JPS63190894A - 新規抗生物質バ−ミスポリンおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗凶活性金有する新規抗生物質バーミスボリン
およびその製造法に関するものである。

〔従来の技術および発明が解決しようとする問題点〕

従来１種々の抗生物質が、医薬品、動物用薬品、農薬等
の分野で実用化されている。しかしながら１例えば、嫌
気性細菌に対して有効な抗菌活性を示す物質が未だそれ
程多く見出されていない九め、嫌気性細菌に起因する日
和見感染症等の医療分野においては新規の抗菌抗生物質
の出現が常に要望されている。

本発明者らは１以上のような点に着目し、新規な抗菌抗
生物質を提供するとともに、その製造法を確立すること
によって、これを解決しようとするものである。

Ｃ問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、上述の期待にこたえるべく。

抗菌活性を有する物質の探索を続けていたところ、オフ
イオボルス属に属するある菌株の培養物中に、抗菌活性
、特に嫌気性菌に対して強い抗菌活性を有する物質が生
産されていること？見い出し、有効物質バーミスボリン
を単離し。

その理化学的性状および生物学的性状を確定することに
よシ９本発明を完成した。

すなわち本発明の要旨は下記の理化学的性質を有する新
規抗生物質バーミスポリン及びその製造法に存する。

（イ）元素分析値： 炭　累　　　　　　　　り　　０．１　　１　　　憾水
累　　　　　ざ、７．７％ 窒素　　　３．７０％ （ロ）分子量： ｌ　　／　　ｔ　　（ＢＲ−Ｍ８　　ｍ／Ｚ’ｌ／！、
コク／？、Ｍ”）（ハ）分子式： ％式％ ： （ホ）紫外部吸収スペクトル： メタノール溶液中で測定したスペクトルはＩｆ／図に示
す通りである。

２”ＯＨＪＪｆｎｍ（ｇｂｉｔＯ）。

ｍａ耳 コｆ／ｎｍ（ｇ／ココ、ｆｏ） （へ）赤外部吸収スペクトル： クロロホルム溶液中で測定したスペクトルは第一図に示
す通シである。

（ト）水素核核磁気共鳴スペクトル： 重クロロホルム溶液中で測定し７７ｔ−ｇｏ。

ＭＨｚ水累核核磁気共鳴スペクトルは第３図に示す通シ
である。

（イ）炭素核核磁気共鳴スペクトル： 重クロロホルム溶液中で測定した／ＱθＭＨ２炭素核核
磁気共鳴スペクトルは第ｑ図に示す通シである。

（す）　溶解性： クロロホルム、ジエチルエーテル、アセトン、酢酸エチ
ル、メタノール及びエタノールに可溶。ｎ−ヘキサノ及
び水に不溶。

休）呈色反応： １０９に硫酸及びそリプデン酸試薬に陽性。

ブレイブ・リーバツク試薬及びニンヒドリン試薬に陰性
。

に）薄層クロマトグラフィー： メルク社製シリカゲル薄層（Ａｒｔ　、ｔクハ・を使用
し、展開溶媒がクロロホルムーメタＲ杓１Ｎ ノール（、ｙｏ：ｔ）の場蓄ηπ３．同薄層（７）外観
： 無色油状であることを％徴とする。

以下本発明の詳細な説明する。

紫外ｇ（Ｓ吸収スペクトルのλｍａＸ　のパターンから
、本発明のバーミスボリンはテヌアゾ酸骨格を有するこ
とが推定され、上述した理化学的性状および後述の第１
表に示す生物学的性状と本発明化合物に類似する既知の
テヌアゾ酸骨格を質と判断された。

上述の本発明のＩ？規な抗生物質バーミスボリンの生産
ｗＦｉ、オフイオボルス属（０ｐｈｉｏｂｏｌｕｓ属）
に属する微生物であって、その培養物中に採取するに充
分な量の抗生物質バーミスボリンを生産する能力を有す
るものであればかかなるものであってもよい。このよう
な菌株の例としては５本発明者らにより草本性植物体よ
シ新たに分離され次小房子頒菌綱に属するＬ−５菌株が
ある。Ｌ−ｇ菌株の菌学的性状は下記の通りである。

■　形態学的特徴 子嚢果は宿主植物上に散在〜群生する。はじめ植物表皮
下に城没して生じる。のちに表皮を破り乳頭状に突出し
た頚部を生じる１球形〜亜球形、直径コＪ　Ｏ−１ｊ　
Ｏｐｒｏ、、高さ３００〜４Ｃ−〇　ｐｍ　；　　頚部
は直径ｌｌＱ〜／　、ｔ　ｊ　ｐｍ　、長さ／　Ｊ　Ｏ
〜／　Ｋ　Ｏｐｍ　、頚部孔口内面に無色のベリフィシ
スを有する；殻壁は厚さコｊ−′−ダＯｐｍ　、　５〜
１９層の多角形〜長方形の細胞からなり、外側は黒褐色
、厚膜、内側では淡色、薄膜となる。子嚢は多数生じる
１円筒形〜こん棒形、１００−／Ｊ！ｔＸ１０〜／　！
ｒ　ｐｍ　、　　基部に向かって細まる。

頂端は丸く、厚膜、二重壁、を胞子性；偽側糸は糸状、
隔壁を有する。子嚢胞子は子嚢内に平行状あるいはラセ
ン状にねじれて束状に配列する。こん棒形〜長円筒形、
１０〜／１０×Ｓ〜７μｍ、無色、はぼまっすぐまたは
やや彎曲する１通常り隔壁を有する：各細胞は顕著な膨
大細胞を欠く０着た狭窄し次細胞も欠く、各細胞には７
〜３個の油滴状含有物が存在する；胞子両極にゼラチン
様の付属体を（イ）　ジャガイモ・ブドウ糖寒天培地（
ＰＤＡ）上コタｃ、ｉｏ日間の培養 コロニーはｉｏ日日間直径コル３譚に拡がる。色調は、
はじめ明るいオリーブ灰色を呈し、のちに暗いオリーブ
灰色になる。

基底菌糸は放射状に伸長し１分枝する。巾ダ、θ〜り、
ＯｐｍＶＣ至る。隔壁を有する。気生菌糸ｔ−豊富に形
成する。寒天培地上では完全世代及び不完全世代の生殖
器官の形成は紹められない。

（ロ）麦芽寒天培地（ＭＡ）上、λりＣ，１０日間の培
養 本培地上での培養上の特徴は上記ＰＤＡ上での性質と一
致する。

■　生理的性質 ０）最適生育条件 最適ｐＨ：Ａ〜り（ＬＯＡ液体液体中地中ＩＩ日間培養
） 最適湯度：２７〜３０℃（ＰＤＡ寒天寒天上地上４を日
間培養） （ロ）　生育の範囲 ｐＨ：参〜１０（ＬＯＡ液体液体中地 中ｌＩ日間培１１） 温度：コＯ℃〜ＪＯＣ（ＰＤＡ寒天寒天上地上参日間培
養） ■　分類学的考察 （イ）高次の分類学上の位置 本墓株（Ｌ−ｇ）は、草本性植物体上に着生して生じ、
フラスコ型の子嚢果を形成する。永続性の偽側糸（ｐａ
ｅｕｃＬｏｐａｒａｐｈｙａｉａ）の間に子嚢を形成す
る。子りは二重壁構造を持つ。子鮎胞子は多隔壁である
等の主な特徴を持つことから、　Ｌ−Ｈｏ１ｍ、　８７
ｍｂ−ＢＯｔａｎ。

Ｕｐｓａｌ、　、　／１ｌ（Ｊ　）　、　／−／Ｊ！：
ｇ：（／９ｊ７）　；Ｌｕｔｔｒｅｌｌ。

Ｌｏｃｕｌｏａｓａｏｍｙｃｅｔｅｓ、　Ｔｈｅ　Ｆｕ
ｎｇｉ、　Ｔｏｌ、　４（Ａ（ａｄ。

Ｇ、０．Ａｉｎａｖｏｒｔｈ　　ｅｔ　　ａｌ、）、　
　ｔ３ｒ−コ１ｔ（ｔｑりＪ）：Ｊ、Ａ、ｖｏｎ　　Ａ
ｒｘ　　＆　　Ｅ、Ｍｆｉｌｌｅｒ、５ｔｕｄ、Ｍｙｃ
ａｌ、、９゜ｔ−／ｓｑ（ｔｒ７ｇ）等によって分類さ
れている小房子嚢画調（ロキュロアスコミセイテス。

ＬｏｃｕｌｏａｓｃｏｍｙＣｅｅｅｓ　）−ブレオスポ
ラ目（ｐ１８０８ｐｏｒａ１８ｇ　）−ブレオスボラ科
（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅ　）にＭＩ属される０？
、／−ｔｒｑｃｉｑｔｓ）のブレオスボラ科（’Ｐ１θ
〇−θｐｏｒａｃｅａｅ　）に関する分類学的文献によ
れば５本科には７７属が含まれている。７７属中細長い
円筒形〜糸状の子嚢胞子を持つ属菌として、オフイオボ
ルス（０ｐｈｉＯｂＯ１−ｕａ　）楓、ノドウロスファ
エリア（Ｎｏｄｕｌ−ｏａｐｈａｅｒｉａ　）　ｋｍ　
ｅコクリオボルス（０Ｏｃｈ−ｘｔｏｂｏｘｕｓ　）属
が挙げられる。これらの属は１）子鉢果外面の剛毛の有
無、２）頚部孔口内面の剛毛の有無、３）子錐胞子各細
胞の膨大細胞の有無、４）培養に基づいた分生子世代の
有無等から、それぞれ識別されている。

本菌株（Ｌ−ｚ）は、１）子嚢果外面に剛毛を欠く、２
）頚部孔口内面に剛毛を欠く、３）子嚢胞子は細長い円
筒形、膨大細胞を欠く、４）各種培地上で分生子世代を
形成しない等の特徴を持つ。

これらの特徴から、本菌株（Ｌ−ｇ）はオフイオボルス
（０ｐｈｉＯｂ１ｕ８　）属菌と同定された。

（ハ）膓レベルの同定 Ｒ，Ａ、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、Ｃａｎ、、Ｔ、Ｂｏｔ、
、５４（、コＪｌ、！−コダＯダ（／？り６）のオフイ
オボルス（０ｐｈｉｏ’ｂｏ−１ｕ８）属に関する分類
学的文献によれば。

本属には、３ノ種が記載されている。これらの種は、そ
れぞれ子嚢胞子の諸性質、即ち、胞子の形、大きさ１．
隔壁数、膨大細胞の有無９分節の有無、付属体の有無１
色調等によって区別されている。

本菌株（Ｌ−ｒ）は、１）子嚢胞子は細長い円筒形〜こ
ん棒形、１００〜ｉｓｓｘｉｏ−ｉｓｐｍの大きさ、２
）り隔壁含有する。３）膨大細胞を欠く、４）各細胞は
永続的に分節することはない、５）胞子両極にゼラチン
状の付属体を有する。６）胞子は無色等の特徴を有する
ことから、Ｒ０人０日ｈ−ｏｅｍａｋｅｒ、　Ｏａｎ、
　Ｊ、　Ｂｏｔ、、！４（、コＪ９ｊ（／９り６）に記
載されているオフイオボルス・バーミスボオルス（０ｐ
ｈ１ｏ’ｂｏｌｕｅ　ｖｅｒｍｉｓｐｏｒｕｓ　）　　
の性質と一致した。

従って本菌ａ（Ｌ−ｆｆ　’）はＯｐｈｉｏｂｏｌｕａ
ｖａｒｍｉｓｐｏｒｕａと同定された。

Ｌ−を株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第ｑ／、３１号（ＦＫＲＭＰ−９／３１）として寄託
されている。

一般に、オフイオボルス属（０ｐｈｉｏｂｏｌ−ｕａ属
）菌は、他の菌類の場合にみられるようにその性状が変
化しやすい。たとえば。

Ｌ−１株の、またはこの株に由来する突然変異株（自然
発生または誘発性）、形質接合体′を次は遺伝子組換え
体であっても、抗生物質バーミスボリンの生産能を有す
るものはすべて本発明の方法に使用することができる。

本発明においては、前記の菌を通常の微生物が利用しう
る栄養物を含有する培地で培養する。

栄養源としては、グルコース、水あめ、デキストリン、
シェークロース、Ａｎ、ｍｅ、ａ・植物油等を使用でき
る。また窒素源として、大豆粉、小麦はい芽、コーンス
テイープ・リカー。

綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモ
ニラ−，硝酸ソーダ、尿素等を使用できる。その他、必
要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネ
シウム、コバルト。

塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオンを生成することの
できる無機塩類を添加することは有効である。また菌の
生育を助け、抗生物質パーミスポリンの生産を促進する
ような有機及び無機物を適当に添加することができる。

培養法としては、好気的条件での培養法、特に深部培養
法が最も適している。培養に適当な温度はコ０−．７０
Ｃであるが、多くの場合。

２６〜３０℃付近で培養する。バーミスボリンの生産は
培地や培養条件により異なるが、振とう培養、タンク培
養とも通常３〜７０日の間でその蓄積が最適に達する。

培養物中のバーミスボリンの警積僅が最扁になった時に
培養を停止し、培養液から目的物ＩＸを単離精製する。

本発明のバーミスボリンは、脂靜性物質であるので、培
養物からバーミスボリンの単離、精製にあたっては、そ
の特性を利用して行なうことができる。すなわち、アン
バーライトＸＡＤ−コ（ローム・アンド・ハース社製）
、ダイヤイオンＨＦ−２０（三菱化成社製）等の合成吸
着剤、セファデックスＬＭ−二〇（ファルマシア社製）
、トヨバールａＷ−ダＯ（東洋曹達社製）等のゲルテ過
剤、酢酸エチル、クロロホルム等による溶媒抽出法；シ
リカゲル、アルミナ等によるカラムクロマトグラフィー
；さらにシリカゲルを担体とした分取薄層クロマトグラ
フィー等が有効である。

以上のような方法により、あるいはこれらを適宜組合わ
せることにより、前述の理化学的性質？有する高純度の
バーミスボリンが得られる。

尚、各精製工程におけるバーミスボリンの検定にあたっ
ては、検定菌として、バクテロイデス・フラジリス（Ｂ
ａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ　）二ニア１
を用い、ベーパーディスク法によって行なう。ペーパー
ディスク法による寒天培地上の生育阻止円径はコＱ〜７
００　ｐＰ／−において。

濃度の対数と直巌関係を示し、／ｊ〜コ３嬬の阻止円を
与える。

〔発明の効果〕

本発明の新規抗生物質バーミスボリンは、良好な抗菌活
性、特に、グラム陽性細菌ならびに嫌気性細菌に対して
良好な抗菌活性４１−［しており、抗菌剤としての有用
性が期待される。

〔実施例〕

以下に不発！５＃施例によってさらに詳細に説明するが
１本発明はその要旨を超えない限り。

以下の冥施例によって限定されるものではない。

実施例７ （培養） 水あめコ、０裂、大豆油０．Ｊ％、大豆粉１．コチ。

ｌ」１友はい芽へ−％、　Ｎａ、Ｓｏ、　０．０コ％、
　Ｆｅ５０．−りＨ，Ｏθ、ｏ　　ｏ　　ｏ　　ｓ　　
蒼、　ＣＯＣｌ！弓ｇ２ｏ　　ｏ、ｏ　　ｏ　　ｏ　　
ｓ　　チ。

及びＣａＣＯ３０，１％を含有する培地（ｐＨ６，（７
）をψＯ−ずつ２００−三角フラスコ２０本に分注し、
１２１℃において２０分間高圧滅菌する。

これにバーミスボリン生産株、オフイオボルス・バーミ
スボリンス（０ｐｈｉｏｂｏｌｕｓ　ｖｅｒｍｉｓｐ−
ｏｒｕｓ　）　　Ｌ　−Ｅ　ａｆ　／白金耳ずつ植菌し
、コロ℃においてダ日間、λｌθ回転にて損と９培養す
る。別に上記と同一組成から成る培地を調製し、そのざ
θづを３ｒ００ｍｌ三角フラスコ１０θ本に分注し、／
２／Ｃにおいて１０分間高圧滅菌する。この主発酵培地
に前記種培養液をダーずつ接種しコロＣにおいてＳ日間
、ユｉｏ回転にて振とう培養する。得られた培養物を遠
心分離して、培養上清液と培養菌体を得た。

実施例コ 実施例１で得られた培養上清液ａ、’ｙｌと、菌体を７
０５％アセトン水八！ｔへ室幅／時間抽出し、Ｆ３過し
て菌体を除いた菌体抽出液を濃縮して得られた菌体抽出
液０．．１１とを合わせ、ｒｚとし、同量の酢酸エチル
にて抽出した。抽出液は、水洗後、無水硫酸ナトリウム
で脱水し、減圧下濃縮し、？、／コ？の油状物質を得九
。得られた油状物質を珪そう±７．Ｓ？にまぶし、−夜
減圧下乾燥後、クロロホルムで充填したシリカゲルＣ−
コＯｏ（和光紬薬工業社製）３ｏｏ−の塔の上にのせ、
クロロホルムで洗＃後、クロロホルム−メタノール混液
（１０θ：／）、次イでクロロホルム−メタノール混液
（ｓｏ：ｉ）にて展開するクロマトグラフィーを行なっ
た。

活性画分を集め、減圧下濃縮乾固し、ハユ９？の油状物
質を得た。この油状物質は、再度、シリカゲルＣ−一〇
〇を用いたクロマトグラフィーに付シ、クロロホルムで
洗浄後、クロロホルム−メタノール混液（１０θ二））
にて展開し、活性画分を得た。得られた活性画分を減圧
下濃縮乾固し、ｑ０９ｍ９の油状物質を得た。この油状
物質を少量のメタノールに溶解し、メタノールにて充填
したセファデックスＬＨ−ｕθ（ファルマシア社製）ｉ
ｔＯ塔にのせ、メタノールにて展開しな。ｌコーフラク
ションでフラクション＆Ｊｌニー４弘に有効物質が浴出
した。この活性フラクションを集め、減圧下濃縮乾固す
ると１Ｉｔｒｉ〜の油状物質が得られ九。このうち。

ココｏＩｎ９をシリカゲルプレート（メルク社製）を用
い水分取簿層クロマトグラフィー（展開溶媒；クロロホ
ルム：メタノール薯３０：））ニ付し、活性画分をメタ
ノールで抽出後、減圧下メタノールを除去し、６６■の
油状物質を得念。

この油状物質を少量のメタノールに溶解し、メタノール
にて充填したセファデックスＬＨ−コ０３００−の塔に
のせ、メタノールにて展開し念。

５．５−フラクションでフラクション＆３１Ａ−３６に
有効物質が溶出し九。この活性フラクションを集め、減
圧下濃縮乾固し。３７ηの粗バーミスボリンを油状物質
として得た。この粗バーミスボリンｆ１０艷のクロロホ
ルムに溶解し、同量の　ｐＨコの酸性水で洗浄、さらに
水洗、無水硫酸す）　ＩＪウムで脱水後、減圧下濃縮乾
固すると、絹製されたバーミスボリン２１ｍ９が無色油
状物質として得られた。本物質の理化学的性質は前記の
通９である。

尚、各精製工程において活性画分は、前述のバクテロイ
デス・フラジリス、２コア１を検定菌として用いたペー
パーディスク法によって辿１定した。

また、得られたｉ製バーミスボリンを常法に従いマウス
の腹腔内に投与して測定した急性毒性（ＬＤ５Ｑ）は、
　ｉ　ｏ　ｏ　ｍ９／ｋｔｉ以上であった。

試訣例１ 日本化学療法学会標準法に従い、第７表に示した被験菌
ＩＯ’ＯＦＵ／−を含んだＧＡＭ寒天寒天型培養後生育
阻止円径を測定し、各被験菌に対する本発明のバーミス
ボリンの最小発育阻止濃度を求めた。その結果を第１表
に示した。

試験例コ 試験例１と同量の第−表に示した被験菌を含んだＧＡＭ
寒天培地を用い、ＪｔＣでダｇ時間嫌気培養した後生育
阻止円径を測定し、各被験菌に対する本発明のバーミス
ボリンの最小発育阻止濃度を求めた。その結果を第２表
に示し念。

【図面の簡単な説明】

第７図は、バーミスボリンのメタノール溶液中濃度２Ｑ
μｍ／−での紫外部吸収スペクトル図である。 第一図は、バーミスボリンのクロロホルム溶溶中での光
外部吸収スペクトル図である。 第３図は、バーミスボリンの重クロロホルム溶液中での
水素核核磁気共鳴スペクトル図である。 第一図は、バーミスボリンの重クロロホルム溶液中での
炭素核核磁気共鳴スペクトル図である。 出願人　　三菱化成工業株式会社 ほか７名 代理人　　弁理士　長谷用　　− ほか１名 第　１　図 ン支　長（４ｍ）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有する新規抗生物質バーミ
   スボリン。 （イ）元素分析値： 炭素　７０．１８％ 水素　８．７３％ 窒素　３．１０％ （ロ）分子量： ４１５（ＨＲ−ＭＳ，ｍ／Ｚ４１５．２７１９，Ｍ＾＋
   ）（ハ）分子式： Ｃ＿２５Ｈ＿３７ＮＯ＿４ （ニ）比旋光度： 〔α＾２＾０＿Ｄ＋７３．８°（Ｃ１．０，クロロホル
   ム）（ホ）紫外部吸収スペクトル： メタノール溶液中で測定したスペクトル は第１図に示す通りである。 λ＾Ｍ＾ｅ＾Ｏ＾Ｈ＿ｍ＿ａ＿ｘ２２９ｎｍ（ε６１８
   ０）、２９ｎｍ（ε１２２８０） （ヘ）赤外部吸収スペクトル： クロロホルム溶液中で測定したスペクト ルは第２図に示す通りである。 （ト）水素核核磁気共鳴スペクトル： 重クロロホルム溶液中で測定した４００ ＭＨｚ水素核核磁気共鳴スペクトルは第３図に示す通り
   である。 （チ）炭素核核磁気共鳴スペクトル： 重クロロホルム溶液中で測定した１００ ＭＨｚ炭素核核磁気共鳴スペクトルは第４図に示す通り
   である。 （リ）溶解性： クロロホルム、ジエチルエーテル、アセ トン、酢酸エチル、メタノール及びエタノ ールに可溶。ｎ−ヘキサン及び水に不溶。 （ヌ）呈色反応： １０％硫酸及びモリブデン酸試薬に陽性。 グレイグ・リーバツク試薬及びニンヒドリ ン試薬に陰性。 （ル）薄層クロマトグラフィー： メルク社製シリカゲル薄層（Ａｒｔ５７１４）を使用し
   、展開溶媒がクロロホルム−メタ ノール（３０：１）の場合Ｒｆ値が０．６３、同薄層を
   使用し、展開溶媒がトルエン−アセトン （２：１）の場合Ｒｆ値が０．５２。 （ヲ）外観：無色油状
2. （２）オフイオボルス属に属する、抗生物質バーミスボ
   リン生産菌を培養し、その培養物からバーミスボリンを
   採取することを特徴とする新規抗生物質バーミスボリン
   の製造法。