CN105671113A - 用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于重组蛋白表达领域，具体涉及一种用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基及其制备方法，本发明培养基中每1000毫升含有：胰蛋白胨12-16克、酵母提取物6-10克、D-山梨醇60-100克、氯化钠8-16克、D-葡萄糖1-2克、1mol/L？Tris-HCl缓冲液(pH7.2)20-100毫升、加去离子水至1000毫升。该培养基可促进大肠杆菌通过信号肽向周质空间分泌重组蛋白，促进周质空间中的重组蛋白通过非特异性分泌途径进一步释放到培养基液体中，进而提高大肠杆菌分泌表达重组蛋白的成功率和产量。

Description

用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于重组蛋白表达领域，具体涉及一种用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基及其制备方法，该培养基可提高大肠杆菌分泌表达重组蛋白成功率和产量。
背景技术
大肠杆菌表达重组蛋白，是将异源目的蛋白的编码基因克隆插入pET系列等高表达载体并转入大肠杆菌细胞内，使大肠杆菌经诱导后大量产生所需的目的蛋白。该技术广泛应用于酶、抗体、疫苗的工业生产，以及科研院校制备科研用重组蛋白。大肠杆菌表达重组蛋白主要有5种方式：
(1)胞内表达：目的蛋白翻译后停留于大肠杆菌细胞质内；
(2)膜定位表达：目的蛋白翻译后经合适的信号肽引导，停留于大肠杆菌内膜上；
(3)周质分泌表达：目的蛋白翻译后经pelB等信号肽引导，从大肠杆菌细胞质运输到内外膜之间的周质空间；
(4)培养基分泌表达：经长时间诱导后，已进入周质空间的目的蛋白可进一步经由非特异性分泌途径穿过大肠杆菌外膜，释放到周围的培养基液体中；
(5)包涵体表达：目的蛋白被不正确地折叠，在大肠杆菌细胞质或周质空间中聚集成不可溶的紧致微粒(包涵体)。
这5种蛋白表达方式中，膜定位表达因表达量较低且难以进行后续纯化，因此实用价值较低。包涵体表达在大部分情况下导致蛋白质变性并失去其正常功能(失活)，虽然在部分情况下可以通过复性使蛋白质恢复正确构象并恢复部分活性，但复性工作量大且蛋白活性无法100％恢复。胞内表达、周质空间表达和培养基分泌表达的实用性较高，但面临的共同困难是目的蛋白可溶性不佳，易在细胞质内或周质空间中聚集，转化为包涵体。虽然可通过共表达可溶性标签等手段提高目的蛋白的可溶性，但需要切除可溶性标签的额外步骤。综上所述，在胞内表达、周质空间表达和培养基分泌表达中提高目的蛋白的可溶性是最常采用的策略。
基于上述应用背景，发明人欲提供一种新的培养基，促进大肠杆菌通过信号肽向周质空间分泌重组蛋白，促进周质空间中的重组蛋白通过非特异性分泌途径进一步释放到培养基液体中。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基，该培养基可促进大肠杆菌通过信号肽向周质空间分泌重组蛋白，促进周质空间中的重组蛋白通过非特异性分泌途径进一步释放到培养基液体中，进而提高大肠杆菌分泌表达重组蛋白的成功率和产量。
本发明培养基中每1000毫升含有：胰蛋白胨12-16克、酵母提取物6-10克、D-山梨醇60-100克、氯化钠8-16克、D-葡萄糖1-2克、1mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.2)20-100毫升、加去离子水至1000毫升。
优选的，本发明培养基中每1000毫升含有：胰蛋白胨16克、酵母提取物10克、D-山梨醇100克、氯化钠12克、D-葡萄糖2克、1mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.2)100毫升、加去离子水至1000毫升。
本发明培养基的制备方法如下：按照上述比例关系配制培养基，然后按照常规方法灭菌即可。
其中，本发明采用的灭菌方法为：采用高压蒸汽灭菌，即在115℃、0.07MPa压力下灭菌30分钟。
本发明培养基的关键改进在于：添加D-山梨醇促进周质空间和培养基中重组蛋白形成氢键，并与较高浓度的氯化钠一起提高溶液渗透压，促进蛋白分泌。添加葡萄糖防止大肠杆菌利用乳糖导致重组蛋白在诱导开始前发生低水平泄露表达并形成凝聚核。添加Tris-HCl缓冲液，使培养基维持在中性略偏碱性的pH值，进一步提高蛋白表达量并防止包涵体形成。通过上述关键组分和用量的控制，可以显著提高大肠杆菌分泌表达重组蛋白的成功率和产量。
名词解释：
1、本发明所述酵母提取物：国际通用名YeastExtract。是根据中华药典之规定采用以蛋白质含量丰富的酵母为原料，将酵母通过质壁分离后利用自身水解酶系完全自溶，去除细胞壁和不溶性分子后浓缩干燥为浅黄色粉状纯天然制品。主要成分为多肽、氨基酸、核苷酸、B族维生素及微量元素。是常用的生物培养基原料和发酵工业中的主要原料。
2、本发明所述胰蛋白胨：国际通用名Tryptone。又称胰酪蛋白胨(CaseinTryptone)、胰酶消化酪蛋白胨(Pancreaticdigestofcasein)，是一种优质蛋白胨，是以新鲜牛肉和牛骨经胰酶消化，浓缩干燥而成的浅黄色粉末。具有色浅、易溶、透明、无沉淀等物理性状。可配制各种微生物培养基，用于细菌的培养、分离、增殖、鉴定，以及无菌试验培养基、厌氧菌培养基等细菌生化特性试验用培养基的配置。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，说明但不限制本发明。
重组蛋白表达菌种制备：从LB固体培养基平板上挑取一个新鲜菌落，接入装有本发明的培养基5-50ml的锥形瓶中，用已灭菌的棉塞、发泡硅胶塞或透气封口膜封口。置于恒温摇床中，温度30-37℃，转速160-220rpm，培养12-16h(过夜)。表达菌种必须在重组蛋白表达前新鲜准备，制备后立刻进入扩大培养和诱导蛋白表达过程。
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细解释，目的在于帮助读者更好地理解本发明，但不作为对本发明实施范围的限定。
一、利用重组植酸酶PhyM的表达筛选培养基组分
1、将胰蛋白胨，酵母提取物，D-山梨醇，氯化钠，D-葡萄糖，Tris-HCl缓冲液(pH7.2)，按照表1添加组分，加去离子水至1000毫升。
2、试验过程：
1)所用重组蛋白表达菌株是已转入环境宏碁因组来源的重组植酸酶PhyM的大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)菌株。发明人于2014年6月11日制备重组蛋白表达菌种，6月12日开始诱导蛋白表达。
2)无菌操作将新制备的过夜菌种按1:200的比例接入本发明的培养基1000ml，在5000ml三角瓶中，在37℃、摇床转速180rpm的培养条件下培养约2小时，直到含菌培养基的600nm光密度值达到0.6。
3).重组蛋白诱导表达：加入过滤灭菌的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2mmol/l，在20℃、摇床转速180rpm的培养条件下继续培养约18小时。
4)纯化目的蛋白：经过上述18小时的诱导表达过程后，将菌液在10000rpm、4℃的条件下离心10分钟，取上清液。用GEAKTA-pure蛋白层析纯化系统与HisTrapExcel(5ml柱床体积)镍亲和层析纯化柱分离纯化，得到上清液中的重组植酸酶蛋白PhyM。
3、试验结果见表2。
表1培养基组分配方
表2试验结果
备注：目标蛋白分布(S:培养基上清液中；P:周质空间中；C:细胞质中)项中，如97％S；2％P；1％C则表示目标蛋白97％在细胞质中；2％在周质空间中；1％在细胞质中。
4、结论：从上述结果可见，有较好效果的配方范围为每1000毫升培养基含有：胰蛋白胨12-16克；酵母提取物6-10克；D-山梨醇60-100克；氯化钠8-16克；D-葡萄糖1-2克；1mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.2)20-100毫升；加去离子水至1000毫升。
二、通过上述考察结果，以胰蛋白胨16克；酵母提取物10克；D-山梨醇100克；氯化钠12克；D-葡萄糖2克；1mol/lTris-HCl缓冲液(pH7.2)100毫升；加去离子水至1000毫升制成培养基分别考察重组植酸酶PhyM的表达和重组酸性磷酸酶rAppA_Gw的表达。
实施例1：重组植酸酶PhyM的表达
1.所用重组蛋白表达菌株是已转入环境宏碁因组来源的重组植酸酶PhyM的大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)菌株。发明人于2014年6月11日制备重组蛋白表达菌种，6月12日开始诱导蛋白表达。
2.无菌操作将新制备的过夜菌种按1:200的比例接入本发明的培养基1000ml，在5000ml三角瓶中，在37℃、摇床转速180rpm的培养条件下培养约2小时，直到含菌培养基的600nm光密度值达到0.6。
3.重组蛋白诱导表达：加入过滤灭菌的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2mmol/l，在20℃、摇床转速180rpm的培养条件下继续培养约18小时。
4.纯化目的蛋白：经过上述18小时的诱导表达过程后，将菌液在10000rpm、4℃的条件下离心10分钟，取上清液。用GEAKTA-pure蛋白层析纯化系统与HisTrapExcel(5ml柱床体积)镍亲和层析纯化柱分离纯化，得到上清液中的重组植酸酶蛋白PhyM。
实施例2：重组酸性磷酸酶rAppA_Gw的表达
1.所用重组蛋白表达菌株是已转入重组植酸酶AppA_Gw的大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)菌株。发明人于2014年8月28日制备重组蛋白表达菌种，6月12日开始诱导蛋白表达。
2.无菌操作将新制备的过夜菌种按1:250的比例接入本发明的培养基750ml，在5000ml三角瓶中，在37℃、摇床转速180rpm的培养条件下培养约2小时，直到含菌培养基的600nm光密度值达到0.6。
3.重组蛋白诱导表达：加入过滤灭菌的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2mmol/l，在18℃、摇床转速180rpm的培养条件下继续培养约20小时。
4.纯化目的蛋白：经过上述20小时的诱导表达过程后，将菌液在10000rpm、4℃的条件下离心10分钟，取上清液。用GEAKTA-pure蛋白层析纯化系统与HisTrapExcel(5ml柱床体积)镍亲和层析纯化柱分离纯化，得到上清液中的重组植酸酶蛋白rAppA_Gw。
实施例1和实施例2具体测评数据见表3：
表3实施例1和实施例2的具体测评数据
综上，本发明提供了一种高效的重组蛋白表达培养基，本发明可促进大肠杆菌表达的重组蛋白以可溶性、有活性的形式存在于培养基上清液中，防止重组蛋白形成包涵体。为下一步提取纯化提供便利，可以在工业、农业、食品、医药、科研等涉及重组蛋白表达生产的领域大量推广使用。

Claims (6)

1.用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基，其特征在于：每1000毫升培养基中含有：胰蛋白胨12-16克、酵母提取物6-10克、D-山梨醇60-100克、氯化钠8-16克、D-葡萄糖1-2克、1mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.2)20-100毫升、加去离子水至1000毫升。
2.根据权利要求1所述的用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基，其特征在于：每1000毫升培养基中含有：胰蛋白胨16克、酵母提取物10克、D-山梨醇100克、氯化钠12克、D-葡萄糖2克、1mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.2)100毫升、加去离子水至1000毫升。
3.用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基的制备方法，其特征在于：步骤如下：
A、按下述配比称取原料：每1000毫升培养基中含有：胰蛋白胨12-16克、酵母提取物6-10克、D-山梨醇60-100克、氯化钠8-16克、D-葡萄糖1-2克、1mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.2)20-100毫升、加去离子水至1000毫升；
B、按照上述比例关系配制培养基，然后按照常规方法灭菌即得。
4.根据权利要求3所述的用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基的制备方法，其特征在于：步骤A按下述配比称取原料：每1000毫升培养基中含有：胰蛋白胨16克、酵母提取物10克、D-山梨醇100克、氯化钠12克、D-葡萄糖2克、1mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.2)100毫升、加去离子水至1000毫升。
5.根据权利要求4所述的用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基的制备方法，其特征在于：所述灭菌为采用高压蒸汽灭菌。
6.根据权利要求5所述的用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基的制备方法，其特征在于：所述高压蒸汽灭菌的条件为在115℃、0.07MPa压力下灭菌30分钟。
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