CN101104637A - 一种新的杀菌肽及其产生菌株和用途 - Google Patents

一种新的杀菌肽及其产生菌株和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种能产生新抗菌多肽的CP7菌株，其产生的新抗菌多肽对革兰氏阳性菌具有强烈的抑菌效果，经测定为23个氨基酸残基的小肽，其氨基酸序列为：LLLAQPTAAVRGRCQVQRYLLAA。本发明还提供了新抗菌多肽在抗革兰氏阳性菌药物制备中的应用。

Description

一种新的杀菌肽及其产生菌株和用途
技术领域
本发明涉及生物资源利用领域。尤其是，本发明涉及一种新的杀菌肽及其产生菌株和用途。
背景技术
众所共知，自1928年Flamin发明青霉素并于40年代实际应用于人类以来，各种产自微生物代谢产物的抗生素层出不穷，挽救了无数的生命，为人类健康作出了不可磨灭的贡献。然而，随着时间的推移，人们发现许多抗生素都存在一个致命的弱点，慢慢会产生耐药性，有的还会在体内积累，或通过生物循环、食物链的作用而间接进入人体内，有些抗生素还会影响人的新陈代谢或生物合成，如氯霉素，因此已被停止应用。所以，人们迫切寻找抗生素的代用品或作为补充。抗菌肽是80年代以来被看好的物质之一。抗菌肽分子量小，一般为10000Da以下，因此，不产生抗原性；对细菌的作用机理独特，主要是通过对细菌细胞膜穿孔的物理化学作用，与一般抗生素阻断生物合成等途径明显不同，因此，比较难产生抗药性。而且研究还发现，某些抗菌肽还有明显的抑杀肿瘤细胞的作用。目前，抗菌肽的研究，已经成为许多生物学家的研究热点。目前，已经从许多生物中发现了很多的抗菌肽。如从昆虫、蛙类、猪小肠、植物、真菌、细菌等众多生物中发现了各种各样的抗菌肽，有些已在应用，如多肽抗菌素，有些已进入临床III试验。但由于抗菌肽在生物体中含量不高，提取困难，自然成本就高，限制了它的实际应用。寻找效价高、来源易、成本低的抗菌肽，成为许多生物学家追求的目标。因此从微生物代谢产物中寻找抗菌肽是新药研究中的重要课题之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够产生新的杀菌肽的芽孢杆菌CP7菌株。能高效分泌抗菌蛋白的CP7菌株是多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，已于2005年10月19日保藏于中国典 型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 205119。
根据《伯杰细菌鉴定手册》、《芽孢杆菌属》、《常见细菌系统鉴定手册》等对芽孢杆菌的特征和种的描述，上述CP7菌株的形态特征和生理生化特性与多粘类芽孢杆菌的形态特征和生理生化特性的描述相一致。因而属于多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。
用16S rDNA序列分析法进行生物分子的分类，该菌株16S rDNA序列与34个类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的细菌的同源性为96％-99％，与多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的同源性为99％。同样表明CP7菌株属于多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)。16S rDNA序列已在GenBank上登录，注册号为AY 772704。
本发明的另一个目的在于提供一种新的杀菌肽，该杀菌肽由上述菌株发酵液中分离，由国家生物医学分析中心测定该抗菌肽的分子量为2510Da，由23个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为：LLLAQPTAAVRGRCQVQRYLLAA；经该中心的检索为未知多肽。经圆二色谱初步检测分析出其二级结构，该多肽在溶液中有74.5％呈β-折叠，25.5％为无规卷曲，没有α-螺旋和转角。利用软件DNASIS计算出其等电点为11.13即Cpacin为阳离子型肽，与已经公开的在各种细菌中发现的抗菌肽有很大差别(很多都有α-螺旋结构或环状结构)，根据得到的多肽氨基酸序列经国际互联网的蛋白质公用数据库检索，未发现有与其同源性的蛋白质，表明是一种新的蛋白。现初步命名为：Cpacin。
目前已经发现的多粘类芽孢杆菌的抗菌物质为多肽类的多粘菌素A、B、C、D、E系列，其中多粘菌素E和B已经在临床上应用，专门用于抗革兰氏阴性菌。本课题组也从CP7菌株中分离出多粘菌素E1，分子量为1169.822Da，另外还分离出与多粘菌素类似的3个抗菌活性系列物质成分B1(1155.703Da)、B2(1185.801Da)、C2(1191.923Da)，根据分子量的大小，其中B2和C2可能是多粘菌素的另两种未知组分；经我们的测试，也是只对革兰氏阴性菌有抑杀作用。另外还克隆到β-1，3-1，4-葡聚糖酶的基因，经初步研究该活性组分为抗真菌的组分。
附图说明
图1是CP7菌株的菌体形态。其中A’为营养体，B’为孢子囊、芽孢。
图2是CP7菌株与相近菌株的聚类图。
图3是CP7菌抗菌肽分离纯化技术路线。
图4是固相萃取(Sep-Pak)各活性组分的分离效果。其中出芽短梗霉作为真菌的指示菌；大肠杆菌为革兰氏阴性菌的指示菌；金黄葡萄球菌为革兰氏阳性菌的指示菌。以0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％(图中浓度0～10分别表示0％～100％)的异丙醇水溶液分步梯度洗脱，检测各步收集的洗脱液的抗菌活性。
图5是各活性组分的抗菌效果测试。其中A为抗真菌活性组分，B为多粘菌素E1，C为Cpacin，CK为灭菌水，D为出芽短梗霉，E为大肠杆菌，F为金黄葡萄球菌。
图6是Cpacin的反相-高效液相色谱(RP-HPLC)层析效果。
图7是国家生物医学分析中心测定Cpacin的分子量结果。
图8是国家生物医学分析中心测定Cpacin的氨基酸序列结果。
图9是Cpacin经圆二色谱分析结果。其中G为标准品色谱图，H为Cpacin色谱图。
图10是Cpacin耐热性测试结果。其中指示菌为金黄葡萄球菌。
具体实施方式
实施例1.CP7菌株的筛选与鉴定
菌株筛选自本实验室冷冻保存的样品，用传统的平板划线法分离。平板培养基为YEPD固体培养基(100mL)：YEAST EXTRACT1.0g，TRYPTONE 2.0g，Glucose 2.0g，蒸馏水100mL，自然pH值，加1.5％的琼脂；产抗菌蛋白的液体培养基为(100mL)：YEASTEXTRACT 1.0g，TRYPTONE 2.0g，Glucose 2.0g，蒸馏水100mL，自然pH值。LB培养基(100mL)：TRYPTONE 1.0g，YEASTEXTRACT 0.5g，Nacl 1.0g，蒸馏水100mL，pH 7，固体培养基另加1.5％的琼脂。
按《伯杰细菌鉴定手册》、《芽孢杆菌属》、《常见细菌系统鉴定手册》等中的方法和标准对CP7菌株进行形态特征和生理生化特性测定，结果见图1和表1。
表1 CP7菌株的生理生化特征
  测定项目     结果
过氧化氢酶反应厌氧生长V.P反应V.P培养液生长后pH值28℃生长35℃生长40℃生长46℃生长葡萄糖产酸水解酪素水解纤维素水解淀粉L-酪氨酸分解     +++6.4-6.7+++-++-+-
NO3 -→NO2 -卵磷脂酶pH6.8肉汤生长pH5.7肉汤2％NaCl生长5％NaCl生长7％NaCl生长     +++++--
产“Cpacin”抗菌蛋白的CP7菌株的形态特征和生理生化特性与多粘类芽孢杆菌的形态特征和生理生化特性的描述相一致。因而菌种鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。
生物分子的分类法鉴定：
采用细菌16S rDNA的一对通用引物：正向引物BsF8/20，反向引物BsR1541/20，序列由上海生物工程有限公司合成。
BsF8/20：     5’-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3’
BsR1541/20：  5’-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3’
CP7菌株的基因组DNA用《细菌基因组DNA提取试剂盒》(北京百泰克生物技术有限公司)提取，PCR扩增条件参照许玫英等[21]的方法进行。PCR反应体系的总体积50μL，其中10×PCR buffer 5μL，2.5mmol/L dNTPs 4μl，引物各2μL，模板DNA 2μL，Taq DNA聚合酶(10000U/mL)1μL，无菌水36μL，混匀后，在上面加10μL石蜡油防止水分挥发。PCR扩增反应程序：94℃预变性4min，然后紧接94℃30s，57℃40s，72℃90s，35个循环后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳，采用《DNA快速纯化/回收试剂盒》(北京鼎国生物技术有限责任公司)回收扩增的DNA片段。
测序得到CP7菌株的16S rDNA的序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，结果见图2。传统细菌学方法和生物分子分类法鉴定的结果一致。说明CP7菌株属于多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。
实施例2.CP7菌株发酵条件和发酵培养基的优化
对CP7菌的发酵培养条件进行了优化，经筛选发现，发酵培养基(100mL)的配方为：花生饼粉10g，可溶性淀粉0.67g，MgSO4·7H2O 0.15g，K2HPO4·3H2O 0.1076g，自然pH值时，发酵液中的抗菌活性最高。通过单次单因素试验，发现摇瓶发酵的适宜条件为：培养温度30℃、摇床转速100r/min，接种量1％(v/v)菌液，自然pH值，培养48h。
实施例3.“Cpacin”的制备
对CP7菌的发酵产物，经粗分离获得粗提物(发酵液经100℃热处理15min，低温高速离心后去沉淀的上清液。下同)，经考马氏蓝反应为阳性，表明其为蛋白质；然后经葡聚糖凝胶过滤、阳离子交换或阴离子交换层析，快速或高效液相色谱反相层析等方法分别得到不同的抗菌活性组分。其分离纯化路线见图3。
如图所示，抗革兰氏阴性菌的活性组分为多粘菌素E1及其系列组分，已在此前分离鉴定；抗真菌的活性组分也通过基因克隆的方法初步确定其为β-1，3-1，4-葡聚糖酶；而Cpacin为本课题组最近分离的抗革兰氏阳性菌的活性组分。图4为分离的效果。各活性组分的抗菌效果如图5如示，图5中的D，是抗真菌(出芽短梗霉)的抑菌圈，其抑菌圈有18～20mm，E的抗G+菌的抑菌圈为16～18mm，F的抗G-菌的抑菌圈为8～10mm(用凝胶孔穴扩散法，孔的直径2.7mm，加液量为5.5mL)，用Hulmark(1980)对抗菌肽活性的检测方法，其活性分别达到40000U/mL、30000U/mL、7000U/mL。
实施例4.“Cpacin”的活性鉴定
琼脂平板孔穴扩散法：用接种环从E.coli K12D31菌种平板培养基上挑取单菌落于加有3mL LB液体培养基的试管中，37℃、250r/min振荡培养过夜，吸取10～50μL转接于3～5mL新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养3～5h，测OD值，用灭菌水稀释为OD550＝0.001～0.01(此时菌液的浓度应为105～106细胞/mL)。吸取此稀释液10～20μL于有刻度的灭菌试管中，加入10mL经溶解并冷却至45～50℃的LB固体培养基，迅速倒入直径9cm的培养皿中，注意转摇和充分振荡培养皿，使菌体均匀分散，凝固后用直径2.7mm的真空打孔器打孔，每孔加入5.5μL待测液，37℃倒置培养过夜，测量抑菌圈直径。真菌培养基改为PDA，菌种为培养4天以后取分生孢子加入培养基倒平板，其余同细菌。
实施例5.“Cpacin”的鉴定
反相-高效液相色谱(RP-HPLC)分离Cpacin的效果如图6。上述组分送国家生物医学分析中心测定该抗菌肽的分子量和氨基酸序列，结果如图7、图8。根据测定结果，Cpacin的分子量为2510Da；氨基酸序列为：LLLAQPTAAVRGRCQVQRYLLAA。经国家生物医学分析中心检索和分析，以及本课题组的初步检索，该抗菌肽尚未见报道。
实施例6.“Cpacin”化学性质的初步研究
样品在中山大学化工学院经圆二色谱分析，结果如图9。根据检测结果，经相关软件分析，其结果如下：
Ratio
Helix： 0.0％
Beta： 74.5％
Turn： 0.0％
Random： 25.5％
Total： 100.0％
RMS： 146.337
从上述结果初步分析，Cpacin在溶液中没有α-螺旋，主要为β-折叠，没有转角，部分表现为无规卷曲。与多肽族里天蚕素类有螺旋-铰链-螺旋的结果明显不同。对其结构，还有待进一步深入研究。
Cpacin的热稳定性：Cpacin样品分别于恒温水浴锅中按下列条件处理，60℃20min；70℃20min；80℃10min，20min；90℃10min，20min；100℃10min，20min。结果如图10。
上述结果表明，Cpacin对热不敏感，当100℃加热20min时，其抗菌活性几乎不受影响。
实施例7.“Cpacin”抗革兰氏阳性菌谱的初步测定
Cpacin对部分革兰氏阳性菌的活性作用见表3。
表3  Cpacin抗革兰氏阳性菌的效果
  菌株名称     抑菌圈直径(mm)
  杀螟杆菌     12.5±0.2
  苏云金杆菌     10.0±0.2
  金黄色葡萄球菌     9.0±0.1
  金黄葡萄球菌标准株     11.0±0.1
  黑胸败血菌     9.0±0.1
  枯草杆菌     5.0±0.2
由上述结果可知，在所测试的6个菌株中，除了枯草杆菌的抑菌效果相对低一些以外，其余均表现出显著的抗革兰氏阳性菌作用。
鉴于人类对抗生素的耐药性日益严重，迫切寻找或补充新的替代品。本课题组所分离的CP7菌能产生抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的抗菌蛋白，其中抗革兰氏阳性菌的Cpacin属于新发现的抗菌多肽。该菌培养容易，经优化的培养基成本低，代谢产物抗菌活性高。除有希望开发为医药以外，还可以开发为饲料添加剂，替代抗生素用于家畜、家禽和水产养殖的疾病预防，以及植物的病害防治。

Claims (5)

1.一种杀菌肽，其特征在于，氨基酸序列为：LLLAQPTAAVRGRCQVQRYLLAA。
2.一种可产生权利要求1所述杀菌肽的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。
3.如权利要求2所述的多粘类芽孢杆菌，其为CP7菌株，保藏号为CCTCC NO：M 205119。
4.一种用于CP7菌株发酵的培养基，其特征在于，100mL该培养基含有如下配比的成分：花生饼粉10g，可溶性淀粉0.67g，MgSO4·7H2O 0.15g，K2HPO4·3H2O 0.1076g；自然pH值。
5.权利要求1所述的杀菌肽在抗革兰氏阳性菌药物制备中的应用。
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