CN105255210B

CN105255210B - 环保型蓝色色素的提取工艺

Info

Publication number: CN105255210B
Application number: CN201510634499.6A
Authority: CN
Inventors: 王宜磊; 孟国庆; 王文爽
Original assignee: Heze University
Current assignee: Heze University
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2035-09-30
Also published as: CN105255210A

Abstract

本发明公开了一种环保型蓝色色素的提取工艺，属于微生物制品领域。本发明采用酸沉、醇沉结合超滤，适于蓝色色素分离，该方法环保、简便、有效；既可大大降低乙醇的使用量，方便乙醇回收，又可去除色素中的部分蛋白质，提高色素品质，利于色素保存，且对环境影响较小。

Description

环保型蓝色色素的提取工艺

技术领域

本发明涉及微生物制品领域，特别涉及一种环保型蓝色色素的提取工艺。

背景技术

随着化妆品、食品行业的发展，人们在食用色素需求量增大的同时对其安全性要求也在不断提高。

作为食品添加剂所使用的色素主要有两类:一类人工化学合成色素，一类为生物色素；化学合成色素多有毒性，对人体存在较大威胁，因此现在被允许使用的化学色素正在逐年下降；生物色素因其安全性高，适用范围广已逐步得到人们的青睐。

生物色素按照其来源可分为三类:植物提取色素、动物提取色素以及微生物色素。一般微生物发酵产色素时，对环境要求低，产色素量稳定，较植物和动物色素有明显的优越性。作为三大基本色调之一的蓝色色素，可与红、黄品系的天然色素调配成丰富多彩的色调。自然界中多种微生物都可以发酵产生色素,但是能产蓝色素的菌株相对较少。

现有技术中天然蓝色素的主要来源是从热带植物如栀子等中提取，但从植物中得到的色素的稳定性不高，还常常受到植物的种类、地理、区域以及季节的影响，从而供应量得不到保证。

目前，国内外市场对于蓝色色素处于供不应求的状态。因此，分离出可以大量产蓝色色素的微生物菌种、探究其最佳发酵条件和提取工艺，对于天然食用蓝色色素的开发应用具有极其重要的意义。蓝色素的提取一般先离心固液分离，然后采用醇沉、喷雾干燥等方法，往往蛋白和色素难于有效分离，且乙醇等有机溶剂消耗量大，回收成本较高；喷雾干燥虽快速，但能耗高，且由于含有蛋白质，往往容易粘着瓶壁，不易分离。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种蓝色色素提取率高且所提蓝色色素纯度高、所提蓝色色素稳定性好的环保型蓝色色素的提取工艺。

本发明的技术方案为：

一种环保型蓝色色素的提取工艺，包括步骤：

1）离心分离发酵液，得沉淀一和上清液一；所述发酵液为产环保型蓝色色素的链霉菌（Streptomyces sp.）YLA0菌株发酵培养所得的发酵液；所述产环保型蓝色色素的链霉菌（Streptomyces sp.）YLA0菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：11335，其保藏时间为：2015年9月8日；

2）采用1-10Kda超滤膜超滤上清液一，得超滤透过液一和超滤浓缩液一，超滤浓缩液一中加酸，进行酸沉处理，酸沉处理完毕离心分离得上清液二和沉淀二；向沉淀二中加碱液，调节pH至7-8，沉淀二溶解，得清液A；

或者，

向上清液一中直接加酸，进行酸沉处理，酸沉处理完毕离心分离得上清液三和沉淀三；向沉淀三中加碱液，调节pH至7-8，沉淀三溶解，得清液B；采用1-10Kda超滤膜超滤清液B，得超滤透过液二和超滤浓缩液二，超滤浓缩液二备用；

3）向清液A或超滤浓缩液二中加入醇，进行醇沉处理，醇沉处理完毕离心分离得上清液四和沉淀四，干燥沉淀四，得固体蓝色色素。

作为优选方案，步骤1）中，进行两次离心分离；第一次离心分离以转速4000-5000rpm离心所述发酵液5-10min；第二次离心分离以转速1.0-1.2万rpm离心第一次离心分离所得上清液10-15min；第二次离心分离所得上清液为上清液一。

作为优选方案，步骤2）中，采用1-10Kda超滤膜超滤具体为：采用1-10Kda的超滤离心管以转速4000-5000rpm超滤分离5-15min。

作为优选方案，步骤2）中所述酸为浓盐酸。

作为优选方案，步骤2）中所述碱为质量分数为20-40%的氢氧化钠水溶液。

作为优选方案，步骤1）中产环保型蓝色色素的链霉菌（Streptomyces sp.）YLA0菌株发酵培养时所用发酵培养基由玉米15.0-25.0g、硝酸钾0.5-1.5g、乙酸钠0.3-0.8g、磷酸氢二钾0.3-0.8g、硫酸镁0.3-0.8g、硫酸锰0.008-0.012g、硫酸亚铁0.008-0.012g和水1000mL组成；所述发酵培养基的pH为7.2-7.4。

作为优选方案，步骤2）中酸的用量满足，每300mL发酵液0.8-1.2mL浓盐酸。

作为优选方案，步骤4）中醇为乙醇，乙醇的体积为清液A或超滤浓缩液二体积的40-60%。

采用所述环保型蓝色色素的提取工艺所得蓝色色素作为酸碱指示剂的应用。

本发明的有益效果为：

本发明的提取工艺环保、简便、有效；既可大大降低乙醇的使用量，方便乙醇回收，又可去除色素中的部分蛋白质，提高色素品质，利于色素保存，且对环境影响较小。本发明提取工艺所得蓝色色素纯度非常高，其他物质含量极少。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为平板三区划线分离、纯化图；

图2为平板菌落形态图；

图3为4*10光学显微镜OLYMPUS DP72显微成像系统（48h）3个菌落；

图4为10*10光学显微镜OLYMPUS DP72显微成像系统（48h）；

图5为4*10光学显微镜OLYMPUS DP72显微成像系统（60h）；

图6为4*10光学显微镜OLYMPUS DP72显微成像系统（72h）；

图7为4*10光学显微镜OLYMPUS DP72显微成像系统菌落形态图（4d=96h）；

图8为4*10光学显微镜OLYMPUS DP72显微成像系统（7d）示蓝色色素分泌；

图9为10*10光学显微镜OLYMPUS DP72显微成像系统（7d）示蓝色色素分泌；

图10为10*10光学显微镜OLYMPUS DP72显微成像系统（7d）示边缘气生菌丝；

图11为YLA0菌株培养4d插片，孢子丝形态显微观察图(60*10）；

图12为YLA0培养7d印片显微观察图（100*10）；

图13为YLA0菌株的系统进化树；

图14为发酵过程蓝色素的积累量；

图15为发酵过程色素的单天产量；

图16为金属盐对色素的增强效果图；

图17为温度对色素稳定性的影响；

图18为色素在不同pH下的HPLC高效液相色谱图；

图19提纯后蓝色色素的高效液相色谱；

图20为本发明一种蓝色色素的提取工艺流程图；

图21为本发明另一种蓝色色素的提取工艺流程图。

链霉菌（Streptomyces sp.）YLA0菌株，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为CGMCC No：11335，保藏时间为：2015年9月8日。

具体实施方式

实施例1 产环保型蓝色色素的链霉菌（Streptomyces sp.）YLA0菌株的获取

山东菏泽牡丹区大田栽培的牡丹根际3-30cm 土样，取5g 土壤样品放入装有45mL无菌水的三角瓶中(玻珠)，振荡均匀，静置5-10 min后取上层悬液，稀释10 倍，取0.1mL用无菌玻璃涂棒均匀涂布在改良高氏1号合成琼脂培养基平板上，倒置于28℃培养箱中培养5-7d，出现单菌落后，挑选出产生蓝色水溶性色素的菌落，连续3次划线分离纯化（图1和图2），可获得产蓝色色素的出发菌株，即，链球菌（Streptomyces sp.）YLA11菌株。

将出发菌株接种于种子培养基，用生理盐水收集并悬浮出发菌株的分生孢子，做成孢子浓度为1×10⁸- 10⁹cfu/ml 的孢子悬液，亚硝基胍处理液的作用下诱变，结合紫外灯照射进行复合诱变，间隔挑取不同处理时间的样品，进行平板筛选和发酵筛选，发酵筛选的菌株进行发酵复筛，获得遗传性质稳定、蓝色色素产量高的产蓝色色素的突变菌株，即，链霉菌（Streptomyces sp.）YLA0菌株，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：11335，其保藏时间为：2015年9月8日。

改良高氏一号合成琼脂培养基：可溶性淀粉20g、酵母提取物1g、硝酸钾1g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g和蒸馏水1000mL组成，pH值为7.2-7.4。

种子培养基：可溶性淀粉20.0g，干酪素0.5 g，硝酸钾(KNO₃)1.0g，氯化钠（NaCl）0.5 g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.5g，硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)0.5g，硫酸锌（ZnSO₄）0.01g，硫酸亚铁(FeSO₄.7H₂O)0.01g，蒸馏水1000ml，pH7.2 -7.4

所述产环保型蓝色色素的链霉菌（Streptomyces sp.）YLA0菌株用于蓝色色素的生产。

实施例2 产环保型蓝色色素的链霉菌（Streptomyces sp.）YLA0菌株发酵产蓝色色素

采用所述产环保型蓝色色素的链霉菌（Streptomyces sp.）YLA0菌株生产蓝色色素的方法，将菌株置于发酵培养基，并于35-37℃下发酵2-9天，得发酵液；所述发酵培养基由玉米20.0g、硝酸钾1.0g、乙酸钠0.5g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.01g、硫酸亚铁0.01g和水1000mL组成，所述发酵培养基的pH为7.2-7.4；

发酵培养基中加入硫酸锰，起到刺激作用，可生产更多的蓝色色素。

实施例3 产环保型蓝色色素的链霉菌（Streptomyces sp.）YLA0菌株的生物学特征分析

高氏一号培养基：可溶性淀粉20.0g，干酪素0.5 g，硝酸钾(KNO₃)1.0g，氯化钠（NaCl）0.5 g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.5g，硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)0.5g，硫酸锌（ZnSO₄）0.01g，硫酸亚铁(FeSO₄.7H₂O)0.01g，蒸馏水1000ml，pH7.2 - 7.4。

1. 形态特征

在高氏一号培养基上，划线分离时可形成绒毛状菌落，早期在显微镜下可见形成稀疏的浅白色绒毛状菌落。如图3和图4所示48h菌落。后逐渐变浓密，白色，但无蓝色色素出现。图5（培养60h），图6（培养72h），图7（培养96h），培养96小时可以看到开始有蓝色形成。第6天能看到菌落周围有明显的蓝色色素出现，到第7天在平板上能明显看到蓝色色素大量形成，并有色素分泌液滴形成（图8，图9），气生菌丝更加发达（如图10）。

在插片和印片的显微镜观察中可见到气生菌丝和螺旋状的孢子丝，也能看到该菌株孢子多，孢子链3-4 圈松散螺旋（图11，图12）。

2.碳源、氮源对该菌株产生蓝色色素的影响情况

在高氏一号培养基的基础上，分别用等量的葡萄糖、甘露糖、木糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、木聚糖、羧甲基纤维素钠、半纤维素、木质素、果胶、麦芽粉取代淀粉进行碳源利用情况实验，结果如表1：

表1 碳源利用情况

较好利用：+++，利用：++，利用较差：+ ，不利用：—

由表1可以看出，不能作为蓝色色素分泌的碳源物质有：木糖、蔗糖和羧甲基纤维素钠、果胶；能分泌少量色素的碳源物质为：葡萄糖、甘露糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇；有利于色素分泌的碳源物质为：木质素最好、淀粉次之、半纤维素和木聚糖再次之，麦芽粉又次之。

在高氏一号培养基的基础上，分别用等量的硝酸铵、氯化铵、硝酸钾、硫酸铵、磷酸铵、磷酸二氢铵、草酸铵、酒石酸铵、尿素、蛋白胨、牛肉膏、干酪素、胰蛋白胨、酵母提取物、大豆粉取代硝酸钾进行氮源利用情况实验，结果如表2所示：

表2 氮源利用情况

较好利用：+++，利用：++，利用较差：+ ，不利用：-

由表2可以看出，该菌不能利用磷酸铵、磷酸二氢铵、牛肉膏、酵母提取物、干酪素做氮源产生色素，但除氯化铵和磷酸二氢铵利用较弱外，其它的基本上都能利用其生长；产生色素较少的氮源物质有硫酸铵、氯化铵、草酸铵，这样看来铵盐不利于色素的产生。牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨和酵母提取物做氮源均不能产生蓝色素；产生蓝色素较好的氮源主要有玉米粉最好、硝酸钾次之、尿素再次之；就生物量来说，干酪素明显高于其它氮源，在进行种子培养时可考虑加入。

3.初始pH对色素产生的影响

在高氏一号培养基的基础上，分别用10%的盐酸和氢氧化钠溶液调节培养基的初始pH值为3、4、5、6、7、8、9、10、11常规灭菌冷却后以10%的接种量接种，观察初始pH对色素产生的影响，结果如表3所示；

表3 初始pH对色素产生的影响

由表3可以看出，初始PH值为7左右时最适于色素的分泌和菌丝体的生长。

如图18所示，不同pH下的HPLC高效液相色谱图，由图18可以看出不同pH下的色素出峰时间基本没有变化，说明其物质结构基本相同。

4.不同C/N对色素产生的影响

以高氏一号培养基为基础，固定氮源的量不变（KNO₃为1g/L），分别称量100mL培养基中不同量的淀粉（3.2，2.88，2.56，2.24，1.92，1.6，1.28，0.96，0.64，及原配方中的2.0g使C/N为12.5）使C/N比符合下表要求。115℃，高压灭菌15Min，接种后26-28℃培养。结果如表4所示：

表4 不同C/N对色素产生的影响

由表4可知，C/N为14：1时，产生色素的量最大，生物量也较大。

5.无机离子对色素产生的影响

以高氏一号培养基为基础，固定其它物质的量不变，分别称量100mL培养基中不同的无机盐0.05g，代替培养基中的NaCl。115℃，高压灭菌15Min，接种后30℃培养。结果如表5所示：

表5 无机离子对色素产生的影响

由表5可知，SO₄ ^2-、Cl^-、NO₃ ^-,等无机阴离子对色素分泌的影响较小，而乙酸根（AC^-）能明显促进色素的分泌；Ca、Na、K，等离子对色素的分泌影响一定促进作用，Fe、Cu、Ag、Hg、Co 不利于色素的分泌，Mn离子能明显促进色素的分泌，且能促进生物量的快速生长。可考虑在种子培养基和发酵培养基中加入少量MnSO₄，以便产生更多的种子用于接种，和在发酵时产生更多的色素。

6.培养时间对色素分泌的影响

从发酵培养的第24小时开始，每隔24小时于发酵瓶中取10ml菌液于两个离心管中。先经5000rpm离心10min，弃沉淀后用紫外可见分光光度计测量其光谱曲线图，再经12000rpm离心10min，同样弃沉淀后用紫外可见分光光度计测量其光谱曲线图，并取图谱中波长为596nm处的数值，为色素在596nm处的OD值。依据色素图谱观察色素产生量的变化，直到色素浓度不再变化。得到数据作图14色素的积累量和图15色素在不同时间段的产生量。色素的积累量如图14所示，色素的单天产量如图15所示。

通过对以上色素OD值折线图的分析，发现链霉菌YLA0在培养过程中，在第2d开始产生色素，但产量较小，第4d开始大量产生，并且色素单天产量在第6d达到最多，8d时色素的累积量最多，此后色素总量有所减少。当发酵时间到达第9d时菌体色素产生量明显减少。因此对色素进行发酵生产时可以在第7d停止发酵，进行色素的提取，此时能获得最佳产量。

所述产环保型蓝色色素的链霉菌（Streptomyces sp.）YLA0菌株，其16rDNA的部分基因序列为：

cgtcccatcg ccagtcccac cttcgacagc tccctcccac aaggggttgg gccaccggct 60

tcgggtgtta ccgactttcg tgacgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt 120

caccgcagca atgctgatct gcgattacta gcgactccga cttcatgggg tcgagttgca 180

gaccccaatc cgaactgaga ccggcttttt gagattcgct ccaccttgcg gtatcgcagc 240

tcattgtacc ggccattgta gcacgtgtgc agcccaagac ataaggggca tgatgacttg 300

acgtcgtccc caccttcctc cgagttgacc ccggcggtct cccgtgagtc cccaacaccc 360

cgaagggctt gctggcaaca cgggacaagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca 420

tctcacgaca cgagctgacg acagccatgc accacctgta caccgaccac aaggggggca 480

ccatctctga tgctttccgg tgtatgtcaa gccttggtaa ggttcttcgc gttgcgtcga 540

attaagccac atgctccgcc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gttttagcct 600

tgcggccgta ctccccaggc ggggcactta atgcgttagc tgcggcacgg acaacgtgga 660

atgttgccca cacctagtgc ccaccgttta cggcgtggac taccagggta tctaatcctg 720

ttcgctcccc acgctttcgc tcctcagcgt cagtatcggc ccagagatcc gccttcgcca 780

ccggtgttcc tcctgatatc tgcgcatttc accgctacac caggaattcc gatctcccct 840

accgaactct agcctgcccg tatcgactgc agacccgggg ttaagccccg ggctttcaca 900

accgacgtga caagccgcct acgagctctt tacgcccaat aattccggac aacgcttgcg 960

ccctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgg cgcttcttct gcaggtaccg 1020

tcactttcgc ttcttccctg ctgaaagagg tttacaaccc gaaggccgtc atccctcacg 1080

cggcgtcgct gcatcaggct ttcgcccatt gtgcaatatt ccccactgct gcctcccgta 1140

ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggccggtcgc cctctcaggc cggctacccg 1200

tcgtcgcctt ggtgagccat tacctcacca acaagctgat aggccgcggg ctcatccttc 1260

accgccggag ctttcgaacc tcgcagatgc ctgcgagggt cagtatccgg tattagaccc 1320

cgtttccagg gcttgtccca gagtgaaggg cagattgccc acgtgttact cacccgttcg 1380

ccactaatcc ccaccgaagt ggttcatcgt tcgactgcat gtgta 1425

以上基因测序结果由华大基因测试而得。

正向引物27F：GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG；

反向引物1541R：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。

将得到的基因测序结果用在线的Blast 软件（http ：//www.ncbi．nlm.nih．gov/blast) 进行同源性分析，结果在GenBank 中找到多个链霉菌属显著相似的基因序列，其同源性高达98%。通过Blast 工具在NCBI 蛋白质序列数据库中进行同源性搜索，并利用Clustal W 程序进行多重序列比对。利用MEGA4.0 软件，采用相邻拼接方法（NeighborJoining Method），获得该菌株的系统进化树（图13），将该菌鉴定为链霉菌，且该菌株与常见的菌株均有某些特征不同，可能是能产生蓝色色素的一个新种。

该菌株已于2015年9 月8 日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为 CGMCC No：11335。

色素的性质与稳定性研究

1.色素的溶解性：

对产蓝色素链霉菌摇床培养7d后停止发酵，收集发酵液首先进行5000rpm离心10min，取上清液平均分到两个烧杯中，分别向上清液中不断滴加1mol/L氢氧化钠溶液和1mol/L盐酸溶液，发现色素即可溶于碱溶液又可溶于酸溶液，且pH越低溶解度越小，当pH＜4时摇匀后静置1h会产生砖红色沉淀，将其调至碱性时，溶液又恢复蓝色。将酸沉后的色素干燥后，吸水性很差，但易溶于碱溶液，且性质不变，所以可以用酸沉的色素较长时间保藏。

同样取5份等量上清液，分别向上清液中加入等量同浓度的极性或非极性有机溶剂，结果发现该蓝色素在极性较强的有机溶剂甲醇和乙醇中产生小颗粒状沉淀，丙酮中可产生丝状沉淀，不溶于三氯甲烷、乙醚和乙酸乙酯等非极性的有机溶剂。

实验结果：根据以上实验结果，结合相似相容的原理推测该色素的分子结构是极性的，对色素分子结构的探究有一定的帮助。

2.pH变化对色素呈色的影响

在上述色素溶解性实验中发现，向色素中不断滴加酸或碱时，色素颜色随pH的变化而变化，具体变化过程如下：

pH 13————7————6————4————1

颜色变化蓝色紫色红色沉淀

实验结果：色素的变色区间在pH6-7之间，使之作为指示剂能较好地辨别弱酸或弱碱溶液的酸碱性，可作为一种较好的酸碱指示剂。

不同pH下的HPLC高效液相色谱图，由图可以看出不同pH下的色素出峰时间基本没有很大变化，说明其物质结构基本相同。

3.不同离子对色素稳定性的影响

配制0.05mol/L的以下盐溶液（FeSO₄、ZnSO₄、MgSO₄、CaSO₄、CuSO₄、MnSO₄、BaSO₄、Pb(NO₃)₂ 、AgNO₃，按照氧化还原集中的配制方法，配制盐浓度为1mmol/L的25%发酵液的溶液静置一段时间。选取未发生络合反应的溶液测其596nm处的OD值，发现色素溶液的吸光度有所增强。未与色素发生络合反应的盐离子，对色素溶液吸光度的增强效果如图16所示：

实验结果：结合以上实验可知Fe³⁺、Gu²⁺、Pb⁺可以与蓝色素发生络合反应而产生沉淀。Fe³⁺产生的沉淀为黑褐色，上清为黄色。Gu²⁺、Pb⁺产生的沉淀为蓝色，上清为浅蓝色或者无色。其余离子能增强色素的稳定性。

4.温度对色素稳定性的影响

取适量稀释四倍的发酵液并将pH调至9，每次取10mL分别装入11支试管中，加塞。保留一支处于室温，其余10支放入100℃的水浴锅中保温，每隔10min取出一支并放入冷水中冷却，探究温度对色素596nm处吸光度的影响。100℃的温度对色素596nm处吸光度的影响如图17所示：

可知100℃的温度对色素596nm处的吸光度会照成一定影响，使其OD值降低。在上述实验的基础上进一步探究影响吸光度的最低温度，取11支试管分别加入10mL的浓度为25% pH=9的发酵液。同样保留1支处于室温，其余9支分别置于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的水浴锅中保温，待2h后取出测其596nm处的吸光度。

实验结果：根据以上实验可知，当温度为100℃时色素596nm处的吸光度随时间的增加而减小，因此高温对色素的稳定性影响较大。由于时间限制，未能进行100℃以上的温度对色素稳定性影响实验，根据50-100℃的影响结果趋势推测，100℃以上的高温对色素稳定性影响更大。在使用过程中应该避免长时间的高温加工。

5.光照对色素稳定性的影响

将适量浓度为25%的发酵液的pH调至9，分别取10mL置于10支试管中，再将10支试管分别置于不同环境中：1、2室外见光，3、4室外避光，5、6室内见光，7、8室内避光，9、10紫外光照。每隔24h测其596nm处的吸光度，连续测五天。

实验结果：通过分析折线图可知光照对色素的影响比较明显，室外强光对色素的影响更为明显，所以室外比室内的色素变化更明显。室内避光、紫外光和冰箱保存三个条件下对色素的影响不是特别明显，可以选择其一作为保藏条件。

实施例4

环保型蓝色色素的提取工艺，包括步骤：

1）离心分离实施例2所得发酵液；具体地，进行两次离心分离；第一次离心分离以转速4000-5000rpm离心所述发酵液5-10min；第二次离心分离以转速1.0-1.2万rpm离心第一次离心分离所得上清液10-15min；第二次离心分离所得上清液为上清液一，两次离心分离所得沉淀汇总为沉淀一；

2）采用1-10Kda的超滤离心管以转速4000-5000rpm超滤分离上清液一5-15min，得超滤透过液一和超滤浓缩液一，超滤浓缩液一中加浓盐酸，进行酸沉处理，浓盐酸的加入量满足1mL浓盐酸/300mL发酵液；酸沉处理完毕离心分离得上清液二和沉淀二；向沉淀二中加20%-40%的氢氧化钠水溶液，调节pH至7-8，沉淀二溶解，得清液A；

3）向清液A中加入占清液A总体积40-60%的乙醇，进行醇沉处理，醇沉处理完毕离心分离得上清液四和沉淀四，干燥沉淀四，得固体蓝色色素。

酸沉后所得干品加1mol/L碱液，过超滤管后的色素，在Agilent Technogies HPLC色谱柱，Eclipse XDB-C18，4.6*250mm，5um，流动相10-40%甲醇水溶液都可以，流速0.5-1.0mL/min，检测波长587-596nm均可。结果如图19所示，由图可以看出该色素总体较纯，其他物质含量很少。

实施例5

环保型蓝色色素的提取工艺，包括步骤：

2）向上清液一中直接加浓盐酸，进行酸沉处理，浓盐酸的加入量满足1mL浓盐酸/300mL发酵液；酸沉处理完毕离心分离得上清液三和沉淀三；向沉淀三中加20%-40%的氢氧化钠水溶液，调节pH至7-8，沉淀三溶解，得清液B；采用1-10Kda的超滤离心管以转速4000-5000rpm超滤分离清液B5-15min，得超滤透过液二和超滤浓缩液二，超滤浓缩液二备用；

3）向超滤浓缩液二中加入占超滤浓缩液二总体积40-60%的乙醇，进行醇沉处理，醇沉处理完毕离心分离得上清液四和沉淀四，干燥沉淀四，得固体蓝色色素。

当然，也可直接把清液A和超滤浓缩液二进行喷雾干燥，得固体蓝色色素予以保存；如果对蓝色色素纯度要求较高，在使用前，进行醇沉处理即可。

本发明蓝色色素提取工艺中，

1.进行固液分离后的发酵上清液，可直接用盐酸进行酸沉，1mL浓盐酸/300mL发酵液。由于该色素在局部强酸的条件下并不变性，所以不必配制一定浓度的酸溶液进行酸沉。

2.加碱中和酸沉色素，色素性质不变。且其变色范围在pH6-7之间，小于6紫红色，大于7蓝色，所以可作为指示剂来用。

3.酸沉色素不易吸水，便于保藏，所以可将酸沉色素用于较长时间的保藏，使用时用碱中和即可；

4.酸沉后的色素过3000Da的超滤管滤过液几乎无色，所以可用该法去除溶液中或由于酸沉和碱中和产生的离子，可得到较纯的色素干品，同时有利于环境保护。

5.在色素溶液中加入少量Mn、或Ca离子可以增加色素的稳定性。

6.占总体积40-60%的乙醇醇沉也可得到蓝色色素，且由于色素较稳定，可以在50-70℃下真空干燥。乙醇可以回收，也有利于环保。

7.酸沉、醇沉结合超滤：一种适于蓝色色素分离、提纯的环保、简便、有效的方法；既可大大降低乙醇的使用量，方便乙醇回收，又可去除色素中的部分蛋白质，提高色素品质，利于色素保存，且对环境影响较小。

Claims

1.一种环保型蓝色色素的提取工艺，其特征在于，包括步骤：

或者，

3）向清液A或超滤浓缩液二中加入醇，进行醇沉处理，醇沉处理完毕离心分离得上清液四和沉淀四，干燥沉淀四，得固体蓝色色素；

步骤2）中所述酸为浓盐酸；酸的用量满足，每300mL发酵液0.8-1.2mL浓盐酸。

2.如权利要求1所述环保型蓝色色素的提取工艺，其特征在于：步骤1）中，进行两次离心分离；第一次离心分离以转速4000-5000rpm离心所述发酵液5-10min；第二次离心分离以转速1.0-1.2万rpm离心第一次离心分离所得上清液10-15min；第二次离心分离所得上清液为上清液一。

3.如权利要求1所述环保型蓝色色素的提取工艺，其特征在于，步骤2）中，采用1-10Kda超滤膜超滤具体为：采用1-10Kda的超滤离心管以转速4000-5000rpm超滤分离5-15min。

4.如权利要求1所述环保型蓝色色素的提取工艺，其特征在于：步骤2）中所述碱为质量分数为20-40%的氢氧化钠水溶液。

5.如权利要求1所述环保型蓝色色素的提取工艺，其特征在于：步骤1）中产环保型蓝色色素的链霉菌（Streptomyces sp.）YLA0菌株发酵培养时所用发酵培养基由玉米15.0-25.0g、硝酸钾0.5-1.5g、乙酸钠0.3-0.8g、磷酸氢二钾0.3-0.8g、硫酸镁0.3-0.8g、硫酸锰0.008-0.012g、硫酸亚铁0.008-0.012g和水1000mL组成；所述发酵培养基的pH为7.2-7.4。

6.如权利要求1所述环保型蓝色色素的提取工艺，其特征在于：步骤3）中醇为乙醇，乙醇的体积为清液A或超滤浓缩液二体积的40-60%。

7.采用权利要求1所述环保型蓝色色素的提取工艺所得蓝色色素作为酸碱指示剂的应用。