CN102161973A - 一种制备高三尖杉酯碱的方法及专用菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备高三尖杉酯碱的方法及专用菌株。该菌株为细极链格孢(Alternaria tenuissima)CH1307，其保藏编号为CGMCC No.4443。实验证明，本发明的菌株具有很高的产高三尖杉酯碱的能力。用本发明方法制备高三尖杉酯碱，具有产率高、操作简单、成本低廉的优点。因此，本发明方法解决了高三尖杉酯碱资源紧缺的问题，既保证了高三尖杉酯碱的高效生产，又避免了砍伐树木，保护了自然资源。

Description

一种制备高三尖杉酯碱的方法及专用菌株
技术领域
本发明涉及一种制备高三尖杉酯碱的方法及专用菌株。
背景技术
高三尖杉酯碱是从三尖杉科粗榧属植物中提取的具有多种抗肿瘤功效的四骈环生物碱类药物，属细胞周期特异性药物，对G1和G2期细胞杀伤作用最强，而对S期细胞作用较小。目前国内已批准临床应用，但未经FDA批准上市。海南粗榧的根、茎、叶和果实都含有高三尖杉酯碱，尤其树皮中高三尖杉酯碱含量较高，是生产此类抗癌药物的主要原料。但因其生长缓慢、繁殖困难以及过度采伐，资源几近枯竭。药源不足已成为限制高三尖杉酯碱在临床应用的瓶颈。
采用微生物发酵生产是降低成本、大量获取高三尖杉酯碱的理想方法。1993年Strobel等首次从短叶红豆杉(Taxus breviflia)的树皮中分离出能产生抗肿瘤化合物紫杉醇(Taxol)的内生真菌-安德鲁紫杉菌(Taxomyces andreanae)，这一发现掀起了从药用植物中分离内生菌的热潮。国内外学者纷纷展开了这方面的研究、分离新的可产抗肿瘤代谢产物的内生真菌、进行菌种选育和培养条件的优化。
高三尖杉酯碱的化学式：C29H39NO9，结构式如下：
发明内容
本发明的一个目的是提供一株细极链格孢菌。
本发明所提供的细极链格孢菌为细极链格孢(Alternaria tenuissima)CH1307，其保藏编号为CGMCC No.4443。
细极链格孢(Alternaria tenuissima)CH1307CGMCC No.4443在制备高三尖杉酯碱中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的最后一个目的是提供一种制备高三尖杉酯碱的方法。
本发明所提供的制备高三尖杉酯碱的方法，包括如下步骤：发酵细极链格孢(Alternaria tenuissima)CH1307 CGMCC No.4443，并向发酵体系中添加高三尖杉酯碱合成前体物质，进行生物合成，得到高三尖杉酯碱。
上述制备方法中，所述发酵的方法包括如下步骤：
(1)将细极链格孢(Alternaria tenuissima)CH1307 CGMCC No.4443接种于初始发酵培养基中，培养；
(2)在步骤(1)的基础上添加补充培养基I，培养；
(3)在步骤(2)的基础上添加补充培养基II，培养；
所述补充培养基I为葡萄糖水溶液和硝酸铵水溶液的等体积比混合液；所述葡萄糖水溶液的浓度为8％-12％或10％(质量百分含量)，所述硝酸铵水溶液的浓度为0.8％-1.2％或1％(质量百分含量)；
所述补充培养基II为葡萄糖水溶液和硝酸铵水溶液的等体积比混合液；所述葡萄糖水溶液的浓度为4％-8％或6％(质量百分含量)，所述硝酸铵水溶液的浓度为2％-6％或4％(质量百分含量)。
上述任一制备方法中，所述步骤(1)、(2)和(3)中，所述培养的温度为25℃-28℃，具体为25℃；
上述任一制备方法中，所述步骤(1)、(2)和(3)中，所述培养在转速为160-200r/min，旋转半径为250mm的条件下进行。
上述任一制备方法中，每1升所述初始发酵培养基按照如下方法配制：将马铃薯180g-220g或200g与水混合，煮沸15分钟-30分钟或30分钟，过滤，取滤液；向滤液中加入蔗糖20g-30g或25g、牛肉膏0.5g-1.5g或1g、蛋白胨0.5g-1.5g或1g、硝酸铵0.5g-1.5g或1g，用水定容至1000mL，得到所述发酵培养基；
上述任一制备方法中，所述步骤(1)中，所述培养的时间为3-5天，具体为4天；所述步骤(2)中，所述培养的时间为1-3天，具体为3天；所述步骤(3)中，所述培养的时间为6-10天，具体为8天。
上述任一制备方法中，所述向发酵体系中添加高三尖杉酯碱合成前体物质在所述步骤(2)结束后步骤(3)开始时进行。
上述任一制备方法中，所述高三尖杉酯碱合成前体物质为酪氨酸和苯丙氨酸。
上述任一制备方法中，所述补充培养基I与所述初始发酵培养基的体积比为10ml-30ml∶200ml-600ml，具体为10ml∶200ml；
上述任一制备方法中，所述补充培养基II与所述初始发酵培养基的体积比为10ml-30ml∶200ml-600ml，具体为10ml∶200ml；
上述任一制备方法中，所述酪氨酸和苯丙氨酸分别以其水溶液的形式添加；
上述任一制备方法中，所述酪氨酸水溶液的浓度为0.05mg/mL-0.15mg/mL或0.1mg/mL；所述酪氨酸水溶液与所述初始发酵培养基的配比为2ml-5mL∶200ml-500ml，具体为3mL∶200ml；
上述任一制备方法中，所述苯丙氨酸水溶液的浓度为0.05mg/mL-0.15mg/mL或0.1mg/mL，所述苯丙氨酸水溶液与所述初始发酵培养基的配比为1.5mL-3.5mL∶200mL-500ml，具体为2.79mL∶200ml。
上述任一制备方法中，在所述步骤(3)后，还包括如下提取步骤：
将发酵物进行分离，得到菌丝体和发酵液；分别从菌丝体和发酵液中提取得到高三尖杉酯碱；(将发酵容器内的所有物质记作发酵物)
从发酵液中提取高三尖杉酯碱的方法包括如下步骤：将发酵液的pH值调至3-5，静置24h-48h，过滤，取滤液；将滤液的pH值调至9-11，用氯仿萃取，取有机相；去除有机相中的氯仿和水分，得到高三尖杉酯碱；
从菌体中提取高三尖杉酯碱的方法包括如下步骤：将菌体磨碎，加入氯仿，将体系的pH值调至9-11，静置24h-48h，再超声作用30min-60min，过滤，取滤液；去除滤液中的氯仿和水分，得到高三尖杉酯碱。
上述任一制备方法中，所述发酵中接种量为2-5％。
本发明提供一种应用本发明的新菌株CH1307生产高三尖杉酯碱的方法，包括在培养基中发酵培养菌株CH1307，分别在发酵第4d、第7d添加补充培养基，同时在第7d添加利于高三尖杉酯碱合成的前体物质，以使在所述菌株细胞内和所述培养基中产生和聚集高三尖杉酯碱，以及从所述细胞内和培养基中回收并提纯高三尖杉酯碱。
本发明提供的内生真菌CH1307是国内外发现的第一株产高三尖杉酯碱的内生真菌，为细极链格孢(Alternaria tenuissima)，具有新颖性和实用性。利用本发明方法生产高三尖杉酯碱，与其他高三尖杉酯碱生产方法(如从三尖杉属植物树皮中直接提取、化学合成和植物细胞悬浮培养技术生产高三尖杉酯碱等方法)相比，本发明提供的微生物可以通过发酵培养直接生产高三尖杉酯碱，其生产成本低，不会对生态资源造成破坏，发酵工艺易于掌握，后续分离纯化步骤相对简单，从而可以不用砍伐树木作为材料提取高三尖杉酯碱。
附图说明
图1为菌落形态(标尺：1.0cm)。
图2为显微形态分生孢子梗和分生孢子形态(标尺：10μm)。
图3为显微照片(分生孢子形态)(标尺：10μm)。
图4为高三尖杉酯碱标准品及样品HPLC图谱。
图5为高三尖杉酯碱标准品及样品一级质谱图。
图6为高三尖杉酯碱标准品及样品二级质谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、菌株分离及鉴定
一、菌株分离
从海南省儋州市热带植物园海南粗榧的树皮中分离得到内生真菌，并经过发酵试验、HPLC、LC-MS、MS-MS分析，证明可以产高三尖杉酯碱。
分离方法如下：将海南粗榧的树皮先用无菌水冲洗掉表面的尘土，用75％酒精浸泡15min；用0.1％升汞溶液浸泡10min，经无菌水冲洗掉表面的升汞溶液；用无菌剪将树皮剪成5×5mm小块；将上述表面消毒的树皮接种于马铃薯(PDA)培养基，25℃恒温培养；待样品周围明显长出菌丝，采用尖端菌丝挑取法，挑取不同形态的菌落，转到PDA斜面，25-28℃纯化培养，储存备用；
将纯培养得到的菌株经过发酵试验、HPLC、LC-MS、MS-MS分析，得到产高三尖杉酯碱的菌株，将其记作菌株CH1307。
PDA培养基按照如下方法制备：将200g马铃薯去皮，切成小块用水煮沸30min，然后分别用4层、8层、16层纱布过滤，收集滤液；再向滤液中加入葡萄糖20g和琼脂20g，溶化后水定容至1000mL，121℃灭菌30min，pH自然。
二、鉴定
(一)形态特征
将菌株CH1307接种于CYA培养基，于25℃培养10d，进行镜检。
菌落形态以及分生孢子的电子显微镜检测结果如图1-3。
结果：菌落直径7cm，近圆形，边缘较整齐，正面褐绿色，反面红褐色，菌落表面呈致密绒毛状，菌丛稍厚。
显微形态：分生孢子梗淡褐色，单生，直立，有隔，偶有分枝，25.0-123.3×4.0-5.0μm。分生孢子呈淡褐色，链生，壁光滑，但处于链基部的孢子表面可见明显疣突，倒棍棒形或卵形，向顶端渐细成为锥形喙部，成熟孢子具有3-7个横隔，有些具有1-3个纵隔，分隔处缢缩，19.1-54.7×9.4-15.4μm。
表明，这种微生物与细极链格孢(Alternaria tenuissima)形态学上极为相似。
(二)分子生物学鉴定
检测菌株CH1307的ITS rDNA序列，序列如SEQ ID NO：1所示，构建系统发育树。
通过系统发育分析结果：菌株CH1307与链格孢属内的多个种聚在一个分支，序列同源性在99.8％。
综合以上鉴定结果，将菌株CH1307鉴定为细极链格孢(Alternaria tenuissima)。该菌株已于2010年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4443。分类命名为细极链格孢(Alternaria tenuissima)。
实施例2、制备高三尖杉酯碱的方法
1、斜面活化：将菌株接种于PDA培养基中，进行活化，28℃培养48-72h。
PDA培养基：马铃薯200g，加水800mL，煮沸30分钟后依次用4层、8层、16层纱布过滤，葡萄糖15g，琼脂粉18g，定容至1000mL，pH自然，115℃，20min灭菌。
2、种子培养：将斜面活化两次后的菌种接种于装有100mLPDA液体培养基的三角瓶，28℃、160r/min摇床培养48h，得到种子培养液。
3、发酵培养：
(1)将种子培养液按接种量2％转入发酵培养基(500mL三角瓶装200mL培养基)中，25℃，200r/min培养(旋转半径250mm)，培养4天；
发酵培养基按照如下方法配制：马铃薯200g，加水800mL，煮沸30分钟后依次用4层、8层、16层纱布过滤，取滤液，向滤液中加入蔗糖25g，牛肉膏1g，蛋白胨1g，硝酸铵1g，定容至1000mL，pH自然，115℃，20min灭菌备用；经pH计测定，此种培养基pH值未经调整，为自然pH6-7。
(2)在步骤(1)的基础上添加补充培养基I，25℃，200r/min培养(旋转半径为250mm)，培养3天；补充培养基I与初始发酵培养基的体积比为10ml∶200ml。
补充培养基I：10％(质量百分含量)葡萄糖水溶液和1％(质量百分含量)硝酸铵水溶液，115℃，20min分别灭菌后等体积混匀，4℃保存备用。
(3)在步骤(2)的基础上添加补充培养基II、浓度为0.1mg/mL的酪氨酸水溶液和浓度为0.1mg/mL苯丙氨酸水溶液，25℃，200r/min(旋转半径为250mm)继续发酵8天；补充培养基II与初始发酵培养基的配比为10ml∶200ml，酪氨酸水溶液与初始发酵培养基的配比为3mL∶200ml，苯丙氨酸水溶液与初始发酵培养基的配比为2.79mL∶200ml。
补充培养基II：6％(质量百分含量)葡萄糖水溶液和4％(质量百分含量)硝酸铵水溶液，115℃，20min分别灭菌后等体积混匀，4℃保存备用。
0.1mg/mL酪氨酸水溶液：以纯净水配制后115℃，20min灭菌，4℃保存备用。
0.1mg/mL苯丙氨酸水溶液：以纯净水配制后115℃，20min灭菌，4℃保存备用。
将发酵结束后，容器内的所有物质记作发酵物，由菌丝体和发酵液组成。
4、高三尖杉酯碱的提取
分别从菌丝体和发酵液中提取，具体方法如下：
向发酵物中加入无水乙醇300mL-700mL，杀灭菌体并沉淀蛋白。将发酵物进行抽虑，以分离菌体和发酵液。
1)从发酵液中提取：
发酵液于40℃减压浓缩至20mL，以酒石酸调节pH为4，静置24h，过滤，取滤液；用饱和氨水将滤液pH调至10，氯仿(无水硫酸钠处理去除水分)萃取4次，取有机相(氯仿部分)；将有机相40℃减压浓缩蒸干，1mL色谱纯甲醇定容，得高三尖杉酯碱提取物；
2)从菌体中提取：
菌丝体40℃烘干至恒重后，置研钵中充分研磨以破坏细胞壁，加入氯仿(无水硫酸钠处理去除水分)，将pH值调至10，静置48h，再超声作用30min，过滤，取滤液，将滤液减压浓缩至干以去除滤液中的氯仿和水分，1mL色谱纯甲醇定容，得高三尖杉酯碱提取物，4℃保存。
5、高效液相色谱(HPLC)
ZERBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(150mm×4.6mm，10μm)；流动相：磷酸二氢钾水溶液(0.01mol/L)∶甲醇＝65∶35(磷酸调pH＝2.5)；柱温：25℃；检测波长：288nm；进样量：5ul；流速：0.80mL/min。
检测样品为步骤4中发酵液提取物和菌体提取物的混合物。
高三尖杉酯碱标准品购自中国药品生物制品检定所，产品目录号为111533-200403。
在以上色谱条件下，高三尖杉酯碱标准品的保留时间为6.918min(图4A)；样品中高三尖杉酯碱的保留时间为6.902min(图4B)。
发酵产物中含有与高三尖杉酯碱标准品保留时间相同的物质。根据峰面积，计算出发酵产物中高三尖杉酯碱的含量。
实验设3次重复，结果取平均数。
结果表明，高三尖杉酯碱总产量为214.0037μg/L发酵物，发酵物为菌丝体及发酵液的混合体。
6、质谱(LC-MS，MS-MS)
使用少量经过HPLC纯化后的样品进行了液-质连用检测。
表1高三尖杉酯碱质谱及二级质谱检测条件
Figure BDA0000045387020000061
结果表明，高三尖杉酯碱标准品的主要成分分子量为546.4，样品一级质谱裂解图中有分子量为546.5的分子离子峰，且强度最强，与高三尖杉酯碱标准品一级质谱结果一致。高三尖杉酯碱标准品二级裂解质谱在相对分子量为226.3，240.3，251.3，266.3，298.2均有分子离子峰，样品二级裂解质谱在相对分子量为226.4，240.4，251.3，266.4，298.2均有分子离子峰，与标准品二级质谱一致，由此证明两者为同一物质(图5和图6)。
图5A为HHRT标准品一级裂解质谱图；图5B为样品一级裂解质谱图。
图6A为HHRT标准品二级裂解质谱图；图6B为样品二级裂解质谱图。
高三尖杉酯碱的化学结构式如下：
Figure BDA0000045387020000072
Figure IDA0000045387110000011

Claims (10)

1.细极链格孢(Alternaria tenuissima)CH1307，其保藏编号为CGMCC No.4443。
2.细极链格孢(Alternaria tenuissima)CH1307 CGMCC No.4443在制备高三尖杉酯碱中的应用。
3.一种制备高三尖杉酯碱的方法，包括如下步骤：发酵细极链格孢(Alternaria tenuissima)CH1307 CGMCC No.4443，并向发酵体系中添加高三尖杉酯碱合成前体物质，进行生物合成，得到高三尖杉酯碱。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵的方法包括如下步骤：
(1)将细极链格孢(Alternaria tenuissima)CH1307 CGMCC No.4443接种于初始发酵培养基中，培养；
(2)在步骤(1)的基础上添加补充培养基I，培养；
(3)在步骤(2)的基础上添加补充培养基II，培养；
所述补充培养基I为葡萄糖水溶液和硝酸铵水溶液的等体积比混合液；所述葡萄糖水溶液的浓度为8％-12％或10％(质量百分含量)，所述硝酸铵水溶液的浓度为0.8％-1.2％或1％(质量百分含量)；
所述补充培养基II为葡萄糖水溶液和硝酸铵水溶液的等体积比混合液；所述葡萄糖水溶液的浓度为4％-8％或6％(质量百分含量)，所述硝酸铵水溶液的浓度为2％-6％或4％(质量百分含量)。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)、(2)和(3)中，所述培养的温度为25℃-28℃，具体为25℃；
和/或，所述步骤(1)、(2)和(3)中，所述培养在转速为160-200r/min，旋转半径为250mm的条件下进行。
6.根据权利要求3或4或5所述的方法，其特征在于：每1升所述初始发酵培养基按照如下方法配制：将马铃薯180g-220g或200g与水混合，煮沸15分钟-30分钟或30分钟，过滤，取滤液；向滤液中加入蔗糖20g-30g或25g、牛肉膏0.5g-1.5g或1g、蛋白胨0.5g-1.5g或1g、硝酸铵0.5g-1.5g或1g，用水定容至1000mL，得到所述发酵培养基；
和/或，所述步骤(1)中，所述培养的时间为3-5天，具体为4天；
和/或，所述步骤(2)中，所述培养的时间为1-3天，具体为3天；
和/或，所述步骤(3)中，所述培养的时间为6-10天，具体为8天。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：所述向发酵体系中添加高三尖杉酯碱合成前体物质在所述步骤(2)结束后步骤(3)开始时进行。
8.根据权利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于：所述高三尖杉酯碱合成前体物质为酪氨酸和苯丙氨酸。
9.根据权利要求3-8中任一所述的方法，其特征在于：所述补充培养基I与所述初始发酵培养基的体积比为10ml-30ml∶200ml-600ml，具体为10ml∶200ml；
所述补充培养基II与所述初始发酵培养基的体积比为10ml-30ml∶200ml-600ml，具体为10ml∶200ml；
所述酪氨酸和苯丙氨酸分别以其水溶液的形式添加；
所述酪氨酸水溶液的浓度为0.05mg/mL-0.15mg/mL或0.1mg/mL；所述酪氨酸水溶液与所述初始发酵培养基的配比为2ml-5mL∶200ml-500ml，具体为3mL∶200ml；
所述苯丙氨酸水溶液的浓度为0.05mg/mL-0.15mg/mL或0.1mg/mL，所述苯丙氨酸水溶液与所述初始发酵培养基的配比为1.5mL-3.5mL∶200mL-500ml，具体为2.79mL∶200ml。
10.根据权利要求3-9中任一所述的方法，其特征在于：
所述方法中，在所述步骤(3)后，还包括如下提取步骤：
将发酵物进行分离，得到菌丝体和发酵液；分别从菌丝体和发酵液中提取得到高三尖杉酯碱；
从发酵液中提取高三尖杉酯碱的方法包括如下步骤：将发酵液的pH值调至3-5，静置24h-48h，过滤，取滤液；将滤液的pH值调至9-11，用氯仿萃取，取有机相；去除有机相中的氯仿和水分，得到高三尖杉酯碱；
从菌体中提取高三尖杉酯碱的方法包括如下步骤：将菌体磨碎，加入氯仿，将体系的pH值调至9-11，静置24h-48h，再超声作用30min-60min，过滤，取滤液；去除滤液中的氯仿和水分，得到高三尖杉酯碱。
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