由表13看出，装液量对菌株BLCC1-0441产ALP能力影响很大，随着装液量增大，菌体密度略有降低，但ALP活力降低较大。以100mL三角瓶发酵，装液量为10mL时酶活力最高，为24.611U/mL；随着装液量增大，酶活力下降，20mL时酶活力降低49％，之后酶活力基本不变。因此，菌株BLCC1-0441以100mL三角瓶发酵时最佳装液量为10mL。4.6发酵产酶曲线
依照优化的菌株产酶条件，对菌株BLCC1-0441进行50L发酵罐小试试验，测定菌株发酵曲线。
首先以5L三角瓶LB液体培养基制备种子液，装液量为20％，每瓶均从斜面接种两环，37℃、180r/min培养，至镜检芽孢率90％以上时进行发酵罐接种。
发酵条件为：50L发酵罐装25L发酵培养基(配方：葡萄糖0.6％，酵母膏0.5％；L-谷氨酸钠0.8％，MnSO4·H2O 0.05％，NaCl 0.5％，pH 7.0)，121℃灭菌30min；接种量12％，培养温度37℃，通气量1：0.6(V/V·min)。
发酵过程中，每2h取样一次，以磷酸苯二钠法测定上清液中碱性磷酸酶活力，并制作发酵产酶曲线，结果如图8。
由图8可知，以50L发酵罐发酵培养地衣芽孢杆菌BLCC1-0441，随着发酵时间延长菌株产酶活力逐渐升高，16h时上清液中碱性磷酸酶活力达到最高，为39.57U/mL。并在500L发酵罐中，以同样发酵条件进行了试验，得到同样结果。因此，菌株BLCC1-0441最优发酵时间为16h左右。与实验室条件下相比，大大缩短了发酵时间，且菌株在发酵罐中产酶活力更高。
4.7小结
本发明通过分离芽孢杆菌，然后以微孔板法及磷酸苯二钠法筛选产碱性磷酸酶菌株，最终筛选出1株较好菌株，编号为BLCC1-0441，为一株地衣芽孢杆菌。
菌株BLCC1-0441碱性磷酸酶的最适缓冲液pH为10.0；具有良好的耐热性，最适作用温度为70℃左右。通过单因素及正交试验优化后，菌株BLCC1-0441最优发酵培养基配方为：葡萄糖0.6％、酵母膏0.5％、L-谷氨酸钠0.8％、MnSO4·H2O 0.05％、NaCl 0.5％，pH7.0，装液量10mL/100mL三角瓶；在50L、500L发酵罐中37℃发酵培养16h后，胞外碱性磷酸酶活力达40U/mL。与目前国内已报道地衣芽孢杆菌产酶活力相比，本发明得到的菌株产胞外碱性磷酸酶活力最高。
5产碱性磷酸酶菌株在肉鸡上的应用
5.1试验设计与分组
购买75只1日龄白羽肉鸡(购自泰安大宇种禽厂)，饲喂至7日龄时，以体重差异不显著原则将健康肉鸡随机分组，分别饲喂不同日粮，具体分组如下：
所有参试鸡均采用笼养方式。鸡只自由采食、饮水。红外灯控温，持续光照，水槽及粪便每天各清理1次。每天观察鸡只健康状况，记录病死鸡数。按常规程序进行饲养管理。
免疫程序：按规定剂量和方法，于7日龄对鸡进行新城疫疫苗的滴鼻点眼免疫，14日龄进行法氏囊疫苗的滴鼻点眼免疫。疫苗均购自扬州威克生物工程有限公司。
5.2样品采集及检测指标
14日龄时，对鸡只腿肌注射内毒素(0.6EU/只)；分别于15日龄、18日龄及21日龄翅静脉采血，收集血清；21日龄时解剖，对肝脏、脾脏称重，并取盲肠内容物。
5.3数据处理
试验数据先用Microsoft Excel作初步处理，然后采用SPSS 17.0软件One-WayANOVA对上述数据进行方差分析，用Duncan’s方法进行多重比较。试验数据用平均数±标准差表示。
5.4试验结果与分析
5.4.1生长性能
由表14可知，在各阶段内，对照组的增重情况始终最差；试验组3最好，平均日增重表现为试验组3＞抗生素组＞试验组2＞试验组1＞对照组。从全程来看，日粮中添加地衣芽孢杆菌BLCC1-0441的试验组3与对照组相比，能显著提高肉鸡的日增重(P＜0.05)，提高了19.96％，但试验组1、试验组2与对照组相比无明显差异。
表14不同时段各组平均日增重ADG(g)
注：肩标小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)，小写字母相同或无字母表示差异不显著(P＞0.05)。下同
由表15可知，在各阶段，试验组3的料肉比始终最低，各组料肉比表现为试验组3＜抗生素组＜试验组2＜试验组1＜对照组。从全程来看，日粮中添加地衣芽孢杆菌BLCC1-0441的试验组3与对照组相比，料肉比显著降低10.74％(P＜0.05)，但试验组1、试验组2与对照组相比无明显差异。
表15不同时段各组料肉比F/G
5.4.2盲肠菌群
由表16可知，21日龄时，试验组3的肉鸡盲肠内大肠杆菌活菌数低于对照组，且差异显著(P＜0.05)，降低0.55Lg。试验组1、试验组2及抗生素盲肠大肠杆菌活菌数均低于对照组，但差异不显著。表明，日粮中添加地衣芽孢杆菌BLCC1-0441可降低大肠杆菌的数量，显著改善肠道环境。
表16 21日龄肉鸡盲肠大肠杆菌活菌数(LgCFU)
5.4.3血清碱性磷酸酶活力及内毒素含量
由表17可知，饲喂周期内，试验组3的血清碱性磷酸酶活力均最高，对照组最低。且21日龄时，试验组3与对照组、抗生素组相比均差异显著(P＜0.05)，血清碱性磷酸酶活力分别高134.68％、94.01％。但试验组1、试验组2与对照组相比无明显差异。
内毒素含量测定结果显示，15日龄时，3个组间差异不显著；18日龄时，试验组3显著低于对照组及抗生素组(P＜0.05)，分别降低26.23％及24.84％；而抗生素组、试验组1、试验组2与对照组相比内毒素含量未明显降低。21日龄时，试验组内毒素含量显著低于对照组及抗生素组(P＜0.05)，分别降低38.92％及35.45％；抗生素组比对照组降低5.38％，但差异不显著(P＞0.05)，试验组1及试验组2与对照组相比无明显差异。
表17肉鸡血清碱性磷酸酶活力(U/mL)及内毒素含量(EU/mL)
注：同行肩标小写或大写字母不同表示差异显著(P＜0.05)，字母相同或无字母表示差异不显著(P＞0.05)。
综合上述测定指标及结果，我们可以发现虽然菌株BLCC1-0014及BLCC1-0168产胞外碱性磷酸酶活力强(数据见表3)，但将其应用于肉鸡上时效果比对照组无明显差异。分析可能的原因为，这2株芽孢杆菌在动物肠道中的定值能力差，因此饲喂肉鸡后未表现出相应效果。
5.5小结
日粮中添加地衣芽孢杆菌BLCC1-0441后，肉鸡日增重提高19.96％，料肉比降低10.74％，盲肠内大肠杆菌活菌数降低0.55Lg，肉鸡血清碱性磷酸酶活力提高134.68％，内毒素含量降低38.92％。肉鸡试验表明，日粮中添加地衣芽孢杆菌BLCC1-0441后可显著提高肉鸡血清碱性磷酸酶活力，降低内毒素含量，进而达到改善动物肠道，促进动物生长的目的。本发明菌株BLCC1-0441在21日龄内肉鸡上的应用效果(日增重、料肉比等)明显优于已知报道，且首次对肉鸡血清内毒素含量变化进行了检测及分析。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东宝来利来生物工程股份有限公司
<120> 一株芽孢杆菌及其应用
<130> 2018
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagttgatc ctggctcag 19
<210> 3
<211> 1466
<212> DNA
<213> BLCC1-0441的16S rDNA
<400> 3
ccgcaaggcg ggcgtgctaa tacatgcaag tcgagcggac cgacgggagc ttgctccctt 60
aggtcagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact 120
ccgggaaacc ggggctaata ccggatgctt gattgaaccg catggttcaa tcctaaaagg 180
tggcttttaa ctaccccttt ccgatggacc cccggcgcaa taactagttg gtgaggtaac 240
ggctcaccaa ggggaccatg cctaacccaa ctgaaagggt gatcggcccc cctgggactg 300
aaacccggcc caaactccta cgggaggcaa caataaggaa tcttccgcaa tggaccaaag 360
tctgaaggaa caaccccccg tgagtgatga aggttttccg aacctaaaac tctgttgtta 420
gggaaaaaca agtaccgttc caataaggcg gtaccttgac ggtacctaac cagaaagccc 480
cggctaacta cctgccaaca gccgcggtaa tacctaagtg gcaagcgttg tccggaatta 540
ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac 600
cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg 660
tgtagcggtg aaatgcgcta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg 720
tctgtaactg acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta 780
gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagagggtt tccgcccttt agtgctgcag 840
caaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt 900
gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct 960
taccaggtct tgacatcctc tgacaaccct agagataggg cttccccttc gggggcagag 1020
tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080
acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc 1140
ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg 1200
ctacacacgt gctacaatgg gcagaacaaa gggcagcgaa gccgcgaggc taagccaatc 1260
ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc 1320
gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380
ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt tggagccagc 1440
cgccgaaagg ttgaccaggt tgtggg 1466

Claims (10)

1.一株地衣芽孢杆菌，其特征是：该菌株的分类命名为地衣芽孢杆菌，编号为BLCC1-0441(Bacillus licheniformis)，已于2018年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2018253。
2.一种微生物混合物，其特征是：至少包含权利要求1所述的地衣芽孢杆菌。
3.包含权利要求1所述的地衣芽孢杆菌或权利要求2所述的微生物混合物的产品。
4.如权利要求3所述的产品，其特征是：所述产品为粉末形式、溶液形式、悬浮剂形式、片剂形式或颗粒形式。
5.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌或权利要求2所述的微生物混合物或权利要求3所述的产品在制备具有高产碱性磷酸酶和具有良好定植性能的微生态制剂中的应用。
6.一种具有高产碱性磷酸酶和具有良好定植性能的微生态制剂，其特征是：该微生态制剂包括权利要求1所述的地衣芽孢杆菌或权利要求2所述的微生物混合物或权利要求3所述的产品。
7.如权利要求6所述的微生态制剂，其特征是：在该微生态制剂中所述地衣芽孢杆菌的活菌数为9.0～10.0×1010cfu/g。
8.权利要求6或7所述的具有高产碱性磷酸酶和具有良好定植性能的微生态制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)菌种的发酵：
发酵培养基配方为，以质量百分比计：葡萄糖0.6％、酵母膏0.5％、L-谷氨酸钠0.8％、MnSO4·H2O 0.05％、NaCl 0.5％，35～40℃通气发酵培养14～18h；
(2)将步骤(1)中得到的发酵液处理得到微生态制剂。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征是：步骤(1)中，所述菌种的发酵具体包括：
菌株活化：以新鲜LB斜面接种菌株BLCC1-0441，35～40℃培养18～30h，镜检芽孢率在90％以上后斜面保存备用。
种子液的制备：以LB液体培养基制备种子液，装液量为18～22(v/v)％；从斜面接种两环至新鲜培养基中，35～40℃、150～200r/min培养，至镜检芽孢率90％以上时进行发酵罐接种。
发酵培养：发酵培养基配方为，以质量百分比计：葡萄糖0.6％、酵母膏0.5％、L-谷氨酸钠0.8％、MnSO4·H2O 0.05％、NaCl 0.5％，pH 7.0，灭菌；接种量为10～14(v/v)％，通气量为1：0.4～0.8(V/V·min)，35～40℃发酵培养14～18h。
10.如权利要求8所述的制备方法，其特征是：步骤(2)中，所述微生态制剂为粉末形式、溶液形式、悬浮剂形式、片剂形式或颗粒形式。
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