CN106497820B - 抗生链霉菌fy57及其在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗生链霉菌及其在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用，所述的抗生链霉菌FY57(Streptomyces antibioticus FY57)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC M.12560。本发明方法具有成本低、操作简单、稳定性好、环境友好等特点，所产胰蛋白酶抑制剂具有酸碱稳定性、热稳定性和储藏稳定性好及活力高等特点。

Description

抗生链霉菌FY57及其在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种胰蛋白酶抑制剂，特别涉及一种利用海洋源抗生链霉菌制备产胰蛋白酶抑制剂的方法。
(二)背景技术
胰蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶，是人体消化系统必不可少的成分。胰腺分泌的胰蛋白酶原进入小肠，在肠激酶作用下水解形成胰蛋白酶，降解蛋白质生成小分子肽类和氨基酸，提供人体必需的营养。但是，当胰蛋白酶原在胰腺内被激活，会自行裂解胰腺导致胰腺炎的产生，造成不可逆转的组织损伤。胰蛋白酶除了分泌于胰腺中，还少量存在于皮肤、肾脏、肝脏、大脑和免疫系统细胞中。胰蛋白酶参与人体各种生理和病理过程，活性水平异常会导致各种疾病。
胰蛋白酶抑制剂可以与胰蛋白酶发生结合反应，从而调控酶的活性。目前，已知的胰蛋白酶抑制剂主要从大豆、动物内脏等动植物中提取获得，如：抑肽酶、乌司他丁等，它们具有广泛的生物学活性，对急性胰腺炎、肺气肿、出血性和败血性休克等疾病有独特的疗效。动植物源胰蛋白酶抑制剂虽已应用于临床，并取得了良好的医疗效果，但存在诸多不足。首先，动植物源胰蛋白酶抑制剂原料受限；其次，动植物源胰蛋白酶抑制剂主要是分子量较大的蛋白质，生物活性往往不稳定，易受多种理化因素的作用而失活，如凝聚、降解、消旋化等，而且不耐酸碱、不耐高温；另外，作为蛋白类药物，其进入人体后易产生首过消除效应，药效降低，给药方式局限于静脉、皮下注射，易产生免疫反应，危及患者的生命健康。
微生物具繁殖速度快、产活性物质能力强及种类多、生产成本低等多种优势，微生物活性代谢产物已成为当前药物开发的丰富资源，从微生物中开发胰蛋白酶抑制剂，具有重要的社会意义和经济价值。海洋微生物作为一个巨大的尚待开发的资源越来越受到关注，已成为一个新的研究热点。海洋面积占地球面积的70％以上，且海洋生境为一封闭、高压、高盐和低温的特殊环境，这赋予海洋微生物产生结构新颖和作用独特代谢产物的能力。因此，海洋微生物已成为胰蛋白酶抑制剂开发的新资源。
(三)发明内容
本发明目的是从海洋生境中筛选获得产胰蛋白酶抑制剂的新菌株—抗生链霉菌FY57，以及提供一种利用抗生链霉菌FY57制备胰蛋白酶抑制剂的方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株--抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)FY57，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.12560，保藏日期为2016年5月30日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
本发明还提供一种所述的抗生链霉菌FY57在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用，所述抑制剂源自抗生链霉菌FY57经发酵培养获得的发酵液离心后获得的上清液。
进一步，所述的抗生链霉菌FY57在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用为：以抗生链霉菌FY57发酵培养获得的发酵上清液为抑制剂，以胰蛋白酶为作用目标酶，25～50℃，pH6～9，反应5～30min，进行抑制反应；再加入Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐(BAPNA)，25～50℃，pH6～9，反应5～60min，在410nm下测定BAPNA降解所释放出对硝基苯胺的吸光值，测定抑制率。抑制剂活性越高，抑制率越高，对硝基苯胺的量越低，410nm下的吸光值越低。
所述的胰蛋白酶为牛胰蛋白酶、兔胰蛋白酶、猪胰蛋白酶、鼠胰蛋白酶、猴胰蛋白酶、鸡胰蛋白酶、马胰蛋白酶或犬胰蛋白酶，优选牛胰蛋白酶。
所述抑制剂为抗生链霉菌FY57发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心弃去沉淀后获得的上清液，所述抗生链霉菌FY57发酵液中湿菌体浓度为10～50mg/L，所述胰蛋白酶浓度为20～200μg/mL，所述上清液用量以含湿菌体发酵液中湿菌体质量计为0.05～2.5mg湿菌体/mg胰蛋白酶，所述含湿菌体发酵液是指离心前的含湿菌体发酵液。
所述的发酵上清液按如下步骤制备：(1)斜面培养：将抗生链霉菌FY57接种于斜面培养基，20～37℃培养3～5d，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：可溶性淀粉5～30g/L，K2HPO4 0.01～0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，FeSO4·7H2O 0.005～0.02g/L，海盐10～35g/L，琼脂15～30g/L，溶剂为水，pH6～9；优选所述斜面培养基终浓度组成为：可溶性淀粉10g/L，K2HPO4 0.02g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，海盐25g/L，琼脂25g/L，溶剂为水，pH7.5；(2)种子培养：从斜面菌体挑取1～3接种环菌种接种至种子培养基，20～37℃培养5～7d(25℃，200rpm转速下培养5d)，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：可溶性淀粉5～30g/L，K2HPO4 0.01～0.05g/L，MgSO4·7H2O0.01～0.05g/L，FeSO4·7H2O 0.005～0.02g/L，海盐10～35g/L，溶剂为水，pH6～9；优选所述种子培养基终浓度组成为：可溶性淀粉10g/L，K2HPO4 0.02g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，海盐25g/L，溶剂为水，pH7.5；(3)发酵培养：将种子液以体积浓度1～10％(优选2％)的接种量接种至发酵培养基，20～37℃培养5～9d(优选25℃，200rpm转速下培养7d)，获得发酵液；将发酵液经8000～12000rpm，离心5～30min后(优选8000rpm，离心10min)，弃去沉淀，收集上清液；所述发酵培养基终浓度组成为：可溶性淀粉5～30g/L，葡萄糖2～20g/L，胰蛋白胨2～20g/L，酵母粉2～20g/L，海盐10～35g/L，CaCO3 0.5～5g/L，K2HPO4 0.1～1g/L，(NH4)2SO4 0.1～1g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.1g/L，溶剂为水，pH6～8；优选所述发酵培养基终浓度组成为：可溶性淀粉10g/L，葡萄糖5g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，海盐25g/L，CaCO3 1g/L，K2HPO4 0.5g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，溶剂为水，pH7.5。
更进一步，所述的抗生链霉菌FY57在产胰蛋白酶抑制剂中的应用为：以抗生链霉菌FY57发酵培养获得的发酵上清液为抑制剂源，以牛胰蛋白酶为作用目标酶，37℃，pH8，反应10min，再用Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐法即BAPNA法测定抑制率。
本发明还涉及所述抗生链霉菌FY57发酵培养获得的上清液在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用。
所述的BAPNA法测定抑制率为：实验共设三组，分别是样品组(100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液+100μL菌株FY57的发酵上清液)、阴性对照(100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液+100μL pH8的Tris-HCl缓冲液)和样品对照组(100μL菌株FY57发酵上清液)；三组实验均在37℃下反应10min，再加入250μL BAPNA后，在37℃下反应20min；然后加入100～300μL30％醋酸终止反应，在25～37℃下保温10～60min；样品对照组加入100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液；所有实验组均在8000～12000rpm下离心5～30min，取上清；上清稀释2～5倍，测定410nm下对硝基苯胺吸光值。
胰蛋白酶抑制率的计算：以胰蛋白酶水解BAPNA产生对硝基苯胺的吸光值代表胰蛋白酶的活性，样品对胰蛋白酶的抑制率通过以下公式计算获得：
所述的BAPNA法测定菌株FY57发酵上清液对胰蛋白酶抑制率为90％左右。
本发明中菌株FY57所产生的胰蛋白酶抑制剂是被分泌到细胞外的，因此，抗生链霉菌FY57发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心后去除菌体，获得的上清液中含有抑制剂，即抑制剂源。所以本发明中以抗生链霉菌FY57发酵液离心后获得的上清液而不是湿菌体来进行抑制反应。所述上清液的用量以离心前含湿菌体发酵液中湿菌体的质量来计。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株新的产胰蛋白酶抑制剂的微生物菌种——抗生链霉菌FY57，利用该菌种生产胰蛋白酶抑制剂的方法具有成本低、操作简单、稳定性好(传代4次的抑制率保持在80％以上)、环境友好等特点，所产胰蛋白酶抑制剂不但酸碱稳定性(能耐受2～13的pH)和热稳定性好(能耐受100℃高温)，而且其储藏稳定性好(25℃下保藏20天仍保持50％左右抑制率)及活力高(稀释度达55倍左右)，这些特点赋予抗生链霉菌FY57所产胰蛋白酶抑制剂在医药领域具有广阔的应用前景。
(四)附图说明
图1为菌株FY57发酵液抑制牛胰蛋白酶水解酪蛋白的示意图；
图2为抗生链霉菌FY57的系统发育树；
图3为pH对菌株FY57发酵液对牛胰蛋白酶的抑制率影响；
图4为温度对菌株FY57发酵液对牛胰蛋白酶的抑制率影响；
图5为煮沸对菌株FY57发酵液对牛胰蛋白酶的抑制率影响；
图6为保藏条件对菌株FY57发酵液对牛胰蛋白酶的抑制率影响；
图7为稀释倍数对菌株FY57发酵液对牛胰蛋白酶的抑制率影响。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1:抗生链霉菌FY57菌种的筛选与鉴定
(1)菌种筛选
①菌种来源：从厦门鼓浪屿(24.45°N，118.07°E)的海泥中分离筛选获得；
②菌种分离筛选：从厦门鼓浪屿海域(24.45°N，118.07°E)海平面50cm以下收集海泥，置于无菌的样品瓶中带至实验室，然后称取10g海泥样品，加入到90mL的无菌海水中，混匀后即是浓度为10-1的样品，然后按常规方法分别梯度稀释成浓度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的样品；分别取不同浓度的样品100μL涂布于海洋高氏固体培养基(终浓度组成为：可溶性淀粉10g/L，K2HPO4 0.02g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，海盐25g/L，琼脂25g/L，溶剂为水，pH7.5)平板上，于25℃下培养4d，获得单菌落；然后将初筛获得的单菌落在海洋高氏固体培养基平板上进行两次划线复筛；再将复筛后获得的单菌落(编号见表1)分别接种于50mL的海洋高氏液体培养基(终浓度组成为：可溶性淀粉10g/L，K2HPO40.02g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，海盐25g/L，溶剂为水，pH7.5)中，于25℃、200rpm转速下摇床培养4d，8000rpm离心5min收集发酵液上清，测定胰蛋白酶活性，筛得胰蛋白酶抑制剂产生菌。
③酪蛋白平板法筛选胰蛋白酶抑制剂产生菌
酪蛋白平板的制备(质量组成)：1％的酪蛋白，2％的琼脂，加入pH8.0磷酸钾缓冲溶液中，加热煮沸，边搅拌边加热防止酪蛋白焦化。煮沸后，用玻璃棒将溶液上层的气泡去除干净，倒入平皿中(每个平板倒入体积为25mL)，静置，冷却凝固。用打孔器对称地在平板上打4个直径6mm的孔，用火焰固定。
产生菌所产胰蛋白酶抑制剂的活性测定(BAPNA法)：100μg/mL牛胰蛋白酶溶液(溶剂为无菌水)和pH8.0磷酸钾缓冲溶液预先放到37℃水浴5min，待用。将200μL牛胰蛋白酶溶液和200μL菌株发酵上清液混合(以200μL牛胰蛋白酶溶液和200μL pH8.0磷酸钾缓冲溶液的混合液为阴性对照)加入酪蛋白平板的孔中，37℃下放置12h。在酪蛋白平板上加100μL三氯乙酸，涂布均匀，酪蛋白变性呈乳白色，牛胰蛋白酶的水解圈则是透明的，用尺子测量水解圈的直径。总共测定三批发酵液，每批三组平行。
胰蛋白酶抑制率的计算：胰蛋白酶抑制剂将导致胰蛋白酶水解酪蛋白的体积减少(水解圈变小)，抑制率通过以下公式计算获得：
其中R1为阴性对照水解圈的半径/mm；R2为样品水解圈的半径/mm；H为酪蛋白平板的高度/mm；
发现17株菌的发酵上清液能够抑制牛胰蛋白酶水解酪蛋白，导致水解圈减小(比阴性对照小)(表1)，其中，菌株FY57对牛胰蛋白酶的抑制率最高，详见表1和图1。
表1酪蛋白平板法筛选的菌株胰蛋白酶抑制率
(2)菌种FY57的鉴定
①菌种FY57的分子鉴定
基因组DNA的提取：取菌液1.5mL，移入1.5mL EP管中，12000rpm，4℃离心1min，弃上清。向沉淀中加入125μL浓度为0.5M EDTA(pH8.0)，1μL RNaseA(10mg/mL)，20μL溶菌酶(10mg/mL)，剧烈震荡，37℃水浴30min。加70μL 10％SDS，5μL 10mg/mL蛋白酶K，振荡摇匀，将EP管置于37℃水浴5min，然后55℃水浴30min。加70μL 5M NaCl，摇匀，冰浴30min。12000r/min、4℃离心20min。取上清，补水至500μL，加入一倍体积的Tris饱和酚，上下混匀，12000r/min、4℃离心10min。取上清，加两倍体积的无水乙醇，-20℃下放置10min。12000r/min、4℃离心10min，弃上清。用体积浓度75％的乙醇水溶液清洗一遍，晾干后加入50μLddH2O，冰箱备用。
16S rRNA基因扩增和测序：配制50μL的PCR反应混合液，内含：37μL无菌水，5μL 10×Taq DNA聚合酶缓冲液，4μL浓度为2.5mM的dNTPs，100nM上游引物27F(5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，100nM下游引物1492R(5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，1ng菌株FY57基因组DNA和1U Taq DNA聚合酶。然后将反应混合液置于PCR仪上扩增菌株FY57的16S rDNA，扩增程序为：94℃变性5min，然后是30个循环，每个循环包括94℃变性1min，55℃退火50s，72℃延伸90s，循环结束后，72℃再延伸10min，然后保存在4℃下。扩增结束后，用浓度为1.0％琼脂糖凝胶电泳确证PCR产物大小后，送生工生物工程(上海)有限公司进行DNA测序。16S rRNA基因序列(SEQ ID NO.1)为：CTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATCACTCTTGCAGGCATCTGTGAGGGTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGGCCAGAGATGGTCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGTCCTTCGGGATGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGCAGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGG。
将菌株FY57的16S rDNA序列在NCBI网站上进行同源性比对，再用MEGA6.0软件绘制系统发育树，结果如图2所示，发现菌株FY57与链霉菌属中的一些菌相似性较高，尤其是与两株抗生链霉菌Streptomyces antibioticus strain NBRC 12838和Streptomycesantibioticus strain 1022-257的亲缘关系最近，16S rRNA基因的相似性为100％，因此，基本可以确定菌株FY57是一株抗生链霉菌。
②菌种FY57的形态特征和生理生化特征
根据《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology》(伯杰氏系统细菌学手册)中对抗生链霉菌鉴定要求和鉴定方法，分别测定菌株FY57的形态特征和生理生化特性，结果如下：
菌株FY57的菌丝体呈簇状生长，孢子为椭圆形或杆状，表面光滑，孢子链长而直；营养菌丝体为肉色，气生菌丝体为白色，孢子培养短时间后显示灰色带白斑，培养7d以后，孢子的颜色由灰色转变为黄棕色略带粉紫色。菌株FY57可水解明胶，明胶一开始液化非常慢，5d后速度变快并产生黑色素；可以胨化牛奶变透明，还可产生酪氨酸酶和H2S。菌株FY57可利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、鼠李糖、肌醇、D-甘露醇和D-木糖，不利用蔗糖和棉子糖，能水解淀粉和纤维素。以上所有的菌落形态特征和生理生化特性与《Bergey'sManual of Systematic Bacteriology》中对抗生链霉菌的描述是一致的。
综上，将菌株FY57被命名为抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)FY57。
实施例2胰蛋白酶抑制剂
(1)斜面培养：将抗生链霉菌FY57接种于斜面培养基，25℃培养5d，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：可溶性淀粉10g/L，K2HPO40.02g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，海盐25g/L，琼脂25g/L，溶剂为水，pH7.5；
(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌株接种至种子培养基，25℃，200rpm转速下培养5d，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成为：可溶性淀粉10g/L，K2HPO4 0.02g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，海盐25g/L，溶剂为水，pH7.5；
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度2％的接种量接种至发酵培养基，25℃，200rpm转速下培养7d，获得发酵液；将发酵液经8000rpm，离心10min后，弃去沉淀，收集上清液，获得所述胰蛋白酶抑制剂；所述发酵培养基终浓度组成为：可溶性淀粉10g/L，葡萄糖5g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，海盐25g/L，CaCO3 1g/L，K2HPO4 0.5g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，溶剂为水，pH7.5。
实施例3:BAPNA法测定抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率
将实施例2制备发酵上清液共设三组测定抑制率，分别是样品组(100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液+100μL菌株FY57发酵上清液)、阴性对照(100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液+100μL pH8的Tris-HCl缓冲液)和样品对照组(100μL菌株FY57发酵上清液)；三组实验均在37℃下反应10min，再加入250μL BAPNA后，在37℃下反应20min；然后加入100μL体积浓度30％醋酸水溶液终止反应，在37℃下保温10min；样品对照组加入100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液；所有实验组均在10000rpm下离心10min，取上清；上清用无菌水稀释3倍，测定410nm下对硝基苯胺吸光值。
胰蛋白酶抑制率的计算：以胰蛋白酶水解BAPNA产生对硝基苯胺的吸光值代表胰蛋白酶的活性，样品中抑制剂对胰蛋白酶的抑制率通过以下公式计算获得：
测得菌株FY57发酵上清液对胰蛋白酶抑制率为89.5％。
实施例4：菌株FY57产胰蛋白酶抑制剂的遗传稳定性
将菌株FY57在海洋高氏固体培养基(终浓度组成：可溶性淀粉10g/L，K2HPO40.02g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，海盐25g/L，琼脂25g/L，溶剂为水，pH7.5；)平板上连续传代4次，每次传代后均按实施例2所述方法制备菌株FY57发酵上清液，再按实施例3所述的BAPNA法测定抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率，结果显示，从第一代到第四代菌株FY57所产胰蛋白酶抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率分别为88.4％、89.5％、90.5％和89.3％，总体一直维持在90％左右，比较稳定。
实施例5：菌株FY57的胰蛋白酶抑制剂的酸碱稳定性
取12支50mL的离心管，分别加入按实施例2所制备的菌株FY57发酵上清液10mL，分别用1M NaOH和1M HCl调节pH至2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13，以原发酵液pH8为参照，室温放置6h后，再用NaOH和HCl调回原发酵液的pH8，按实施例3所述的BAPNA法测定抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率，结果见图3。从图3可见，随着pH从2上升至7，菌株FY57发酵上清液对胰蛋白酶抑制率随之增加；pH从7上升至13，菌株FY57发酵上清液对胰蛋白酶抑制率随之减小，可见，菌株FY57发酵上清液中胰蛋白酶抑制剂的最佳pH为7.0，抑制率高达98.9％；另外，在pH为2.0(强酸)和pH为13.0(强碱)条件下，抑制剂均保持一定的活性，抑制率为30％左右。综上可见，菌株FY57所产胰蛋白酶抑制剂具有较强的耐酸、耐碱能力。
实施例6：菌株FY57的胰蛋白酶抑制剂的热稳定性
(1)取7支1.5mL的离心管，分别加入按实施例2所制备的菌株FY57发酵上清液1mL，然后在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中恒温处理30min，接着再放至室温(25℃)下30min，待恢复到原发酵液的温度(25℃)后，按实施例3所述的BAPNA法测定抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率，结果见图4。从图4可见，当处理温度维持在70℃以下，抑制剂的活性比较稳定，对牛胰蛋白酶的抑制率保持在80％以上；当处理温度升高至80℃以及90℃，抑制剂活性有所下降，但抑制率仍保持在50％左右；当处理温度升至100℃并处理30min，抑制活性基本丧失。
(2)取7支1.5mL的离心管，分别加入按实施例2所制备的菌株FY57发酵上清液1mL，然后在100℃水浴中恒温处理0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min，接着再放至室温(25℃)下30min，待恢复到原发酵液的温度(25℃)后，按实施例3所述的BAPNA法测定菌株FY57发酵上清液中抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率，结果见图5。从图5可见，整体上，随着煮沸时间的延长，抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率随之降低；当处理时间在10min以内，抑制率保持在60％左右；当处理时间在25min以内，抑制率仍然维持在30％左右。
综上可见，菌株FY57所产胰蛋白酶抑制剂具有极强的耐高温能力。
实施例7：菌株FY57的胰蛋白酶抑制剂的储藏稳定性
将按实施例2所制备的菌株FY57发酵上清液分别在-20℃、4℃、25℃和50℃下保存，每隔一段时间取样，按实施例3所述的BAPNA法测定抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率，结果见图6。从图6可见，菌株FY57发酵上清液中抑制剂的最佳储存温度为-20℃，保存1个月内抑制剂活性基本没有变化；储存温度上升至4℃，1个月内抑制剂活性也基本没有变化；当储存温度继续上升至25℃，保存20天，菌株FY57发酵上清液中抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率仍然保持在50％左右；当储存温度继续上升至50℃，抑制剂活性下降比较快。综上可见，菌株FY57所产胰蛋白酶抑制剂具有较好的储藏稳定性。储藏温度的上升有助于细菌滋生，从而降解抑制剂。对菌株FY57发酵液中抑制剂的分离纯化有望进一步提高抑制剂的储藏稳定性。
实施例8：稀释倍数对菌株FY57的胰蛋白酶抑制剂的抑制率影响
将按实施例2所制备的菌株FY57发酵上清液用pH8.0磷酸钾缓冲液(pH与发酵液一致)分别稀释5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍和55倍，按实施例3所述的BAPNA法测定抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率，结果见图7。从图7可见，整体上，随着稀释倍数的上升，菌株FY57发酵液中抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率逐渐下降；当稀释倍数为55时，抑制率接近为0，所以菌株FY57发酵液中抑制剂的最大稀释倍数为55左右。由于测定的是未经分离纯化的发酵液的最大稀释倍数，菌株FY57所产抑制剂的实际最大稀释倍数有望远高于55。综上可见，该胰蛋白酶抑制剂的效价是比较高的。

Claims (6)

1.抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)FY57，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.12560，保藏日期为2016年5月30日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
2.一种权利要求1所述抗生链霉菌FY57在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用。
3.如权利要求2所述抗生链霉菌FY57在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用，其特征在于所述抑制剂源自抗生链霉菌FY57经发酵培养获得的发酵液离心后的上清液。
4.如权利要求3所述抗生链霉菌FY57在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用，其特征在于所述胰蛋白酶为牛胰蛋白酶。
5.如权利要求3所述抗生链霉菌FY57在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用，其特征在于所述上清液按如下步骤制备：(1)斜面培养：将抗生链霉菌FY57接种于斜面培养基，20～37℃培养3～5d，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：可溶性淀粉5～30g/L，K2HPO40.01～0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，FeSO4·7H2O 0.005～0.02g/L，海盐10～35g/L，琼脂15～30g/L，溶剂为水，pH6～9；(2)种子培养：从斜面菌体挑取1～3接种环菌种接种至种子培养基，20～37℃培养5～7d，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：可溶性淀粉5～30g/L，K2HPO4 0.01～0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，FeSO4·7H2O 0.005～0.02g/L，海盐10～35g/L，溶剂为水，pH6～9；(3)发酵培养：将种子液以体积浓度1～10％的接种量接种至发酵培养基，20～37℃培养5～9d，获得发酵液，将发酵液经8000～12000rpm，离心5～30min后，弃去沉淀，收集上清液；所述发酵培养基终浓度组成为：可溶性淀粉5～30g/L，葡萄糖2～20g/L，胰蛋白胨2～20g/L，酵母粉2～20g/L，海盐10～35g/L，CaCO30.5～5g/L，K2HPO4 0.1～1g/L，(NH4)2SO4 0.1～1g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.1g/L，溶剂为水，pH6～8。
6.一种权利要求1所述抗生链霉菌FY57发酵培养获得的上清液在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用。
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