JPH0474163A - 新規生理活性物質ｍｂｐ０４９―１３及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、プロリン水酸化酵素の阻害活性を有する新規
な生理活性物質ＭＢＰＯ４９−１３及びその製造法に関
する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする問題点］肝硬
変、肺線維化症などの臓器線維化症はコラーゲンの異常
増加に起因する疾患とされているが、その線維化抑制剤
の一つとしてコラーゲンの生合成に関与している酵素の
一つであるプロリン水酸化酵素の阻害剤が考えられる。

すなわち、蛋白質結合したプロリンがプロリン水酸化酵
素により水酸化される過程の間に、コラーゲン特異性水
酸化反応の選択的阻害を引き起こす。阻害剤によりプロ
リンの水酸化を抑制すると低水酸化コラーゲン分子が得
られるが、これは機能性を有さす、紺胞かられずかの量
のみしか細胞外間隙に放出され得ない。更に低水酸化コ
ラーゲンはコラーゲンマトリックス中に導入され得す、
しかも非常に容易に蛋白質加水分解による分解が進行す
る。これらの効果により、結果的に細胞外で析出される
コラーゲンの量が全体として減少することになる。従っ
て、プロリン水酸化酵素の阻害剤はコラーゲンの析出が
病像に重大な影響を与えるような疾患の治療に対して有
効な手段となる。

従来、プロリン水酸化酵素の阻害剤としてピリジン−２
，４−ジカルボン酸誘導体及びピリジン−２，５−ジカ
ルボン酸誘導体（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　１
３８，２３９−２４５．１９８４　：特開昭６１−６０
６５５号、同６３−２１６８７０号、同６３−２１６８
７１号、同６３−２１６８７３号、同６３−２３８０５
９号各公報）や、各種のペプチド類（特公昭５２−２９
７４０号、同５３　＋　２７２７３号、特開平２−４２
０９８号各公報）が知られているが、更に新しいタイプ
の薬剤の出現が望まれていた。

Ｅ問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、微生物が抗生物質等の種々の生理活性物
質を生産することに着目し、自然界より多数の試料を採
取してそれから分離された多種類の微生物の培養物につ
いて検討を重ねた結果、オフィオボルス（０ｐｈｉｏｂ
ｏｌｕｓ　）属に属するある種の菌株の培養物中に、プ
ロリン尿酸化酵素阻害作用を有する物質が生産されるこ
とを見出し、その構造を明らかにして、本発明を完成す
るに至った。

すなわち本発明の要旨は、下記式（Ｉ）で示される生理
活性物質ＭＢＰＯ４９−１３及びその製造法に存する。

以下、本発明につき詳細に説明する。

本発明の新規生理活性物質ＭＢＰＯ４９−１３は、例え
ばオフィオボルス属に属する新規生理活性物質ＭＢＰＯ
４９−１３生産菌を培養し、その培養物から新規生理活
性物質ＭＢＰＯ４９−１３を単離することによって得る
ことができる。

生理活性物質ＭＢＰＯ４９−１３の生産菌は、オフイオ
ボルス属に属する微生物であって、その培養液中に採取
するに十分な量の生理活性物質ＭＢＰＯ４９＋１３を生
産する能力を有するものであればいかなるものであって
もよい。このような菌株の例としては、本発明者らによ
り草木性植物体より新たに分離された小房子嚢菌に属す
るオフイオポルス・ルベルス（Ｏｈｉｏｂｏｌｕｓ　ｒ
ｕｂｅｌｌｕｓ　）　ＭＣＩ　２５５２菌株（以下、ｒ
　ＭＣＩ　２５５２菌株］と略す）がある。ＭＣＩ　２
５５２菌株の微生物学的性質は下記の通りである。

■　形態学的特徴 子嚢果：宿主植物上に散在する、車止、はじめ植物表皮
下に埋没して生じる、のちに表皮を破り頚部を突出する
。洋ナシ形、直径１８０〜３５０ｐｍ、高さ２６３〜４
００μｍ 頚部：直径６０〜１２０ｐｍ、長さ１６０〜２２２１１
ｍ、頚部孔口内面にはべりフィラス（Ｐｅｒｉｐｈｙｓ
ｉｓ　）を欠く。

殻壁：厚さ１３〜２９１１ｍ、　３〜５層の細胞より成
る。

外層細胞：亜球形、厚膜、褐色を呈する、内側では薄膜
、無色。

子嚢：細長い円筒形、１７０〜２５０ｐｍ　Ｘ４．８〜
５．６１１ｍ。

二重壁構造、８胞子性、偽側糸を有す。

子嚢胞子二子嚢の中に平行に配列するか、または束状に
密着してラセン状に曲がる、細長い円筒形、１８０〜２
６０ｐｍ　Ｘ　１〜１．６ｐｍ、１３〜２５個の隔壁を
有する、各細胞は顕著な膨大細胞を欠く、また狭窄した
細胞も欠く、淡黄褐色を呈する。

■　各種培地上における培養上の特徴 （イ）ジャガイモ・デギストロース寒天培地（ＰＤＡ）
上２７°Ｃ１１４日間の培養 コロ−１−−：１４日間で直径８ｃｍに拡がる。ビロー
ド状、表面はうす茶色〜灰味黄茶色、裏面は茶色を呈す
る。

基底菌糸：放射状に伸長し、分枝する、幅０．６〜３．
５ｐｍ、隔壁を有する、無色〜褐色を呈する。

気生菌糸を豊富に形成する。

ＰＤＡ上では完全世代及び不完全世代の生殖器官の形成
は言忍められない。

（ロ）麦芽寒天培地（ＭＡ）上、２７℃、１４日間の培
養コｏ＝−：１４日間で直径６ｃｍに至る。ビロード状
、表面は灰味黄茶色〜黄褐色、裏面は茶色を呈する。

基底菌糸二放射状に伸長し、分枝する、幅１．６〜３．
８ｐｍ、隔壁を有する、無色〜褐色を呈する。

菌糸先端部：楕円形の連鎖した厚膜胞子様細胞に変化す
る。

気生菌糸を豊富に形成する。

寒天培地上では完全世代及び不完全世代の生殖器官の形
成は認められない。

■　生理的性質 （イ）最適生育条件 最適ｐＨ： ４〜６（ＬＣＡ液体液体中地中７°Ｃ１１４日間培養）
最適温度： ２７〜３０″Ｃ（ＰＤＡ寒天寒天上地上４日間培養）（
ロ）生育の範囲 ｐＨ： ３〜９（ＬＣＡ液体液体中地中７℃、１４日間培養）温
度： １５℃〜３０°Ｃ（ＰＤＡ寒天寒天上地上４日間培養）
■　分類学的考察 （イ）高次の分類学上の位置 ＭＣＩ　２５５２菌株は １）双子葉植物体上に着生して生じ、洋ナシ型の子嚢果
を形成する。

２）永続性の偽側糸を有する。

３）子嚢は二重壁構造を持つ。

４）子嚢胞子は多隔壁である。

等の特徴を持つことから、Ｌ、　Ｈｏ１ｍ、　Ｓｙｍｂ
、Ｂｏｔａｎ。

Ｕｐｓａｌ、、　　１４　（３）、　　１−１８８（１
９５７）　；　ＬｕｔｔｒｅｌＪＬｏｃｕｌｏａｓｃｏ
ｍｙｃｅｔｅｓ、　Ｔｈｅ　Ｆｕｎｇｉ、　Ｖｏｌ、４
Ａ　（ｅｄ。

Ｇ、Ｃ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ、）、　１３
５−２１９　（１９７３）　；　Ｊ、Ａ、　ｖｏｎＡｒ
ｘ　＆　Ｅ、　ＭＱｌｌｅｒ、　５ｔｕｄ、　Ｍｙｃｏ
ｌ、　９．１〜１５９　（１９７５）等によって分類さ
れている小房子嚢画調（ロキュロアスコミセイテス、Ｌ
ｏｃｕｌｏａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ　）、ブレオスポラ
目（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ　）、ブレオスポラ科（
Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅ　）に帰属される。

（ロ）属レベルの同定 Ｊ、Ａ、ｖｏｎ　Ａｒｘ　＆　Ｅ、ＭＱｌｌｅｒ、　５
ｔｕｄ、Ｍｙｃｏｌ、９．１−１５９（１９７５）のブ
レオスポラ科に関する分類体系によれば、木材には７７
属が含まれている。７７属中細長い円筒形〜糸状の子嚢
胞子を持つ属菌としてオフィオボルス（Ｏｐｈｉｏｂｏ
ｌｕｓ）属とコキリオボルス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕ
ｓ）属がある。

ＭＣＩ　２５５２菌株は １）子嚢果外面に剛毛を欠く。

２）頚部孔口内面に剛毛を欠く。

３）子嚢胞子は細長い円筒形。

４）各種培地上で分生子世代を形成しない。

等の特徴を有し、コキリオホルス属とは明確に区別され
た。よってＭＣＩ　２５５２菌株はオフイオボルス属菌
と同定された。

（ハ）種しヘルの同定 ＭＣＩ　２５５２菌株は子嚢胞子は細長い円筒形、１８
０〜２６０μｍＸ１〜１．６ｐｍ、褐色を呈する、１３
〜２５個の隔壁を有す、膨大細胞を欠く、各細胞は永続
的に分節することはない、両極にゼラチン様の付属体を
有せず、の特徴を有する。これらの特徴についてＲ，Ａ
、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｂｏｔ、、
　５４．２３６５−２４０４（１９７６）の検索表に従
って種の検索を行ったところ、本菌株はｑ典可ｍｌ至ｒ
ｕｂｅｌｌｕｓの性質に一致した。

従ってＭＣＩ　２５５２菌株はｑ典丞ｍｌ亜ｒｕｂｅ１
１ｕｓと同定された。特に近縁の種である店垣コニ妙±
亜から子嚢胞子の幅の違いにより明確に区別された。

ＭＣＩ　２５５２菌株は工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第１１５７５号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１５
７５）として寄託されている。

一般に、オフィオボルス属菌は、他の菌類の場合にみら
れるようにその性状が変化しやすい。

たとえば、ＭＣＩ　２５５２菌株の、またはこの株に由
来する突然変位株（自然発生または誘発性）の形質接合
体または遺伝子組換え体であっても、新規生理活性物質
ＭＢＰ　０４９　＋　１３の生産能を有するものはすべ
て本発明の方法に使用することができる。

本発明においては、前記の菌を通常の微生物が利用し得
る栄養物を含有する培地で培養する。栄養源としては、
グルコース、水あめ、デキストリン、シュークロース、
澱粉、糖蜜、動・植物油等を使用できる。また窒素源と
して、大豆粉、小麦胚芽、コーンステイープ・リカー、
綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモ
ニウム、硝酸ソーダ、尿素等を使用できる。その他、必
要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネ
シウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオ
ンを生成することができる無機塩類を添加することは有
効である。また菌の生育を助け、生理活性物質ＭＢＰ　
０４９−１３の生産を促進しようとするような有機物及
び無機物を適当に添加することができる。

培養法としては、好気的条件での培養法が適している。

培養に適当な温度は２０〜３０°Ｃであるが、多くの場
合、２６〜３０℃付近で培養する。ＭＢＰ　０４９−１
３の生産は、培地や培養条件により異なるが、通常３〜
１０日の間でその蓄積が最適に達する。培養物中のＭＢ
Ｐ　０４９−１３の蓄積量が最大となったときに培養を
停止し、培養液から、目的物質を単離する。本発明のＭ
ＢＰ　０４９　＋　１３は、脂容性物質であるので培養
物からＭＢＰ　０４９　＋　１３を単離精製するにあた
っては、その特性を利用して行うことができる。すなわ
ち、酢酸エチル、クロロホルム等による溶媒抽出法；シ
リカゲル、アルミナ等によるカラムクロマトグラフィー
；ダイヤイオンＨＰ　＋　２０　（三菱化成社製）等の
合成吸着剤；セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア
社製）等のゲル濾過剤；さらにシリカゲル等を坦体とし
だ分取薄層クロマトグラフィー等が有効である。

本発明者らは、生理活性物質ＭＢＰ　０４９−１３を、
上此のような手段・方法を用いて単離精製し、その物理
化学的性状を調べ、また別途研究の結果ＭＢＰ０４９−
１３が前記（Ｉ）式の構造式で示される化合物であるこ
と、かつ本化合物が新規化合物であることを明らかにし
た。

このようにしてＭＢＰ　０４９−１３を製造することが
できるが、その物理的性状は、次の通りである。

１）外観：無色油状 ２）分子量：　３９９　（ＥＩ　＋　ＭＳ　Ｍ＋）３）
旋光度：［α］　＝　＋　５８．９°（ｃｍ１．０７）
４）紫外部吸収スペクトル： メタノール溶液中及び塩酸酸性メタノール溶液中で測定
した紫外部吸収の吸収極大波長は以下に示すとおりであ
る。

メタノール溶液中 八ＭＡＸ：　　２４８ｎｍ（ｅ　＝５０２３）２９２ｎ
ｍ　（ｅ　＝　８０６９　） 酸性メタノール溶液中 λＭＡＸ　：　　２２４ｎｍ　（ｅ　＝　８４０５　）
２９１ｎｍ（ε＝６０２８） ５）赤外部吸収スペクトル： ＫＢｒ法で測定した赤外部吸収スペクトルの主な吸収極
太の波数は以下に示すとおりである。

ｖ　（ｃｍ−１）：３４６０．２９５０．１６５０．１
６１５．１４９０．１３８５．１３４０．１２２５．１
０４５６）水素核核磁気共鳴スペクトル： 重クロロホルム溶液中で測定した２５０ＭＨｚ水素核核
磁気共鳴スペクトルは以下に示すとおりである。

δ、ｐｍ：０．８２（３Ｈ，ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ）；０．８
６（３Ｈ，ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ）　；１．０５　（３Ｈ，ｄ
、Ｊ＝７Ｈｚ　）；　１．２　（４Ｈ，ｍ　）；　１．
４　（９Ｈ，ｍ　）　；　１．６（２Ｈ，ｍ　）；　１
．７４　（ＬＨ，ｍ　）；　１．９６　（ＩＨ，ｍ　）
；２．２　（２Ｈ，ｍ　）；２．９３　（３Ｈ，ｓ　）
　２．９４　（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝１１Ｈｚ　）　；　３
．４８　（ＩＨ，ｄ。

Ｊ　＝３Ｈｚ　）；４．０１　（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ＝　
ＬＬ　１１Ｈｚ）　；５．１１　（ＬＨ，ｍ　）７）炭
素核核磁気共鳴スペクトル： 重クロロホルム中で測定した６２．５　ＭＨｚ炭素核核
磁気共鳴スペクトルは以下に示すとおりである。

δ、、ｍ＋１１．７８（ｑ）；１３．２５（ｑ）；１７
．１２（ｑ）；１７．２７（ｑ）；２０．５４（ｑ）；
２１．０８（ｑ）；２６．８０（ｔ）；２７．１５（ｑ
）；２８　（ｄ）；２９．２９　（ｔ　）　；　３７．
２０　（ｄ　）　；　３８．１３　（ｄ　）　；　３９
．９０　（ｄ　）４１．８５　（ｄ　）　；　５５．６
９　（ｄ　）；７０．９９　（ｄ　）；　１０３．８４
　（ｓ　）；１２２．３２（ｄ　）；　１２８．９０　
（ｄ　）；　１３２．６６　（ｓ　）；　１３４．５６
　（ｓ　）；１７３．５７　（ｓ　）；１９０．８１（
ｓ　）　；　１９３．７４　（ｓ　）［実施例］ 以下に本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが
、本発明はその要旨をこえない限り以下の実施例によっ
て限定されるものではない。

（実施例１） 水あめ２％、大豆油０．３％、大豆粉１．２％、小麦胚
芽１．２％、硫酸ナトリウム０．０２％、塩化第二鉄０
．０００５％、塩化コバルト０．０００５％、炭酸カル
シウム０．１％、を含有する培地（ｐＨ６，０＞を２０
０ｍ１の三角フラスコに４０ｍ１入れ、１２１℃におい
て２０分間高圧滅菌する。

これに、ＭＢＰ　０４９　＋　１３生産株、オフィオボ
ルス・ルベルス（店典尉ｍｌ亜ｒｕｂｅｌｌｕｓ　）Ｍ
ＣＩ　２５５２菌株を１白金耳植菌し、２６℃において
３日間、２１０回転にて振どう培養する。別に上記と同
一組成からなる培地を調製し、その８０ｍ１を５００ｍ
１三角フラスコ４本に分注し、１２１°Ｃにおいて２０
分間高圧滅菌する。

この主醗酵培地に前記種培養液を４ｍｌずつ接種し２６
°′Ｃにおいて９日間、２１０回転にて培養する。得ら
れた培養物を遠心法により、培養上清液と培養菌体に分
離した。

ここでえられた培養菌体に１６０ｍ１のアセトンを加え
抽出し、遠心分離を行い菌体をのぞいた菌体抽出液を濃
縮し８０ｍ１とした。これにＩＮ塩酸を加えｐＨ２に調
製し等量の酢酸エチルにて抽出した。抽出物を減圧上濃
縮し、０．３６ｇのン岨吠物質を得た。得られた油状抽
出物をシリカゲル１００（メルク社製）１ｇにまぶし、
減圧乾燥後ヘキサンで充填したシリカゲル１００３４ｍ
１のカラムにのせ、ヘキサンで洗浄後ヘキサン−アセト
ン混液（９：１）にて展開するクロマトグラフィーを行
った。活性画分を集め減圧下濃縮乾固し、６４ｍｇの油
状物質を得た。この油状物質を、シリカゲル６０プレー
ト（メルク社製）を用いたクロロホルムを展開溶媒とす
る分取薄層クロマトグラフィーに付し、活性画分を酢酸
エチルで抽出後減圧下酢酸エチルを除去し６２ｍｇの油
状物質を得た。次にこの油状物質をオクタデシルシリカ
ゲルを用いた逆層分配クロマＩ・グラフィーに付した。

少量のメタノールに溶解したこの？叱仄物貿を０．２％
トリフルオロ酢酸水溶液でオクタデシルシリカゲルＡＱ
１２０　（山村化学製）を８８ｍ１充填したカラムにの
せ、洗浄後０．２％トリフルオロ酢酸を加えたエタノー
ル−水混液（７：３）、次いで０．２％トリフルオロ酢
酸を加えたエタノール−水混液（８：２）にて展開する
クロマトグラフィーを行った。活性画分集め、減圧下濃
縮乾固すると、精製されたＭＢＰＯ４９−１３３８ｍｇ
が、無色油状物質として得られた。本物質の物理的性質
は、前記の通りである。

（試験例１） 次にＭＢＰＯ４９−１３によるプロリン水酸化酵素の活
性を阻害する作用を示す。

ＭＢＰＯ４９−１３によるプロリン水酸化酵素の阻害活
性測定はに、　１．　Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ等の方法［Ｅ
ｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　５２．９−１６　（１９
７５）　］に準じて鶏胚より調製した部分精製標品を使
用し、（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）１ｏ・９Ｈ２０を基
質として、Ｒ，Ｅ、Ｒｈｏａｄ等の方法［Ｍｅｔｈｏｄ
ｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ＸＶｆｆｌＢ、　３
０６　（１９７１月に準じて行った。すなわち反応液２
００μｌ中に、０．０５Ｍ　）リス塩酸緩衝液ｐｈ　７
．８、上記基質４０１１ｇ、硫酸第一鉄０．０５ｍＭ、
アスコルビン酸２ｍＭ、ジチオスレイトール０．１ｍＭ
、牛血清アルブミン０．４ｍｇ、１４Ｃでラベルした放
射性のα−ケトグルタル酸を含む０．１ｍＭα−ケトグ
ルタル酸、カタラーゼ５０μｇ、プロリン水酸化酵素０
．４ｍｌを含有させ、３７°Ｃで２０分間反応を行った
。ついで、反応液と等量の２５％トリクロロ酢酸で反応
を停止し、放出される二酸化炭素を捕集し放射能を測定
した。同様に基質を含まない反応液でも反応を行い基質
を含む場合の反応での放射能測定値から基質を含まない
反応での放射能測定値を引き、それをプロリン水酸化酵
素の活性の指標とし、その活性を５０％阻害するのに必
要な阻害物質の濃度を５０％阻害濃度とした。その結果
、ＭＢＰＯ４９＋　１３の５０％阻害濃度は１９ｐＭで
あった。

［発明の効果］ 本発明の新規生理活性物質ＭＢＰ　０４９−１３は低濃
度でプロリン水酸化酵素の阻害活性を有することから、
肝硬変、肺線維化症等の臓器線維化症に対する治療薬と
して期待される。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（ I ） で示される新規生理活性物質ＭＢＰ０４９−１３（２）
   オフィオボルス属に属する新規生理活性物質ＭＢＰ０４
   ９−１３生産菌を培養し、その培養物から新規生理活性
   物質ＭＢＰ０４９−１３を採取することを特徴とする新
   規生理活性物質ＭＢＰ０４９−１３の製造法。