CN110484467A - 一株多粘芽孢杆菌及其产生的抗菌肽和应用 - Google Patents

一株多粘芽孢杆菌及其产生的抗菌肽和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110484467A
CN110484467A CN201910765844.8A CN201910765844A CN110484467A CN 110484467 A CN110484467 A CN 110484467A CN 201910765844 A CN201910765844 A CN 201910765844A CN 110484467 A CN110484467 A CN 110484467A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
antibacterial peptide
antibacterial
molecular weight
bacillus polymyxa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910765844.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110484467B (zh
Inventor
王春凤
单宝龙
于佳民
赵倩
张志焱
孙明杰
陈雷
谷巍
徐海燕
王红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd
Original Assignee
Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd filed Critical Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd
Priority to CN201910765844.8A priority Critical patent/CN110484467B/zh
Publication of CN110484467A publication Critical patent/CN110484467A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110484467B publication Critical patent/CN110484467B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/12—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes by fermentation of natural products, e.g. of vegetable material, animal waste material or biomass
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
    • A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
    • A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/12—Bacillus polymyxa ; Paenibacillus polymyxa

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一株多粘芽孢杆菌及其产生的抗菌肽和应用。所述多粘芽孢杆菌，其命名为多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)BLCC1‑0402，保藏于武汉大学菌种保藏中心，保藏号为：CCTCC No:M 2019530。该菌能够自然稳定的高产抗菌肽，且抗菌肽具有优异的抑菌活性。

Description

一株多粘芽孢杆菌及其产生的抗菌肽和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株多粘芽孢杆菌及其产生的抗 菌肽和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理 解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一 般技术人员所公知的现有技术。
抗菌肽(也称细菌素)通常由12-100个氨基酸残基组成，分子量约为 1.3-12KDa。抗菌肽作为大多数生物对入侵病原体的自然防御系统的重要 组成部分，其具有独特的抗菌作用机制，迅速杀菌作用且不易引发细菌的 耐药性。传统的抗生素通常是针对单一的酶来控制代谢途径，容易引起细 菌的耐药性。与传统抗生素相比，大部分的抗菌肽显示出了多种生物活性， 主要通过影响细胞质膜来发挥作用。因此，细菌必须要改变它们膜的组成和结构来对抗菌肽产生抗药性，但这对菌体本身也会造成严重的伤害。细 菌细胞膜外层富含阴离子磷脂，哺乳动物细胞膜的两性离子脂质比较丰 富，这正是抗菌肽可以抗菌而对哺乳类细胞不造成损坏的主要原因。所以 抗菌肽是一类极具发展潜力的生物药物。
由于微生物生产抗菌肽有成本低、无毒害、周期短等明显优点，加快 微生物抗菌肽的研究已势在必行，发明人发现，当前研究主要集中在乳酸 菌，而乳酸菌产生的抗菌肽存在着耐热性差、抗菌谱窄等缺陷。国内外研 究人员发现，芽孢杆菌能够产抗菌肽，然而不同菌产抗菌肽的能力参差不 齐、抑菌活性以及抗菌肽的稳定性差异较大，比如抗菌肽Sublancin 168 (3.9KDa)，其由枯草芽孢杆菌168菌株的发酵液中分离得到，但是该抗 菌肽对革兰氏阴性菌并无抑制作用，并且对肉鸡肠道中的有益菌比如乳酸 杆菌并无影响，因此，对肉鸡肠道微环境并无较好的调节作用；比如凝结 芽孢杆菌FM603产生的细菌素(4.5KDa)对革兰氏阳性致病菌如金黄色 葡萄球菌、单核增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和耐药菌如抗甲氧西林金黄 色葡萄球菌具有很强的抗菌活性(抑菌圈直径>20mm)，对厌氧产芽孢梭菌 如产气荚膜梭菌和坚强梭菌具有较强的抗菌活性(抑菌圈直径17-18mm)， 对革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌、耶尔森菌，对革兰氏阳性菌如枯 草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳杆菌以及对酵母菌无抗菌活性；比如枯草 芽孢杆菌菌株SX3411，其能产生抗菌肽，其产生的抗菌肽能够很好的抑 制革兰氏阳性菌，但是对革兰氏阴性菌沙门氏杆菌和大肠杆菌无抑制活 性；比如枯草芽孢杆菌菌株ZJU15能够产生三种抗菌活性物质ZJU15A、ZJU15B、ZJU15C，其分子量均在1KDa左右。此外，天然抗菌肽的表达 量低、提取过程复杂，难以大量获得，因此形成一套完整的从成分复杂的 发酵液中分离纯化小分子抗菌肽的提纯方案也是抗菌肽研究中的关键。
发明内容
发明人在研究中发现：小分子抗菌肽尤其分子量不大于5KDa时毒副 作用小、耐酶稳定性好、成药潜力优异，因此从成分复杂的发酵液中分离 纯化小分子抗菌肽是抗菌肽研究中的关键环节。然而，发明人还发现，几 乎没有能够自然高产小分子抗菌肽的微生物，现有已知微生物自然产生小 分子抗菌肽的量较少，从天然表达的菌体发酵液中分离得到的相同体积量 的蛋白上清液中超过5KDa的多肽的体积占量一般超过80％，5-12KDa的 多肽体积占量可达前述体积的50％甚至以上，相应地，小分子抗菌肽的产 量也较低，比如枯草芽孢杆菌LFB112，其能够产生细菌素A(5.461KDa)、 B(3.442KDa)、C(＜1KDa)，然而该菌发酵产生的多肽中，超过90％的 多肽分子量是大于5KDa的，小分子量(不大于5KDa)的抗菌多肽特别 少，比如其细菌素B、C的体积分别仅占其多肽上清液的1％和0.5％，其 产量仅有0.014mg，即每100mL上清液中其细菌素B和C的产量分别仅 有0.065mg和0.014mg；再比如枯草芽孢杆菌BF168能够产生sublancin 抗菌肽，其分子量约为3.9KDa，然而，该抗菌肽的产量仅为80-150mg/L。
因此，本发明的目的是提供一株能够自然高产抗菌肽、尤其能够自然 高产低分子量抗菌肽的多粘芽孢杆菌，以及提供一种提取分离抗菌肽的方 法，并提供了该菌产生的抗菌肽的应用。本发明的多粘芽孢杆菌能够自然 稳定高产抗菌肽，尤其能够自然高产小分子量(不大于5KDa)的抗菌肽， 其中，分子量不大于5KDa的多肽占本发明所述多粘芽孢杆菌蛋白上清液 体积的65％以上，5KDa-3KDa的多肽占量接近20％，超滤浓缩后得到的 5KDa-3KDa的多肽产量(蛋白浓度)高达2.73mg/mL且其多肽纯化倍数 达2.12，活性回收率达19.65％。
本发明提取分离抗菌肽的方法简单、高效、便于推广应用。
本发明所述多粘芽孢杆菌产生的多肽，尤其低分子量(5KDa-3KDa) 抗菌肽不仅能调节肉鸡肠道菌群，促进乳酸菌增殖、抑制大肠杆菌繁殖， 而且能够降低肉鸡血清内毒素水平，刺激肉鸡机体粘膜免疫比如提高盲肠 内容物sIgA含量，提高肉鸡机体免疫功能，达到标本兼治的效果，避免了 在治疗肉鸡疾病中使用抗生素，解决了动物源产品中的抗生素残留问题。
具体地，本发明具有如下所述的技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了一株多粘芽孢杆菌，其命名为多 粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)BLCC1-0402，保藏于武汉大学菌种保藏中 心，保藏号为：CCTCC No:M2019530。
所述多粘芽孢杆菌菌株：菌株在固体培养基上培养，菌落颜色为乳白 色，四周隆起较中间部位高，有光泽，革兰氏染色为阳性；细菌产芽孢， 椭圆形。所述固体培养基的组成按质量分数计包括：玉米浆0.5％、蛋白胨 5％、琼脂1.5％、葡萄糖3％、氯化钙0.25％，pH值为7.0，121℃灭菌25-30min。
所述多粘芽孢杆菌能够产生小分子抗菌肽，所述抗菌肽的分子量为 3-5KDa，在一个进一步分离的实施方式中，其分子量为4KDa。
在本发明的第二方面，本发明还提供了一种提取分离抗菌肽的方法，所 述方法包括：培养获取上述第一方面中所述的多粘芽孢杆菌的发酵液，离心 取上清液后超滤分别获取不同分子量的组分。
在本发明的一些实施方式中，所述多粘芽孢杆菌的发酵液的制备方法包 括：将多粘芽孢杆菌接种在固体培养基中培养，然后接种于种子液体培养基 中培养获取种子液，将种子液接种于液体发酵培养基中，静置发酵培养。
在本发明的实施方式中，所述固体培养基的组成按质量分数计包括：玉 米浆0.5％、蛋白胨5％、琼脂1.5％、葡萄糖3％、氯化钙0.25％，pH值为 7.0，121℃灭菌25-30min。
在本发明的实施方式中，所述多粘芽孢杆菌接种于固体培养基中在 30-40℃下(比如37℃)培养18-24h。
在本发明的实施方式中，所述多粘芽孢杆菌接种于种子液体培养基中在 30-40℃条件下(比如37℃)，静置培养18-20h。
在本发明的实施方式中，所述种子液接种于液体发酵培养基中30-40℃ 条件下(比如37℃)，静置培养18-24h。
在本发明的实施方式中，所述离心条件为：离心速度为4000-6000r/min， 离心时间为8-15min。
在本发明的实施方式中，所述超滤采用超滤膜，超滤膜的截留分子量为 3-10KDa。
在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括：将超滤获取的不同分 子量的组分分别进行抑菌活性测定、蛋白浓度测定，然后选取抑菌活性最高 的组分进行凝胶过滤层析，收集不同分子量的多肽分子。
在本发明的实施方式中，所述方法包括：超滤获取的不同分子量的组分 分别进行抑菌活性测定后，选取抑菌活性最大的组分进行冻干，将冻干粉溶 解到超纯水中透析，取透析内液进行凝胶过滤层析，其中，检测波长为 214nm，流动相为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠与NaCl的混合溶液。
在本发明的实施方式中，所述流动相混合溶液的pH为7.0，所述混合溶 液中磷酸二氢钾、磷酸氢二钠的量为50mmol/L(磷酸二氢钾、磷酸氢二钠 的体积比为1:1)，NaCl的浓度为150mmol/L。
在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括对不同分子量的多肽分子 分别进行抑菌活性实验，确定具有抑菌活性的多肽分子。
在本发明的一些实施方式中，确定具有抑菌活性的多肽分子后，还包 括采用Tricine-SDS-PAGE检测确定具有抑菌活性的多肽分子的分子量。
在本发明的一个实施方式中，所述提取分离抗菌肽的方法包括：
发酵上述第一方面所述的多粘芽孢杆菌，获取多粘芽孢杆菌发酵液，包 括：配制固体培养基(玉米浆0.5％、蛋白胨5％、琼脂1.5％、葡萄糖3％、 氯化钙0.25％)，调pH值为7.0，121℃灭菌25min；将多粘芽孢杆菌一环接 种于固体斜面培养基上，在30-40℃下培养18-24h(18、19、20、21、22、 23、24小时均可，但是24小时时更为充分)；以2％(v/v)的接种量，将一 级种子液接于500mL-1000mL种子液体培养基中，在30-40℃条件下，静置 培养18-20h(18、19、20小时均可，但20小时更为充分)，制得种子液； 以2％(v/v)的接种量，将种子液接于液体发酵培养基中，于30-40℃条件 下，静置培养18-24h(18、19、20、21、22、23、24小时均可，但是过长 比如23-24小时或过短比如18-19小时均不利于所需发酵产物的获取，20小 时时发酵产生的所需产物的量最多)，得到多粘芽孢杆菌发酵液。
将得到的多粘芽孢杆菌发酵液离心取上清液：离心条件为转速为 4000-6000r/min(4000、4500、5000、5500、6000r/min均可)，离心8-15min (8、9、10、11、12、13、14、15min均可)，较为优选的离心条件为6000r/min 离心15min，该条件下的离心效率、效果均较好。
将离心得到的上清液进行超滤以获取不同分子量的组分：超滤膜的截留 分子量为3-10KDa，比如依次采用10KDa、8KDa、5KDa、3KDa的超滤膜 进行超滤，分别获取>10KDa、10KDa-8KDa、8KDa-5KDa、5KDa-3KDa和 <3KDa的组分，对获得的多个组分进行抑菌活性的测定，选取抑菌活性最好 的组分(在本发明的一个实施方式中，5KDa-3KDa的组分具有最优的抑菌 活性)冻干保存。
选取抑菌活性最好的组分进行凝胶过滤层析，收集不同分子量的多肽分 子：将冻干的组分溶解到超纯水中形成饱和液，透析，取透析内液进行凝胶 过滤层析，透析可采用常规的操作，以获得目标物为准，比如，透析采用超 纯水，透析过程持续4小时，中间换水两次，透析内液可选择分装冷冻备用。
凝胶过滤层析中，流动相的选择较为关键，本发明的实施方式中对流动 相进行了筛选包括：流动相的组分以及流动相中特定组分的用量，其中，当 流动相为50mmol/L Tris与150mmol/L NaCl的混合溶液(pH＝7.0)时，无法 实现对组分中不同分子量多肽的有效分离，其凝胶层析曲线出现横跨多体积 的馒头峰，如图2所示；当采用50mmol/L磷酸盐与90mmol/LNaCl的混合 溶液(pH＝7.0)时，能够实现较大分子量的多肽分子间的分离，但无法较好 的分离出小分子量的多肽，如图3所示；当采用50mmol/L磷酸盐和 150mmol/LNaCl的混合溶液(pH＝7.0)时，能够较好的分离出不同分子量的 多肽分子，对小分子量的多肽分离效果较好，如图4所示。
在本发明的实施方式中，凝胶过滤层析的操作比如可以为：
选用Superdex peptide 10/300GL凝胶层析柱、AKTA pure层析系统，将 抑菌活性最高的组分的冻干粉2g溶解到6mL超纯水中(饱和液)，用超纯 水透析4h，中间换水2次，透析内液分装冷冻备用，上样量0.5mL/次，流 动相为50mmol/L磷酸盐+150mmol/LNaCl(pH＝7.0)的缓冲液，流速为 0.5mLl/min，检测波长为214nm，先用缓冲液平衡层析柱1倍柱体积，将样 品上样后，待出现峰时，按分子量大小依次收集不同分子量的多肽(比如如 图4中所示的多肽A1、多肽A2和多肽A3)；可选地，进行冷冻干燥。
对上述分离得到的不同分子量的多肽(比如多肽A1、A2、A3)分别进 行抑菌活性检测及Tricine-SDS-PAGE检测，确定具有抑菌活性的多肽分子 及其分子量，比如在本发明的一个实施方式中，所述多肽分子为多肽A3， 其分子量为4.0KDa。
将凝胶过滤层析收集到的具有抑菌活性的多肽分子溶液(比如多肽 A3)，进行冷冻干燥，可制得抗菌肽制剂。
在本发明的第三方面，本发明提供了上述第二方面所述的方法提取分 离得到的抗菌肽。所述抗菌肽的分子量为3-5KDa，在一个进一步分离的实 施方式中，其分子量为4KDa，其产量不低于1.8mg/mL。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种菌剂，其包括上述第一方面 中所述的多粘芽孢杆菌及其发酵产物。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种抗菌肽制剂，其包括上述第 三方面所述的抗菌肽。
以及，本发明提供了上述抗菌肽制剂的制备方法，其包括将提取分离得 到的抗菌肽进行冷冻干燥。
在本发明的第六方面，本发明提供了上述第三方面所述的抗菌肽或上 述第四方面所述的菌剂或上述第五方面所述的抗菌肽制剂在制备调节肉 鸡肠道菌群，和/或降低肉鸡血清内毒素水平，和/或刺激肉鸡机体粘膜免疫 的制剂或添加剂或饲料中的应用。
在本发明的实施方式中，所述调节肉鸡肠道菌群包括促进乳酸菌增殖 的同时抑制大肠杆菌繁殖。
在本发明的实施方式中，所述刺激肉鸡机体粘膜免疫包括提高盲肠内容 物sIgA含量。
在本发明的一些实施方式中，本发明以分子量为4KDa的多肽A3与 市售竞品抗菌肽、杆菌肽锌、那西肽分别作为肉鸡的日粮添加剂以相同的 方式分别饲喂肉鸡，结果抗菌肽A3组肉鸡盲肠和直肠中乳杆菌数量均显 著高于空白组、市售竞品抗菌肽、杆菌肽锌、那西肽组，竞品组肉鸡盲肠 和直肠中乳杆菌数量与空白组差异不显著；抗菌肽A3组盲肠和直肠中大 肠杆菌数量均显著低于空白组、市售竞品抗菌肽组、杆菌肽锌组和那西肽 组，市售竞品抗菌肽组直肠中大肠杆菌数量与空白组差异不显著。抗菌肽 A3组血清内毒素含量最低，分别比市售竞品组、杆菌肽锌组、那西肽组 低22.74％、24.77％、21.99％，该差异具有显著性，与空白组的差异不显 著。抗菌肽A3组盲肠内容物sIgA含量最高，显著高于空白组，该差异显 著，但其与市售竞品组、杆菌肽锌组和那西肽组的差异不显著。
此外，本发明的多粘芽孢杆菌产生的抗菌肽抑菌谱广，可抑制畜禽养 殖中分离的鸡大肠埃希氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、猪大肠杆菌、金黄色葡萄 球菌、沙门氏菌、牛金黄色葡萄球菌等畜禽致病菌；可抑制水产品中分离 的嗜水气单胞菌、鱼链球菌等水产致病菌；对有益益生菌无抑制作用，并 且能够促进乳酸菌增殖。
本发明的一些实施方式中，本发明所述多粘芽孢杆菌产生的抗菌肽 (比如分子量在5KDa-3KDa、尤其分子量为4KDa的抗菌肽A3)具有较 好的稳定性，在温度37℃、50℃、60℃、70℃、80℃处理15min后抑菌率 保持在97％以上，90-100℃处理15min，抑菌率保持在96％左右；在pH5-9 中抗菌活性没有明显变化，在pH2-4中抗菌活性保持在90％以上；经胃蛋 白酶作用后抑菌活性降低20％，胰蛋白酶作用后抑菌活性降低18％，蛋白 酶K对抑菌活性几乎无影响。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解， 本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不 当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例2中的蛋白浓度测定标准曲线图
图2为实施例2筛选1进行的Superdex 75 10/300GL凝胶层析图。
图3为实施例2筛选2进行的Superdex 75 10/300GL凝胶层析图。
图4为实施例2筛选3进行的Superdex 75 10/300GL凝胶层析图。
图5为实施例2筛选3中样品A与收集的多肽A1、A2、A3的抑菌效 果图。
图6为实施例4中的Tricine-SDS-PAGE电泳图。
图7为实施例6中温度对抗菌肽A3的影响结果图。
图8为实施例6中pH值对抗菌肽A3的影响结果图。
图9为实施例6中蛋白酶对抗菌肽A3的影响结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用 于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件 的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员 所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获 得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使 用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法 及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示 范之用。
本发明的实施例中如无特殊说明，当使用BLCC1-0402时，均指本发 明的多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)BLCC1-0402。
实施例1、菌株的鉴定
1材料与方法
菌株多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)BLCC1-0402，保藏于武汉大 学菌种保藏中心，保藏号为：CCTCC No:M 2019530。除特别说明外，一 般形态、生理生化性状实验均参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版)和 《微生物学实验手册》进行。
2鉴定结果
菌种形态及特性：菌株在固体培养基上培养，菌落颜色为乳白色，四 周隆起较中间部位高，有光泽，革兰氏染色为阳性；细菌产芽孢，椭圆形。
多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)BLCC1-0402的序列：
1 ttcggcggct ggctcttgcg gttacctcac cgacttcggg tgttgtaaac tctcgtggtg
61 tgacgggcgg tgtgtacaag acccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt
121 actagcaatt ccgacttcat gtaggcgagt tgcagcctac aatccgaact gagaccggct
181 tttctaggat tggctccacc tcgcggcttc gcttcccgtt gtaccggcca ttgtagtacg
241 tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt
301 tgtcaccggc agtctgctta gagtgcccag cttgacctgc tggcaactaa gcataagggt
361 tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac
421 cacctgtctc ctctgtcccg aaggaaaggc ctatctctag accggtcaga gggatgtcaa
481 gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atactccact gcttgtgcgg
541 gtccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggaatgctta
601 atgtgttaac ttcggcacca agggtatcga aacccctaac acctagcatt catcgtttac
661 ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgcg cctcagcgtc
721 agttacagcc cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca
781 ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gctctccagt ttccagtgcg
841 acccgaagtt gagcctcggg attaaacacc agacttaaag agccgcctgc gcgcgcttta
901 cgcccaataa ttccggacaa cgcttgcccc ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag
961 ttagccgggg ctttcttctc aggtaccgtc actcttgtag cagttactct acaagacgtt
1021 cttccctggc aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcggcgttgctcc
1081 gtcaggcttt cgcccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtaggagtctgggcc
1141 gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatcgtcgccttgg
1201 taggccatta ccccaccaac tagctaatgc gccgcaggcc catccacaagtgacagattg
1261 ctccgtcttt cctccttctc ccatgcagga aaaggatgta tcgggtattagctaccgttt
1321 ccggtagtta tccctgtctt gtgggcaggt tgcctacgtg ttactcacccgtccgccgct
1381 agattatgta gaagcaagct tctacataac cccgctcgac tgca
实施例2、抗菌肽的分离提取
1制备发酵液
1.1制备BLCC1-0402发酵液
按表1配制BLCC1-0402的培养基，121℃灭菌25min，将BLCC1-0402 一环接种于上述固体斜面培养基上，在37℃下培养24h；以2％(v/v)的 接种量，将一级种子液接于500mL-1000mL种子液体培养基(表1配方中 不加入琼脂)中，在37℃条件下，静置培养20h，制得种子液；以2％(v/v) 的接种量，将种子液接于液体发酵培养基(表1配方中不加入琼脂)中，于37℃条件下，静置培养20h。
表1固体培养基配方
1.2制备BLCC1-0085发酵液
按表1配制BLCC1-0085(枯草芽孢杆菌，山东宝来利来生物研究院 保藏并提供)的培养基，121℃灭菌25min，将BLCC1-0085一环接种于上 述固体斜面培养基上，在37℃下培养24h；以2％(v/v)的接种量，将一 级种子液接于500mL-1000mL种子液体培养基(表1配方中不加入琼脂) 中，在37℃条件下，静置培养20h，制得种子液；以2％(v/v)的接种量， 将种子液接于液体发酵培养基(表1配方中不加入琼脂)中，于37℃条件 下，静置培养20h。
2、离心
分别获取上述1.1、1.2中BLCC1-0402、BLCC1-0085的发酵液置于转 速为6000r/min的离心机中，离心15min，分别收集BLCC1-0402、 BLCC1-0085的上清液。
3、超滤分离
试验材料与方法：
将离心所得的BLCC1-0402、BLCC1-0085上清液，分别选用分子截留 量为10KDa、8KDa、5KDa、3KDa的超滤膜进行超滤，分别测定初始发 酵液、>10KDa、10KDa-8KDa、8KDa-5KDa、5KDa-3KDa和<3KDa组分 的抑菌活性、蛋白浓度。
4、抑菌活性测试方法：将大肠杆菌CVCC1556(购自中国兽医微生物 菌种保藏管理中心)接种至灭菌营养肉汤培养液中，37℃摇床培养18-24h (活菌数达到108cfu/mL)，作为待用指示菌原发酵液。用0.9％的灭菌生理 盐水将指示菌原发酵液稀释至106cfu/mL，备用。吸取稀释好的指示菌使 用液0.8mL加入平板中，无菌操作吸取15mL冷却至50℃左右灭菌的营养 琼脂固体培养基(含1.5％琼脂)，加入到上述已加指示菌的平板中，混匀， 平板冷却备用。用2.7mm的直径打孔器，在检测板上垂直均匀打孔，指示 菌检测板制备完毕。在指示菌检测板上每孔分别注入10微升各样品处理 液。正置2h后，再倒置放于37℃培养箱内，培养24h。
效价计算：
培养完毕后，检测板上会出现抑菌圈，用卡尺测定抑菌圈的直径 (mm)，取平均值。按下列公式计算抑菌活性(U/mL)：
X＝(平均直径mm-2.7mm)/2.1
抑菌活性(U/mL)＝2X×1000×稀释倍数
5、蛋白浓度检测方法：
配制斐林酚甲液、乙液，将标准牛血清蛋白(bovine serum albumin， BSA)配制成浓度分别为0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、 200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL的几个梯度，各加入0.5mL甲液混匀， 置于23℃水浴15min，再加入0.05mL乙液，迅速混匀，于30℃水浴保温 30min，在630nm波长测定其吸光值，并绘制如图1标准曲线。
试验结果：见表2、表3。
表2 BLCC1-0402超滤分离测定结果
表3 BLCC1-0085超滤分离测定结果
本实施例依据分子量大小对样品进行浓缩处理，使用超滤膜系统获得 预期分子量范围的蛋白产物。发酵液离心所得上清液经不同分子量截留范 围的膜超滤截留后被分离成五个不同的组分，分子量为>10KDa、 10KDa-8KDa、8KDa-5KDa、5KDa-3KDa和<3KDa。由表2、3结果比较 可知，其中BLCC1-0402上清液，通过膜超滤截留的各个组分中， 5KDa-3KDa组分中活性物质回收率最高，纯化倍数最大，因此选择 BLCC1-0402上清液截留的3KDa-5KDa组分进行下一步分离，冻干保存。
6、Superdex peptide 10/300GL凝胶过滤层析
选用Superdex peptide 10/300GL凝胶层析柱，AKTA pure层析系统， 超滤后得到的抑菌活性最高的3KDa-5KDa的样品A冻干粉2g溶解到6mL 超纯水中(饱和液)，用超纯水透析4h，中间换水2次，透析内液分装冷冻 备用，上样量0.5mL/次，通过不同的流动相进行对比(即下方筛选1、筛 选2和筛选3)，流速为0.5mL/min，检测波长为214nm。先用流动相平衡层析柱1倍柱体积，将样品上样后，待出现峰时，按分子量大小收集多肽 A1、A2、A3冷冻干燥。
筛选1：选用Superdex peptide 10/300GL凝胶层析柱，AKTA pure层 析系统，超滤后得到的抑菌活性最高的3KDa-5KDa的样品A冻干粉2g 溶解到6mL超纯水中(饱和液)，用超纯水透析4h，中间换水2次，透析内 液分装冷冻备用，上样量500μL/次，流动相为50mmol/LTris+150mmol/L NaCl，pH7.0缓冲液，流速为0.5mL/min，检测波长为214nm。先用流动 相缓冲液平衡层析柱1倍柱体积，将样品上样后，待出现峰时，收集各峰 冷冻干燥。凝胶层析图如图2所示。
如图2所示，无法实现对组分中不同分子量多肽的有效分离，其凝胶 层析曲线出现横跨多体积的馒头峰。
筛选2：选用Superdex peptide 10/300GL凝胶层析柱，AKTA pure层 析系统，超滤后得到的抑菌活性最高的3KDa-5KDa的样品A冻干粉2g 溶解到6mL超纯水中(饱和液)，用超纯水透析4h，中间换水2次，透析内 液分装冷冻备用，上样量500μL/次，流动相为50mmol/L磷酸盐(磷酸二 氢钾、磷酸氢二钠1：1)+90mmol/L NaCl，pH7.0缓冲液，流速为0.5mL/min，检测波长为214nm。先用流动相缓冲液平衡层析柱1倍柱体积，将样品上 样后，待出现峰时，收集各峰冷冻干燥。凝胶层析图如图3所示。
如图3所示，能够实现较大分子量的多肽分子间的分离，但无法较好 的分离出小分子量的多肽。
筛选3：选用Superdex peptide 10/300GL凝胶层析柱，AKTA pure层 析系统，超滤后得到的抑菌活性最高的3KDa-5KDa的样品A冻干粉2g 溶解到6mL超纯水中(饱和液)，用超纯水透析4h，中间换水2次，透析内 液分装冷冻备用，上样量500μL/次，流动相为50mmol/L磷酸盐(磷酸二 氢钾、磷酸氢二钠1：1)+150mmol/L NaCl，pH7.0缓冲液，流速为 0.5mL/min，检测波长为214nm。先用流动相缓冲液平衡层析柱1倍柱体 积，将样品上样后，待出现峰时，收集各峰A1、A2、A3冷冻干燥。凝胶 层析图如图4所示。
如图4所示，能够较好的分离出不同分子量的多肽分子，对小分子量 的多肽分离效果较好。
结果分析：由图2、3、4结果对比显示，筛选3的方法能够实现不同 分子量多肽的分离，且分子量按由大到小分离效果较好。按分子量大小依 次收集多肽A1、多肽A2和多肽A3，冷冻干燥，进行抑菌活性检测。
实施例3、抑菌活性检测
试验材料与方法：
将大肠杆菌CVCC1556接种至灭菌营养肉汤培养液中，37℃摇床培 养18-24h(活菌数达到108cfu/mL)，作为待用指示菌原发酵液。用0.9％ 的灭菌生理盐水将指示菌原发酵液稀释至106cfu/mL，备用。吸取稀释好 的指示菌使用液0.8mL加入平板中，无菌操作吸取15mL冷却至50℃左右 灭菌的营养琼脂固体培养基(含1.5％琼脂)，加入到上述已加指示菌的平 板中，混匀，平板冷却备用。用2.7mm的直径打孔器，在检测板上垂直均 匀打孔，指示菌检测板制备完毕。在指示菌检测板上每孔分别注入10微 升样品处理液(实施例2中筛选3收集得到的A1、A2、A3)。正置2h后， 再倒置放于37℃培养箱内，培养24h。
效价计算：
培养完毕后，检测板上会出现抑菌圈，用卡尺测定抑菌圈的直径 (mm)，取平均值。按下列公式计算抑菌活性(U/g)：
X＝(平均直径mm-2.7mm)/2.1
抑菌活性(U/g)＝2X×1000×稀释倍数
试验结果：见表4、图5。
表4 Superdex 75 10/300GL凝胶层析分离组分抑菌活性(实施例2 中筛选3收集得到的A1、A2、A3)
由表4、图5可知，超滤所得的3KDa-5KDa的样品A经Superdex 75 10/300GL凝胶过滤层析分离得到分子量由大到小的多肽A1、A2、A3，冷 冻干燥，配成质量浓度相同的溶液，经过测定抑菌活性，A3抑菌活性最 大，A1、A2的抑菌活性相对于A3较弱。
实施例4、Tricine-SDS-PAGE电泳检测
对实施例3中的A3进行Tricine-SDS-PAGE电泳检测。
试验材料与方法：
采用不连续体系，分离胶浓度16％，夹层胶浓度10％，积层胶浓度 4％，30V 1h，100V至结束。用含0.1mol/L乙酸铵的50％甲醇-10％乙酸固 定30min，用0.025％考马斯亮蓝G250-1％乙酸混合液染色1h，再用为10％ 乙酸-45％甲醇脱色两次，每次30min，转入水中放置。电泳贮存液配方见 表5，凝胶(分离胶、夹层胶、积层胶)配方见表6。
表5电泳贮存液的配方
表6凝胶的配方
试验结果：见图6。
由图6可知，Tricine-SDS-PAGE电泳结果显示A3为单一条带，说明 经过以上的纯化步骤，已经分离得到一电泳纯级抗菌肽。通过测量计算得 到抗菌肽A3的分子量为4KDa。
实施例5、抗菌肽抑菌谱研究
1培养基：
LB培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.2-7.5
2检测方法
采用琼脂平板法，在LB平板培养基中分别涂布致病菌，菌体浓度为 105cfu/mL，在牛津小杯中分别滴加10μL纯化的多肽样品A3(无菌水溶 解)，36℃恒温培养18h，测量抑菌圈大小。抗菌活性强弱用抑菌圈直径 (mm)表示(数值等于抑菌圈外径减小杯直径，为3次重复的算术平均值)。
按下列公式计算抑菌活性(U/mL)：
X＝(平均直径mm-2.7mm)/2.1
抑菌活性(U/mL)＝2X×1000×稀释倍数
表7抗菌肽A3的抑菌谱结果
上述大肠杆菌CVCC1552、大肠杆菌CVCC1568、大肠杆菌CVCC1556 均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，其余菌株由山东宝来利来生物 研究院保藏并提供。
由表7结果可知，抗菌肽对不同畜禽来源的大肠杆菌、沙门氏菌、金 黄色葡萄球菌均有较好的抑菌效果，对水产动物源致病菌均有较好的抑菌 活性。
实施例6、抗菌肽A3稳定性研究
试验方法：
(1)热稳定性
将抗菌肽分别于37℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃水浴 中加热15min，10000×g离心10min，收集上清液测定对大肠杆菌CVCC1556 的抑菌活性，以不经热处理的样品作为对照，将对照的抑菌活性定位 100％。
(2)pH稳定性
将抗菌肽分别调节pH为2、3、4、5、6、7、8、9，10000×g离心10min， 收集上清液测定对大肠杆菌CVCC1556的抑菌活性。以不经处理的样品作 为对照，将对照的抑菌活性定位100％。
(3)蛋白酶稳定性
37℃水浴条件下，用反应浓度均为1mg/mL的蛋白酶K、胃蛋白酶、 胰蛋白酶分别处理抗菌肽30min，测定各种酶处理液对大肠杆菌 CVCC1556的抑菌活性。以不加酶处理的抗菌肽作为对照，其抑菌活力定 为100％。
试验结果：见图7-9。
如图7所示，抗菌肽A3经过37-60℃处理15min，抑菌圈活性变化不 大，抑菌率保持在97％以上；90-100℃处理15min，抑菌活性稍微减少但 保持在96％左右。
如图8所示，抗菌肽经不同pH处理，在pH5-9中抗菌活性没有明显 变化，在pH2-4时抗菌活性有所减少，但仍可以达到90％以上。
如图9所示，经胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K作用，抗菌肽的抑菌 率均有所下降。经胃蛋白酶作用后抗菌肽A3活性降低20％，胰蛋白酶作 用后抗菌肽A3活性降低18％，蛋白酶K对抗菌肽A3的活性几乎无影响。
实施例7、抗菌肽A3在肉鸡上的应用效果实验
材料与方法：
试验设计：1日龄健康肉公雏540只，随机分为5个处理，每个处理6个重复，每个重复18只鸡。Ⅰ组为空白组，饲喂不添加任何益生菌和抗 生素的基础日粮；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组为试验组，Ⅱ组在基础日粮中添加50 g/t抗菌肽A3；Ⅲ组在基础日粮中添加50g/t竞品抗菌肽；Ⅳ组在基础日粮 中添加40g/t杆菌肽锌；Ⅴ组在基础日粮中添加2.5g/t那西肽。各组皆自 由采食和饮水，按鸡场正常程序进行免疫接种，7日龄用鸡新城疫弱毒苗 滴鼻，14日龄用传染性法氏囊疫苗饮水，21日龄用新城疫弱毒苗第二次 加强免疫。采用玉米－豆粕型基础日粮，其配制参照NRC(1994)，基础 日粮组成及营养水平见表8。预试期3d，正试期35d。
表8基础日粮组成及营养水平
①预混料为每千克日粮提供：VA 11000IU；VD3 3000IU；VE 15IU； VK3 20mg；VB110mg；VB2 30mg；VB6 20mg；VB12 0.2mg；烟酸600 mg；泛酸180mg；叶酸10mg；生物素0.8mg；胆碱7mg；Cu 0.2g； Fe 1.2g；Mn 1.9g；Zn 1.8g；I 10mg；Se 6mg。②营养水平为计算值；
饲养管理：
试验肉鸡购自泰安大禹种禽场，按重复分笼饲养，自由采食和饮水。 舍内光照、温度、湿度、消毒及免疫均按照常规饲养管理程序进行。试验 期间保持肉鸡的健康状况良好。
测定指标：
(1)肠道菌群数量
38日龄时，从每个重复中随机选取6只肉鸡，分别称重，处死，无菌 操作取盲肠和直肠内容物各1g，于99mL灭菌生理盐水中摇匀，然后取 1mL于试管中，加入无菌0.9％生理盐水9mL，振荡混匀，依次按10倍 等比稀释至10-7。其中乳杆菌接种于乳酸菌选择性培养基(LBS)上培养， 在37℃生化培养箱中厌氧培养48h后进行菌落计数；大肠杆菌则接种于 伊红美兰琼脂培养基上培养，在37℃生化培养箱中有氧培养24h后进行 菌落计数。菌群数量以每克肠道内容物所含细菌群落总数的对数 [(lgCFU/g)]表示。
(2)血清内毒素含量
38日龄时，从每个重复中随机选取6只肉鸡，颈动脉采血，于10mL 离心管中37℃恒温培养箱中静置1h后，3000r/min离心5min，分离血 清，用ELSIA试剂盒测定血清内毒素含量(Eu/L)，试剂盒购自上海科华生 物。
(3)盲肠内容物sIgA含量
38日龄时，从每个重复中随机选取6只肉鸡，分别称重，处死，无菌 操作取盲肠内容物1g，于2mL灭菌生理盐水处理30min后，3000r/min 离心10min，用ELSIA试剂盒测定盲肠内容物sIgA含量(ng/mL)，试剂 盒购自上海科华生物。
试验结果：见表9-10。
表9抗菌肽A3对肉鸡盲肠、直肠中乳杆菌、大肠杆菌的数量影响 (单位：lg cfu/g)
注：同一阶段，同行数据肩标以不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，以相同小写字母 或无字母表示差异不显著(P＞0.05)。
由表9可知，抗菌肽A3组(Ⅱ组)肉鸡盲肠和直肠中乳杆菌数量均 显著高于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组(P＜0.05)，竞品组(III组)肉鸡盲肠和直肠中 乳杆菌数量与空白组差异不显著；抗菌肽A3组盲肠和直肠中大肠杆菌数 量均显著低于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组(P＜0.05)，竞品组直肠中大肠杆菌数量与 空白组差异不显著(P＞0.05)。
表10抗菌肽A3对肉鸡血清内毒素、盲肠内容物sIgA的影响
注：同一阶段，同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同小写字母或无 字母表示差异不显著(P＞0.05)。
由表10可知，抗菌肽A3组(II组)血清内毒素含量最低，分别比Ⅲ、 Ⅳ、Ⅴ组的低22.74％、24.77％、21.99％(P＜0.05)，与I组差异不显著(P ＞0.05)。抗菌肽A3组盲肠内容物sIgA含量最高，显著高于Ⅰ组(P＜0.05)， 与Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组差异不显著(P＞0.05)。
综合来看，通过肉鸡试验可知，抗菌肽A3在促进肠道乳杆菌增殖， 抑制大肠杆菌繁殖，降低血清内毒素水平，刺激机体粘膜免疫等方面均优 于竞品组和基础日粮中添加杆菌肽锌和那西肽。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来 说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中 部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何 修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东宝来利来生物工程股份有限公司
<120> 一株多粘芽孢杆菌及其产生的抗菌肽和应用
<130> 201922897
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1424
<212> DNA
<213> 多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）
<400> 1
ttcggcggct ggctcttgcg gttacctcac cgacttcggg tgttgtaaac tctcgtggtg 60
tgacgggcgg tgtgtacaag acccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt 120
actagcaatt ccgacttcat gtaggcgagt tgcagcctac aatccgaact gagaccggct 180
tttctaggat tggctccacc tcgcggcttc gcttcccgtt gtaccggcca ttgtagtacg 240
tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt 300
tgtcaccggc agtctgctta gagtgcccag cttgacctgc tggcaactaa gcataagggt 360
tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac 420
cacctgtctc ctctgtcccg aaggaaaggc ctatctctag accggtcaga gggatgtcaa 480
gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atactccact gcttgtgcgg 540
gtccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggaatgctta 600
atgtgttaac ttcggcacca agggtatcga aacccctaac acctagcatt catcgtttac 660
ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgcg cctcagcgtc 720
agttacagcc cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca 780
ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gctctccagt ttccagtgcg 840
acccgaagtt gagcctcggg attaaacacc agacttaaag agccgcctgc gcgcgcttta 900
cgcccaataa ttccggacaa cgcttgcccc ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960
ttagccgggg ctttcttctc aggtaccgtc actcttgtag cagttactct acaagacgtt 1020
cttccctggc aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc 1080
gtcaggcttt cgcccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc 1140
gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg 1200
taggccatta ccccaccaac tagctaatgc gccgcaggcc catccacaag tgacagattg 1260
ctccgtcttt cctccttctc ccatgcagga aaaggatgta tcgggtatta gctaccgttt 1320
ccggtagtta tccctgtctt gtgggcaggt tgcctacgtg ttactcaccc gtccgccgct 1380
agattatgta gaagcaagct tctacataac cccgctcgac tgca 1424

Claims (10)

1.一株多粘芽孢杆菌，其命名为多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)BLCC1-0402，保藏于武汉大学菌种保藏中心，保藏号为：CCTCC No:M 2019530。
2.根据权利要求1所述的多粘芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株在固体培养基上培养，菌落颜色为乳白色，四周隆起较中间部位高，有光泽，革兰氏染色为阳性，产芽孢，椭圆形。
3.权利要求1或2中所述的多粘芽孢杆菌产生的抗菌肽；优选地，所述抗菌肽的分子量为3-5KDa。
4.一种提取分离抗菌肽的方法，所述方法包括：培养获取权利要求1所述的多粘芽孢杆菌的发酵液，离心取上清液后超滤分别获取不同分子量的组分。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离心条件为：离心速度为4000-6000r/min，离心时间为8-15min；
优选地，所述超滤采用超滤膜，超滤膜的截留分子量为3-10KDa。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将超滤获取的不同分子量的组分分别进行抑菌活性测定、蛋白浓度测定，然后选取抑菌活性最高的组分进行凝胶过滤层析，收集不同分子量的多肽分子；
优选地，所述方法包括：超滤获取的不同分子量的组分分别进行抑菌活性测定后，选取抑菌活性最大的组分进行冻干，将冻干粉溶解到超纯水中透析，取透析内液进行凝胶过滤层析，其中，检测波长为214nm，流动相为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠与NaCl的混合溶液；
优选地，所述流动相混合溶液的pH为7.0，所述混合溶液中磷酸二氢钾、磷酸氢二钠的量为50mmol/L，两者体积比为1:1，NaCl的浓度为150mmol/L；
优选地，所述方法还包括对不同分子量的多肽分子分别进行抑菌活性实验，确定具有抑菌活性的多肽分子；
优选地，确定具有抑菌活性的多肽分子后，还包括采用Tricine-SDS-PAGE检测确定具有抑菌活性的多肽分子的分子量。
7.一种菌剂，其包括权利要求1或2中所述的多粘芽孢杆菌及其发酵产物。
8.一种抗菌肽制剂，其包括权利要求3所述的抗菌肽。
9.抗菌肽制剂的制备方法，其包括将权利要求3所述的抗菌肽进行冷冻干燥。
10.权利要求3所述的抗菌肽或权利要求7所述的菌剂或权利要求8所述的抗菌肽制剂在制备抑菌药或饲料添加剂中的应用；
或者，权利要求3所述的抗菌肽或权利要求7所述的菌剂或权利要求8所述的抗菌肽制剂在制备具有包括调节肉鸡肠道菌群、降低肉鸡血清内毒素水平和刺激肉鸡机体粘膜免疫中的一种或多种功能的制剂或添加剂或饲料中的应用：；
优选地，所述调节肉鸡肠道菌群包括促进乳酸菌增殖的同时抑制大肠杆菌繁殖；
优选地，所述刺激肉鸡机体粘膜免疫包括提高盲肠内容物sIgA含量。
CN201910765844.8A 2019-08-19 2019-08-19 一株多粘芽孢杆菌及其产生的抗菌肽和应用 Active CN110484467B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910765844.8A CN110484467B (zh) 2019-08-19 2019-08-19 一株多粘芽孢杆菌及其产生的抗菌肽和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910765844.8A CN110484467B (zh) 2019-08-19 2019-08-19 一株多粘芽孢杆菌及其产生的抗菌肽和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110484467A true CN110484467A (zh) 2019-11-22
CN110484467B CN110484467B (zh) 2020-11-20

Family

ID=68551493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910765844.8A Active CN110484467B (zh) 2019-08-19 2019-08-19 一株多粘芽孢杆菌及其产生的抗菌肽和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110484467B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113729109A (zh) * 2021-07-20 2021-12-03 华南农业大学 一种富含抗菌物质的发酵饲料及其制备方法
CN114391604A (zh) * 2022-01-04 2022-04-26 清远一生自然生物研究院有限公司 一种制备含有抗菌肽饲料添加剂的方法
CN116850267A (zh) * 2023-07-13 2023-10-10 山东宝来利来生物工程股份有限公司 一种酵母细胞壁-抗菌肽a3复合制剂及其制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5599197A (en) * 1979-01-23 1980-07-28 Kayaku:Kk Preparation of colistin heptapeptide
WO2006101486A2 (en) * 2005-03-18 2006-09-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Bacteriocins and novel bacterial strains
CN103396475A (zh) * 2013-08-06 2013-11-20 深圳翰宇药业股份有限公司 一种纯固相合成多肽类抗生素Colistin的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5599197A (en) * 1979-01-23 1980-07-28 Kayaku:Kk Preparation of colistin heptapeptide
WO2006101486A2 (en) * 2005-03-18 2006-09-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Bacteriocins and novel bacterial strains
CN103396475A (zh) * 2013-08-06 2013-11-20 深圳翰宇药业股份有限公司 一种纯固相合成多肽类抗生素Colistin的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VELLAICHAMY MAGESHWARAN等: "Isolation and partial characterization of antibacterial lipopeptide produced by Paenibacillus polymyxa HKA-15 against phytopathogen Xanthomonas campestris pv. phaseoli M-5", 《WORLD JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY VOLUME》 *
W-W ZHOU等: "Isolation of an antifungal Paenibacillus strain HT16 from locusts and purification of its medium-dependent antagonistic component", 《JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY》 *
莫秋芬: "抗菌肽AP2对感染鼠伤寒沙门氏菌小鼠的保护作用及其原核表达", 《万方平台》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113729109A (zh) * 2021-07-20 2021-12-03 华南农业大学 一种富含抗菌物质的发酵饲料及其制备方法
CN113729109B (zh) * 2021-07-20 2023-04-28 华南农业大学 一种富含抗菌物质的发酵饲料及其制备方法
CN114391604A (zh) * 2022-01-04 2022-04-26 清远一生自然生物研究院有限公司 一种制备含有抗菌肽饲料添加剂的方法
CN116850267A (zh) * 2023-07-13 2023-10-10 山东宝来利来生物工程股份有限公司 一种酵母细胞壁-抗菌肽a3复合制剂及其制备方法与应用
CN116850267B (zh) * 2023-07-13 2024-03-15 山东宝来利来生物工程股份有限公司 一种酵母细胞壁-抗菌肽a3复合制剂及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110484467B (zh) 2020-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101671640B (zh) 双歧杆菌的基因组
CN105238722B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其菌粉制剂的制备方法和应用
CN105567598B (zh) 一种藏猪源解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN105175518B (zh) 凝结芽孢杆菌fm603产生的细菌素及其制备方法
CN106957810B (zh) 一种乳酸片球菌及其用途
CN110484467A (zh) 一株多粘芽孢杆菌及其产生的抗菌肽和应用
CN102517238B (zh) 一株产酸蜡样芽孢杆菌及其应用
CN105062933A (zh) 一种罗伊氏乳杆菌及其应用
CN105368755A (zh) 一种产酸屎肠球菌、抑菌微生态制剂及其应用
CN105176874A (zh) 凝结芽孢杆菌fm603及其应用
CN101392223A (zh) 一种微生物饲料添加剂菌种的选育方法
CN107927441B (zh) 一种适用于冷水鱼虹鳟类的微生态制剂
CN111304119B (zh) 一种降解伏马毒素的饲用枯草芽孢杆菌及其应用
CN103013893A (zh) 一株植物乳杆菌ccl67及其应用
CN108865931A (zh) 一株芽孢杆菌及其应用
CN109874920A (zh) 一种复合微生物饲料添加剂及其制备方法
CN105104712B (zh) 一种微生物饲料添加剂及其制备方法
CN110016443B (zh) 一种罗伊氏乳杆菌及其在富硒鸡蛋生产中的应用
CN114908009B (zh) 一株口粘液乳杆菌pr63及其应用
SETYATI et al. Enzyme-producing symbiotic bacteria in gastropods and bivalves molluscs: Candidates for bioindustry materials
CN112094777B (zh) 一种植物乳杆菌及其在崂山奶山羊饲料中的应用
CN109609393A (zh) 一种饲用异常威克汉姆酵母及其应用
CN102994426A (zh) 一株地衣芽孢杆菌及其应用
CN109161501B (zh) 一种饲用地衣芽孢杆菌及其应用
IQBAL Study of enterotoxigenicity of B. cereus emetic strain by skin vasopermeability reaction in rabbits and poultry

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant