CN102952756A

CN102952756A - 一株海洋真菌链格孢属mnp801及其应用

Info

Publication number: CN102952756A
Application number: CN2012103019227A
Authority: CN
Inventors: 王鸿; 陈俊; 谢燕瑾
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2012-08-23
Filing date: 2012-08-23
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2032-08-23
Also published as: CN102952756B

Abstract

本发明提供了一株具有抗肿瘤和酶抑制活性的海洋真菌——链格孢属（Alternaria sp.）MNP801及其应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC No:M2012288，保藏日期2012年7月18日。本发明的有益效果主要体现在，提供了一株具有抗肿瘤和酶抑制活性的海洋真菌，具有抗HepG-2肿瘤细胞和PC12肿瘤细胞作用，同时具有胰蛋白酶抑制活性。

Description

一株海洋真菌链格孢属MNP801及其应用

（一）技术领域

本发明涉及一株海洋真菌——链格孢属（Alternaria sp.）MNP801，及其在制备抗肿瘤药物和胰蛋白酶抑制剂中的应用。

（二）背景技术

寻找生理活性强的物质发展成为抗癌、抗菌、抗氧化等药物是人类攻克疾病的主要工作之一。海洋环境苛刻，具有低温、低照、高盐、高压和寡营养等特点，海洋微生物由于栖息于这样的极限环境下,产生了与陆地生物完全不同的代谢系统和机体防御系统，所以能产生许多结构新颖、活性特异的次级代谢产物，研究发现它们许多成分也具有抗癌，抗菌等药用价值，并且许多特异的化学结构类型是在陆地微生物中难以发现的。

细胞培养法是筛选抗肿瘤药物比较常用的一种筛选方法，常用的有MTT法等。

（三）发明内容

本发明目的是提供一株具有抗肿瘤和酶抑制活性的海洋真菌——链格孢属（Alternaria sp.）MNP801及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一株海洋真菌——链格孢属（Alternaria sp.）MNP801，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC No:M2012288，保藏日期2012年7月18日。

本发明还涉及所述的链格孢属MNP801在制备抗肿瘤药物中的应用，具体为所述链格孢属MNP801提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述抗肿瘤药物具体可为治疗肝癌或神经癌的药物。

所述的链格孢属MNP801在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用，具体为所述链格孢属MNP801提取物在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用。

优选的，所述提取物为乙酸乙酯提取物，由如下方法制得：将链格孢属MNP801接种至液体发酵培养基中，于25~35℃、150~210r/min振荡条件下培养14~30d，得到发酵液，将发酵液经细胞破碎后，离心取滤液用乙酸乙酯萃取，浓缩得浸膏（密度为1.2~1.7g/ml），即为所述链格孢属MNP801的乙酸乙酯提取物；所述发酵培养基组成为：麦芽浸粉3.0~7.0g/L，麦芽糖1.5~2.0g/L，葡萄糖3.0~7.0g/L，酵母浸粉0.8~1.5g/L，溶剂为水。

具体的，所述乙酸乙酯提取物可按如下方法获得：

a.海洋真菌MNP801的种子培养：

挑取海洋真菌MNP801菌株接入种子培养基，于25-35℃、150-210r/min培养48h，得到种子液；种子培养基组成如下：麦芽浸粉3.0~7.0g/L,麦芽糖1.5~2.0g/L，葡萄糖3.0~7.0g/L，酵母浸粉0.8~1.5g/L，溶剂为水；

b.海洋真菌MNP801的发酵培养：

将上述种子液接入发酵培养基，于25~35℃、150~210r/min培养21d，得到发酵液；发酵培养基组成如下：麦芽浸粉3.0~7.0g/L,麦芽糖1.5~2.0g/L，葡萄糖3.0~7.0g/L，酵母浸粉0.8~1.5g/L，溶剂为水；

c.将上述培养好的发酵液超声破碎；

d.将上述破碎好的发酵液过滤除去菌体；

e.将上述过滤好的发酵液（滤液），用乙酸乙酯萃取，浓缩挥干制的浸膏（1）；

f.将上述菌体冷冻干燥，甲醇浸泡后，过滤除去菌体，滤液浓缩挥干，加入水成水溶液，用乙酸乙酯萃取，浓缩挥干制的浸膏（2）；

g.将上述浸膏（1），浸膏（2）合并，即得到发酵液的提取物。

经实验验证，本发明海洋真菌MNP801的乙酸乙酯提取物胰蛋白酶抑制活性IC₅₀（ug/ml）为301.56；对PC12肿瘤细胞的半抑制率浓度IC₅₀（ug/ml）为92.97，对HepG-2肿瘤细胞的半抑制率浓度IC₅₀（ug/ml）为88.81。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一株具有抗肿瘤和酶抑制活性的海洋真菌，具有抗HepG-2肿瘤细胞（肝癌细胞）和PC12肿瘤细胞（神经癌细胞）作用，同时具有胰蛋白酶抑制活性，为新药研发提供了基础。

（四）附图说明

图1为平板培养基上海洋真菌MNP801的菌落形态；

图2为光学显微镜下海洋真菌MNP801的菌体形态。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

（1）海洋真菌MNP801的种子培养：

挑取海洋真菌MNP801菌株（CCTCC No:M2012288）接入种子培养基，于28℃、200r/min培养48h，得到种子液；种子培养基组成如下：麦芽浸粉6.0g/L,麦芽糖1.8g/L，葡萄糖6.0g/L，酵母浸粉1.2g/L，溶剂为水；

（2）海洋真菌MNP801的发酵培养：

将上述种子液以10%体积比接入发酵培养基，于28℃、200r/min培养21d，得到发酵液；发酵培养基组成如下：麦芽浸粉6.0g/L，麦芽糖1.8g/L，葡萄糖6.0g/L，酵母浸粉1.2g/L，溶剂为水；

（3）有效成分提取：

将上述培养好的发酵液于细胞破碎仪下超声破碎，然后过滤除去菌体，取滤液用等体积乙酸乙酯萃取，浓缩挥干制得浸膏1（密度约为1.5g/ml）

将上述菌体冷冻干燥，甲醇浸泡后，过滤除去菌体，滤液浓缩挥干，加入水成水溶液，用乙酸乙酯萃取，浓缩挥干制的浸膏2（密度约为1.5g/ml）；

g.将上述浸膏1，浸膏2合并，即得到发酵液的乙酸乙酯提取物。实施例2：海洋真菌提取物的酶抑制，抗肿瘤活性试验

1.胰蛋白酶抑制活性测试

（1）胰蛋白酶抑制活性测试所需试剂的配制

配制1000ml0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液（三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液）：加入6.057g三羟甲基氨基甲烷、0.1mol/L的盐酸385ml及1.1099g CaCl₂于蒸馏水中，并定容至1L。

配制25ml2mM底物BAPNA（Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐）：称取底物BAPNA0.0217g于容量瓶中，使用0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液将其定容至25ml。

配制50ml2mg·mL^-1的胰蛋白酶：称取胰蛋白酶0.1g于50ml容量瓶中，使用0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液将其定容至50ml。

最后配制30%（v/v）乙酸用于停止反应。

（2）胰蛋白酶抑制活性法测定活性

将样品提取物配成100μg·mL^-1、50μg·mL^-1、25μg·mL^-1、12.5μg·mL^-1、6.25μg·mL^-1等5个不同的浓度，于96孔板中加入待测样品50μL（Tris缓冲液溶解），用等体积的缓冲液作为对照组，然后在样品组和对照组中加入预先于37℃水浴孵化10min的2mg·mL^-1胰蛋白酶50μL和2mM底物BAPNA100μL，37℃保温反应30min后，再加入30%乙酸50μL终止反应；空白组则在乙酸终止反应之后，再加入底物BAPNA，其余操作同上，酶标仪405nm下检测OD。

按下式计算抑制率：

抑制率(%)==[1－(样品组OD－空白组OD)/(对照组OD－空白组OD)]×100%

用SPSS软件测得海洋真菌MNP801的提取物胰蛋白酶抑制活性IC₅₀（ug/ml）为301.53ug/ml。

2.体外抗肿瘤活性测试

采用Hepg2，PC12两种肿瘤细胞系，进行MTT试验：

（1）取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，用含血清10%的RPM1640培养基，调节细胞浓度为2×10⁵个/ml，每孔100ul细胞悬液的量加入至96孔细胞培养板，在饱和温度37℃、5%CO₂培养箱中培养；

（2）12h后，吸弃培养基，对照组：加入100ul2%的RPM1640培养基；空白组：加入100ul2%的RPM1640培养基；给药组：加入不同浓度梯度，即50，100，200，400，800ug/ml的供试样品，各组均为5个复孔，继续培养48h；

（3）在实验结束前4h，每孔加入20ulMTT（四甲基偶氮唑盐，5mg/ml，用PBS缓冲液配制），继续在37℃、5%CO₂培养箱中培养4h；

（4）小心吸弃上清，每孔各加入150ul二甲基亚砜（DMSO），振荡，酶标仪490nm处测定OD值。

按下述公式计算抑制率：

用SPSS软件测得海洋真菌MNP801的提取物对PC12肿瘤细胞半抑制率浓度IC₅₀值为92.97ug/ml，提取物对HepG-2肿瘤细胞的半抑制率浓度IC₅₀值为88.81ug/ml。

Claims

1.一株海洋真菌——链格孢属（Alternaria sp.）MNP801，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC No:M2012288，保藏日期2012年7月18日。

2.如权利要求1所述的链格孢属MNP801在制备抗肿瘤药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抗肿瘤药物为治疗肝癌或神经癌的药物。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述链格孢属MNP801提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.如权利要求1所述的链格孢属MNP801在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述链格孢属MNP801提取物在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用。

7.如权利要求4或6所述的应用，其特征在于所述提取物为乙酸乙酯提取物，由如下方法制得：将链格孢属MNP801接种至液体发酵培养基中，于25~35℃、150~210r/min振荡条件下培养14~30d，得到发酵液，将发酵液经细胞破碎后，离心取滤液用乙酸乙酯萃取，浓缩得浸膏，即为所述链格孢属MNP801的乙酸乙酯提取物；所述发酵培养基组成为：麦芽浸粉3.0~7.0g/L，麦芽糖1.5~2.0g/L，葡萄糖3.0~7.0g/L，酵母浸粉0.8~1.5g/L，溶剂为水。